6.分子病理学1.ppt
分子病理学常用研究方法分子病理学常用研究方法(一一)基因变异的诊断基因变异的诊断Southernblot,PCR,RT-PCR,Real-TimeRT-PCR,FISH分子遗传学异常检测方法分子遗传学异常检测方法检测基因的丢失和扩增检测基因的丢失和扩增比较基因组杂交比较基因组杂交ComparativeGenomicHybridization,CGH分子生物学技术与细胞遗传学方法相结合分子生物学技术与细胞遗传学方法相结合优点：优点：1.新鲜材料和福尔马林固定石蜡包埋材料均可新鲜材料和福尔马林固定石蜡包埋材料均可进行进行CGH研究研究2.被测样品只需数被测样品只需数m mg甚至不到甚至不到1m mg的的DNACGH的应用：的应用：1.为搜寻肿瘤的癌基因或抑癌基因确定范围为搜寻肿瘤的癌基因或抑癌基因确定范围肿瘤细胞染色体某一位置上肿瘤细胞染色体某一位置上DNA序列拷贝数增序列拷贝数增加，往往提示该位置可能包含已知或未知的癌基加，往往提示该位置可能包含已知或未知的癌基因有扩增因有扩增肿瘤细胞染色体某一位置上肿瘤细胞染色体某一位置上DNA序列拷贝数减序列拷贝数减少或缺失，提示该位置可能包含已知或未知的抑少或缺失，提示该位置可能包含已知或未知的抑癌基因丢失癌基因丢失CGH发现发现MYCN，MET与与胃癌相关胃癌相关2.区分良恶性病变，临床上估计预后区分良恶性病变，临床上估计预后3.4.16例前列腺癌例前列腺癌CGH显示染色体异常占显示染色体异常占81%5.5例良性前列腺增生全部阴性例良性前列腺增生全部阴性 67肝细胞癌肝细胞癌CGH显示显示:1q,8q,20q,17q4q,8p,13q,16q12例癌周肝硬化组织：阴性例癌周肝硬化组织：阴性53例淋巴结阴性乳腺癌：例淋巴结阴性乳腺癌：8q,11q13,17q,20q异常，预后差异常，预后差蛋白组学及生物芯片蛋白组学及生物芯片生物芯片（生物芯片（biochip)是指采用光导原位合成或微量点样等方法将大量是指采用光导原位合成或微量点样等方法将大量核酸片段（寡核苷酸、核酸片段（寡核苷酸、cDNA、基因组基因组DNA、RNA）或多肽分子甚至细胞等生物样品有序地固或多肽分子甚至细胞等生物样品有序地固定于支持物（玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼定于支持物（玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集的二维分子排列，龙膜等载体）的表面，组成密集的二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影过特定的仪器如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量改变。改变。生物芯片：生物芯片：基因芯片基因芯片蛋白质芯片蛋白质芯片细胞芯片细胞芯片组织芯片组织芯片基因芯片基因芯片(Affymetrix专利）专利）寡核苷酸芯片，寡核苷酸芯片，cDNA芯片，基因组芯片芯片，基因组芯片DNAmicroarray:阵密度很高的玻片基质或胶膜基质阵密度很高的玻片基质或胶膜基质的的DNA微阵列微阵列DNAmacroarray:阵密度较低的尼龙膜阵密度较低的尼龙膜DNA微阵列微阵列杂交组织化学杂交组织化学-概述概述一、概述和原理一、概述和原理杂交组织杂交组织/细胞化学细胞化学(Hybridohistochemistry)原位分子杂交原位分子杂交(Insituhybridization,ISH)运用核酸分子间硷基互补的性质结合免疫组织化运用核酸分子间硷基互补的性质结合免疫组织化学技术在组织切片学技术在组织切片(或细胞片或细胞片)上显示特异核酸上显示特异核酸(DNA或或RNA)序列的一种技术。序列的一种技术。杂交组织化学原理杂交组织化学原理标记探针杂交变性 标记探针 互补核酸顺序 DNA/cDNA DNA DNA/cDNA RNA RNA RNA核酸分子杂交种类：核酸分子杂交种类：固相杂交固相杂交(硝酸纤维素膜或尼龙膜硝酸纤维素膜或尼龙膜)Southern印迹转移印迹转移(DNA)Northern印迹转移印迹转移(RNA)液相杂交液相杂交原位杂交原位杂交原位杂交四要素：原位杂交四要素：适当的探针适当的探针良好的组织材料良好的组织材料可靠的试剂和方法可靠的试剂和方法相当的形态学基础相当的形态学基础二、探针的制备二、探针的制备1.探针的种类和制备探针的种类和制备DNA探针探针：应用多，操作容易：应用多，操作容易比较敏感，背景高比较敏感，背景高(自身网络自身网络)双链双链DNA探针用时要变性探针用时要变性整合整合转化转化扩增扩增DNA片段片段质粒质粒(或其他载体或其他载体)细菌细菌提取提取酶切酶切质粒质粒探针探针(PCR扩增扩增)线性质粒 提取质粒扩增 探针重组质粒 质粒酶切插入 转染 探针RNA探针探针：结合稳定，穿透性好：结合稳定，穿透性好无需变性，不存在退火问题无需变性，不存在退火问题未杂交探针可用未杂交探针可用RNase去除，背景好去除，背景好多采用体外转录法合成同时加以标记多采用体外转录法合成同时加以标记寡核苷酸探针寡核苷酸探针：合成快速，不用变性，对：合成快速，不用变性，对RNase不敏感不敏感30-150bp，组织通透性好组织通透性好未端标记，敏感度不够未端标记，敏感度不够多采用多采用DNA合成仪固相合成合成仪固相合成探针的选择探针的选择:特异性特异性多选择基因组的多选择基因组的5或或3端端20-50对碱基互补就已稳定对碱基互补就已稳定大大小小200-300对碱基互补可获强的复合体对碱基互补可获强的复合体原位杂交多选择原位杂交多选择100-400bp(DNA-RNADNA-DNA2.探针的标记探针的标记标记物标记物：同位素：同位素,非同位素非同位素,修饰物修饰物同位素：同位素：敏感，定位较差，实验室要求高敏感，定位较差，实验室要求高探针使用周期短探针使用周期短32P放射过强放射过强,定位差定位差,半衰期短半衰期短(14.3天天)35S最常用最常用,定位好定位好,曝光时间短曝光时间短(数天数天),半衰期较长半衰期较长(84天天)125I与与35S相似，但半衰期较短相似，但半衰期较短(60天天)3H常用常用,放射能小放射能小,定位准确定位准确,曝光时间长曝光时间长(数周数周),半衰期长半衰期长非同位素：非同位素：定位较好，实验室要求低，可长期使用定位较好，实验室要求低，可长期使用生物素生物素：最早用，特点与免疫组化相似：最早用，特点与免疫组化相似地高辛地高辛：最常用，敏感性高，特异性好：最常用，敏感性高，特异性好荧光素荧光素：方法简便，敏感性低，多用于染色体检查：方法简便，敏感性低，多用于染色体检查修饰物修饰物(现少用现少用)：磺基化：磺基化(Sulphon基团基团)乙酰氨基芴乙酰氨基芴光敏生物素光敏生物素汞汞标记方法标记方法引入法：引入法：运用标记好的核苷酸合成探针运用标记好的核苷酸合成探针缺口翻译法缺口翻译法随机引物法随机引物法末端标记法末端标记法PCR扩增标记法扩增标记法RNA体外合成法体外合成法化学修饰法：化学修饰法：化学修饰已合成的探针化学修饰已合成的探针缺口翻译缺口翻译/平移法：平移法：双链双链DNA标记，线环状均可标记，线环状均可分子较大分子较大(1KB)者效果好者效果好DNA用量较多用量较多(200ng)标记率低标记率低原理：原理：DNA酶酶(DNaseI)在双链在双链DNA分子中导入缺口分子中导入缺口DNA聚合酶聚合酶(DNApolI，具有具有53外切酶和外切酶和53聚合酶活性聚合酶活性)，使各种核苷酸，使各种核苷酸，包括包括标记核苷酸自缺口处合成与对应链互补的标记核苷酸自缺口处合成与对应链互补的DNA链链(探针探针)变性后标记探针分子小，穿透性好变性后标记探针分子小，穿透性好缺口翻译/平移法随机引物法：随机引物法：单单/双链线状双链线状DNA标记，标记，100-500bp亦可亦可DNA用量少用量少(可少至可少至10ng)标记率高标记率高(1/20-25)原理：以任意顺序的六核苷酸片段为引物与单链原理：以任意顺序的六核苷酸片段为引物与单链DNA模板结合后，在模板结合后，在DNA聚合酶聚合酶I的的Klenow片段片段(无无5-3外切酶活性外切酶活性)作用下合成带标记核苷酸作用下合成带标记核苷酸的互补的互补DNA链链(探针探针)随机引物法1.于于Eppendorf离心管中依次加入离心管中依次加入15lddH2O1gDNA(10ng-3g)10010(变性变性)干冰聚冷干冰聚冷30秒钟秒钟2.加入加入10六核苷酸混合物六核苷酸混合物2l10dTNP标记混合液标记混合液2l含含1mMdATP，1mMdCTP，1mMdGTP，0.65mMdTTP，0.35mMDIG-dUTPKlenow酶酶(2U/l)1l3.混合后混合后37保温保温1-2h(可达可达20h)4.加入加入2lpH8.0200mMEDTA终止反应终止反应5.加入加入2l糖原糖原(10mg/ml)6.加加2.5l4MLiCl或或3MNaAc(pH5.5)7.加加75l无水乙醇无水乙醇(-20预冷预冷)8.混合后混合后-70309.13000g4离心离心15，弃上清，弃上清10.加加100l70%乙醇乙醇(预冷预冷)洗，离心弃上清洗，离心弃上清11.真空干燥，加真空干燥，加50lTE(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)溶解，溶解，-20保存保存末端标记法：末端标记法：用于短链用于短链DNA或寡核苷酸探针标记或寡核苷酸探针标记敏感性较低敏感性较低40个以上碱基检测较稳定个以上碱基检测较稳定又分又分3端标记法和端标记法和5端标记法端标记法3端标记法：端标记法：原理：原理：DIG-11-ddUTP在末端脱氧核苷酸转移酶作用在末端脱氧核苷酸转移酶作用下与寡核苷酸的下与寡核苷酸的3端相连端相连5端标记法：端标记法：原理原理:在碱性磷酸酶的作用下把在碱性磷酸酶的作用下把5端磷酸脱去端磷酸脱去,T4噬菌体多核噬菌体多核苷酸激酶将苷酸激酶将-32PATP的的-32P转移到转移到5端端PCR扩增标记法：扩增标记法：用于用于cDNA的合成和标记，方法简单的合成和标记，方法简单DNA用量少，产量多用量少，产量多原理：原理：TaqDNA多聚酶以多聚酶以DNA为模板，在引物引导下为模板，在引物引导下合成带有标记核苷酸的合成带有标记核苷酸的cDNA探针。探针。PCR扩增标记法1.于于Eppendorf离心管中加入离心管中加入10PCR缓冲液缓冲液5l(1)MgCl2210l(15mM)引物引物适量适量(0.11M)标记标记/非标记非标记dNTP5l(200M，dTTP:Dig-dUTP=3:1)ddH2O加到加到50l模板模板DNA1100ngTagDNA多聚酶多聚酶0.21l(15units)反应组反应组对照组对照组1对照组对照组2DNA模板模板+-Dig-dUTP+-2混合后混合后PCR仪扩增仪扩增循环循环温度温度时间时间194C594C45231550.2C4572C903272C5334CHold3.纯化和鉴定纯化和鉴定乙醇沉淀法：乙醇沉淀法：100lPCR产物加产物加10l4MLiCl和300l预冷的预冷的100%乙醇乙醇，-20C，2小时，离心小时，离心4C13000g，5分钟分钟Agarose凝胶电泳凝胶电泳RNA体外合成体外合成/标记法：标记法：用以合成并同时标记用以合成并同时标记RNA探针探针产量高，产量高，NTP浓度要求低，浓度要求低，不用纯化不用纯化原理：将模板原理：将模板DNA(双链双链)插入带有噬菌体插入带有噬菌体RNApol启动子的特定质粒，在体外启动子的特定质粒，在体外RNApol作用下，作用下，以以DNA为模板、启动子为起点，为模板、启动子为起点，合成带有标合成带有标记核苷酸的记核苷酸的RNA探针。探针。杂交组织化学 RNA体外合成/标记法pGEM1.于于Eppendorf离心管中加入离心管中加入DNA模板模板(酶切成线性酶切成线性)1g含噬菌体启动子的质粒含噬菌体启动子的质粒NTP标记混合物标记混合物2l含含10mMATP，10mMCTP10mMGTP，6.5mMUTP3.5mMDIG-11-UTP10反应缓冲液反应缓冲液2lDEPC处理的处理的H2O加至加至17l2.混合后加：混合后加：RNase抑制剂抑制剂1lRNA多聚酶多聚酶(SP6/T7)2l3.柔和混合后柔和混合后37保温保温2h4.加入加入DNase2l，3715(去除模板去除模板DNA)5.加入加入2l200mMpH8.0EDTA6.加入加入2.5l4MLiCl和和75l预冷乙醇预冷乙醇7.混合后置混合后置-70，30或或-20过夜过夜8.413000g离心离心15，弃上清，弃上清9.加加100l70%乙醇乙醇(预冷预冷)洗，离心弃上清洗，离心弃上清10.真空干燥，加真空干燥，加100lDEPC-H2O溶解，溶解，-20保存保存化学修饰法：化学修饰法：常用的有光敏生物素、磺化常用的有光敏生物素、磺化可用以标记单可用以标记单/双双链链DNA或或RNA光敏生物素标记：光敏生物素光敏生物素标记：光敏生物素+核酸核酸标记探针标记探针磺化标记：亚硫酸氢钠和甲基羟胺使胞嘧啶的磺化标记：亚硫酸氢钠和甲基羟胺使胞嘧啶的C5磺化，磺化，生成生成Sulphon基团。基团。乙酰氨基芴乙酰氨基芴(AAF)标记：标记：N-acetoxy-AAF与探针一起孵育时，与探针一起孵育时，AAF基团与鸟嘌呤核苷残基共价结合基团与鸟嘌呤核苷残基共价结合3.标记探针的纯化标记探针的纯化目的：目的：去除无机盐、去除无机盐、dNTP、酶等酶等方法：方法：沉淀离心法沉淀离心法加入加入EDTA中止反应，再加中止反应，再加4MLiCl和乙醇冷冻离心，和乙醇冷冻离心，乙醇洗涤，干燥后用缓冲液溶解乙醇洗涤，干燥后用缓冲液溶解玻璃纤维滤过法玻璃纤维滤过法反应物与玻璃纤维结合，清洗，缓冲液洗脱反应物与玻璃纤维结合，清洗，缓冲液洗脱4.标记结果的检验标记结果的检验目的：目的：证实标记结果；估计探针得率；测试检测条件证实标记结果；估计探针得率；测试检测条件非同位素标记探针的检验：采用斑点印迹法非同位素标记探针的检验：采用斑点印迹法不同浓度不同浓度(10倍梯度稀释倍梯度稀释)的标记探针点尼龙膜的标记探针点尼龙膜常规检测系统显色常规检测系统显色未标记探针点膜后用标记探针杂交未标记探针点膜后用标记探针杂交不同浓度（不同浓度（10倍梯度稀释）的标记探针点尼龙膜倍梯度稀释）的标记探针点尼龙膜DNARNA探针：探针：0.01pg1ngul寡核苷酸探针：寡核苷酸探针：0.08FM50fM/ul紫外照光或加热紫外照光或加热12030固膜固膜缓冲液缓冲液1洗膜（洗膜（100mM马来酸，马来酸，150mMNaC1，pH7.5）缓冲液缓冲液2（1%阻断剂，缓冲液阻断剂，缓冲液1配）配）30抗抗DIG一碱性磷酸酶一碱性磷酸酶1：5000，孵育，孵育30缓冲液缓冲液1洗膜洗膜缓冲液缓冲液3浸浸2(100mMTris-HC1100mMNaC1，50mMMgC12，pH9.5）显色液（显色液（NBT：BCIP，9:7），），作用作用0.516h缓冲液缓冲液3洗膜洗膜三、组织处理和标本制作三、组织处理和标本制作目的：目的：保留好被测核酸保留好被测核酸维持形态结构维持形态结构方法：方法：新鲜取材、及时固定新鲜取材、及时固定适当的固定液：适当的固定液：4%多聚甲醛多聚甲醛(用用0.1MPB配制配制)用于：用于：冰冻或石蜡切片冰冻或石蜡切片细胞培养片、细胞涂片或切片细胞培养片、细胞涂片或切片DNA稳定性好，一般不需特殊处理稳定性好，一般不需特殊处理RNA酶酶的灭活的灭活(杂交前杂交前)：组织内的组织内的Rnase:固定剂灭活固定剂灭活玻璃器皿：玻璃器皿：180处理处理3h以上以上用用DEPC(二乙基焦碳酸盐二乙基焦碳酸盐)水处理水处理试剂：用试剂：用DEPC水配制和水配制和/或高压消毒或高压消毒带手套操作带手套操作RNase抑制剂抑制剂检测检测RNA时标本制备及玻片处理常规：时标本制备及玻片处理常规：切片处理：切片处理：切片插架切片插架热水稀释的中性洗涤剂浸泡热水稀释的中性洗涤剂浸泡30流水冲洗流水冲洗高压消毒高压消毒流水冲洗流水冲洗蒸馏水洗蒸馏水洗1803hAPES处理处理(2%APES/甲醇）室温甲醇）室温1，甲醇洗，甲醇洗DEPC水洗水洗阴干阴干标本处理：标本处理：4%多聚甲醛多聚甲醛(PB配配)4过夜过夜乙醇脱水乙醇脱水二甲苯透明二甲苯透明石蜡包埋石蜡包埋切片切片DEPC水：水：0.1DEPC，室温放置室温放置3h，高压消毒高压消毒四、原位分子杂交四、原位分子杂交要求：要求：提高敏感性提高敏感性降低非特异着色降低非特异着色方法：方法：去垢剂去垢剂(TritonX-100)：增强组织通透性增强组织通透性蛋白酶蛋白酶(蛋白酶蛋白酶K)消化：消化：增加通透性、去除杂蛋白增加通透性、去除杂蛋白稀酸：稀酸：杂蛋白变性、去内源性酶、暴露靶核酸杂蛋白变性、去内源性酶、暴露靶核酸乙酰化处理：乙酰化处理：中和阳离子，减少静电吸引中和阳离子，减少静电吸引适当的杂交条件：适当的杂交条件：温度、离子强度、温度、离子强度、pH探针的种类、大小、浓度探针的种类、大小、浓度杂交液：杂交液：葡聚糖：增加探针相对浓度葡聚糖：增加探针相对浓度鱼精鱼精DNA、tRNA的应用：封闭的应用：封闭充分洗涤充分洗涤1.杂交前处理杂交前处理石蜡切片常规石蜡切片常规脱蜡脱蜡，PB洗片，洗片，TritoX-100蛋白酶蛋白酶K消化消化，37，(115g/ml，15120)4%多聚甲醛多聚甲醛后固定后固定，室温，室温10PB洗片洗片122；0.2MHCl，室温室温10；PB洗片洗片1220.1M三乙醇胺三乙醇胺(DEPC-H2O配配)，室温，室温23三乙醇胺三乙醇胺/无水无水乙酸乙酸室温室温10PB洗片，室温洗片，室温2270%80%90%100%100%酒精脱水酒精脱水室温室温干燥干燥2.杂交杂交（预杂交）（预杂交）滴加杂交工作液，蜡膜盖片，湿盒内，滴加杂交工作液，蜡膜盖片，湿盒内，501620h(检测检测DNA时要求先变性时要求先变性(90100度度)，探针为双链探针为双链DNA也要变性也要变性)杂交液：杂交液：甲酰胺甲酰胺50%Tris-HClpH7.610mMDEPC-H2OEDTApH8.01mM加到加到50.0mlNaCl600mM-70保存保存Denharts液液1SDS0.25%50%Denharts液：液：聚蔗糖聚蔗糖(Ficoll400)10g聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮(PVP)10g牛血清白蛋白牛血清白蛋白(BSA)10gDEPC-H2O1000ml杂交工作液：杂交工作液：1ml杂交液杂交液加加tRNA(最终浓度最终浓度0.30.5mg/ml)加标记探针加标记探针(最终浓度最终浓度0.55g/ml)每张切片用每张切片用50l杂交条件的优化：杂交条件的优化：温度：温度：温度高反应快，温度太高破坏组织，一般温度高反应快，温度太高破坏组织，一般Tm-25G:C多者多者Tm高高(G:C50%Tm约为约为70)甲酰胺可降低杂交温度甲酰胺可降低杂交温度(1%下降下降0.350.65)探针：探针：长的杂交快长的杂交快(太长时穿透性差太长时穿透性差)复杂性高的杂交时间长复杂性高的杂交时间长浓度高杂交时间短浓度高杂交时间短离子强度和离子强度和pH：离子强度高杂交体稳定性好（离子强度高杂交体稳定性好（0.01-0.4M)两价阳离子可使两价阳离子可使DNA结合牢固，结合牢固，用用EDTA去除去除常用常用50%甲酰胺，甲酰胺，pH6.57.5，4565，杂交杂交1620h3.杂交后处理杂交后处理洗片：洗片：5SSC，501去膜；去膜；5SSC，5052SSC+50%甲酰胺，甲酰胺，5030TNE(Tris-HClpH7.6+NaCl+EDTA)，3710RnaseA(1mg/100mlTNE)，3730TNE，37102SSC，5015；0.2SSC，50152严格度：严格度：甲酰胺浓度甲酰胺浓度高高温度温度高高高严格度高严格度离子强度离子强度低低4.显色反应显色反应(大致同免疫组化大致同免疫组化)Buffer(0.1MTris-HClpH7.5含含0.15MNaCl)，室温室温11.5%阻断剂阻断剂(用用Buffer加热配制加热配制)，室温，室温45抗抗DIG-AP，373060，4过夜过夜Buffer，室温室温152Buffer浸片浸片(0.1MTris-HCl+0.1MNaCl+50mMMgCl2，pH9.5)，室温室温5，显色液显色液(NBT+BCIP+2mlBuffer)，避光室温，避光室温，30以上以上TE(10mMpH7.6Tris-HCl+1mMEDTA)中止反应中止反应H2O洗片洗片甘油明胶封片甘油明胶封片5.对照对照阴性组织片对照阴性组织片对照阳性组织片对照阳性组织片对照(包括分布包括分布)探针探针Northernblot检测检测探针正义链阴性对照探针正义链阴性对照不标记探针竞争抑制不标记探针竞争抑制不含探针的阴性对照不含探针的阴性对照(显色阶段对照显色阶段对照)DNase或或RNase消化后阴性对照消化后阴性对照(非核酸吸附非核酸吸附)核酸原位杂交与蛋白产物的免疫组化检测对照核酸原位杂交与蛋白产物的免疫组化检测对照其他阳性或阴性对照（载体对照）其他阳性或阴性对照（载体对照）四、杂交组化技术的进展四、杂交组化技术的进展1.双重及多重杂交双重及多重杂交组化技术（最好选择不同的检测系统）组化技术（最好选择不同的检测系统）2.与免疫组化结合与免疫组化结合应用双重检测应用双重检测(一般先作免疫组化一般先作免疫组化)同时检测核酸和蛋白产物同时检测核酸和蛋白产物3.电镜下的杂交组化电镜下的杂交组化方法与免疫电镜相似方法与免疫电镜相似多采用多采用PG或或PLP固定、包埋后法、胶体金标记固定、包埋后法、胶体金标记细胞则多用包埋前法细胞则多用包埋前法4.原位原位PCR技术技术将将PCR与杂交技术结合起来，以提高敏感性与杂交技术结合起来，以提高敏感性间接原位间接原位PCR：先扩增后杂交先扩增后杂交方便、敏感、特异性差方便、敏感、特异性差直接原位直接原位PCR：加入引物、标记核苷酸、加入引物、标记核苷酸、DNA聚合酶聚合酶等，直接以靶链为模板合成等，直接以靶链为模板合成DNA并检并检测出相对的测出相对的DNA杂合体杂合体5.原位反转录原位反转录PCR（也分直接和间接法）也分直接和间接法）在在PCR扩增前先进行反转录，扩增前先进行反转录，rTth酶的出现使其更为容易酶的出现使其更为容易五、杂交组化的应用五、杂交组化的应用1.病原体的检测病原体的检测病毒：病毒：HPV(16，18)宫颈癌宫颈癌EBV鼻咽癌鼻咽癌HBV肝癌、肝炎肝癌、肝炎肾炎肾炎(IgA肾病肾病)CMVAIDS病等病等原位PCR显示肝炎肝细胞内 HCV阳性2.肿瘤基因检测肿瘤基因检测癌基因的染色体定位癌基因的染色体定位癌基因癌基因mRNA检测检测癌基因活化癌基因活化宫颈癌癌细胞内p53的表达3.mRNA检测检测(敏感性较敏感性较Northernblot低，可精确到细胞水平低，可精确到细胞水平)原位杂交显原位杂交显示肾小球系示肾小球系膜细胞及肾膜细胞及肾小管上皮细小管上皮细胞胞TIMP-2阳性阳性荧光原位杂交荧光原位杂交-FluorescenceInSituHybridization原理原理采用荧光标记的DNA探针，利用探针与被检测样本DNA碱基对的互补性，在探针与样本的DNA杂交后，通过荧光显微镜检测荧光信号而得出结果，从而检测细胞，组织样本中的染色体异常。FISHFISHFISHFISH：“钓鱼钓鱼”技术技术 细胞周期的不同阶段细胞周期的不同阶段探针是一段探针是一段荧光标记的核酸荧光标记的核酸（DNA）片段，被用作寻找）片段，被用作寻找另一互补另一互补DNA(靶标）的指示。靶标）的指示。DNA靶标可能是一个特异性靶标可能是一个特异性条带、一个基因、一个染条带、一个基因、一个染色体片段或一个完整染色体色体片段或一个完整染色体探针（探针（probe)及靶标（及靶标（target)适用于间期适用于间期FISH的标本的标本石蜡切片石蜡切片分离细胞核分离细胞核肿瘤组织的印片肿瘤组织的印片细胞离心涂片细胞离心涂片血液或骨髓涂片血液或骨髓涂片细胞爬片或切片细胞爬片或切片FISHFISH探针的类型探针的类型 全染色体涂抹探针全染色体涂抹探针 （WCPWCP）染色体计数（着丝粒）探针（染色体计数（着丝粒）探针（CEPCEP）位点特异性探针（位点特异性探针（LSILSI）双色分离重排探针双色分离重排探针 双色双融合易位探针双色双融合易位探针 xyxx可检测样本包括可检测样本包括可检测样本包括可检测样本包括临床应用领域临床应用领域临床应用领域临床应用领域TERCTERCTERCTERC基因基因基因基因 HPVHPVhTERChTERC=宫颈癌？宫颈癌？宫颈癌？宫颈癌？子宫颈癌研究最新进展子宫颈癌研究最新进展中国医学论坛报中国医学论坛报/2008年年/12月月/4日日/第第B03版版IGCS2008会议报道会议报道hTERC扩增诊断宫颈癌及癌前病变扩增诊断宫颈癌及癌前病变目前宫颈癌筛查主要通过宫颈细胞学检查及人乳头状瘤病毒（目前宫颈癌筛查主要通过宫颈细胞学检查及人乳头状瘤病毒（HPVHPV）检测，）检测，但这些方法的临床应用均有一定局限性。今年的研究致力于寻找新的指标来协助但这些方法的临床应用均有一定局限性。今年的研究致力于寻找新的指标来协助诊断宫颈癌前病变，尤其是鉴别出高度病变，以提高筛查的准确性和可预测性。诊断宫颈癌前病变，尤其是鉴别出高度病变，以提高筛查的准确性和可预测性。人端粒酶人端粒酶RNARNA（hTERChTERC）是人端粒酶组分之一，有研究证实，端粒酶激活是）是人端粒酶组分之一，有研究证实，端粒酶激活是HPVHPV整整合入宫颈细胞后，上皮内瘤样病变（合入宫颈细胞后，上皮内瘤样病变（CINCIN）向宫颈癌转化的关键步骤。此次大会）向宫颈癌转化的关键步骤。此次大会口头报告中北京大学人民医院魏丽惠等提交的一项研究颇为引人注目，该研究发口头报告中北京大学人民医院魏丽惠等提交的一项研究颇为引人注目，该研究发现，通过荧光原位杂交（现，通过荧光原位杂交（FISHFISH）检测宫颈细胞学涂片中）检测宫颈细胞学涂片中hTERChTERC基因扩增情况，在基因扩增情况，在宫颈癌和癌前病变诊断中具有重要价值。宫颈癌和癌前病变诊断中具有重要价值。TERC与子宫颈癌级别与子宫颈癌级别国内国内10001000多多例临床实验例临床实验结果结果TERCTERC在临床中的意义在临床中的意义在临床中的意义在临床中的意义TERC在临床中的意义在临床中的意义-风险预测风险预测针对针对HPVHPV高危的宫颈癌易感人群高危的宫颈癌易感人群,在常规在常规TCTTCT筛查的基础上筛查的基础上,加加做做TERCTERC基因检测基因检测,可帮助医生判断病人疾病风险可帮助医生判断病人疾病风险改进的子宫颈癌筛查与诊断手段改进的子宫颈癌筛查与诊断手段TERCTERC在临床中的意义在临床中的意义在临床中的意义在临床中的意义-CIN1-CIN1患者的分流治疗患者的分流治疗患者的分流治疗患者的分流治疗 TERCTERC在临床中的意义在临床中的意义在临床中的意义在临床中的意义-CIN1-CIN1患者的分流治疗患者的分流治疗患者的分流治疗患者的分流治疗TERCTERC在临床中的意义在临床中的意义在临床中的意义在临床中的意义-CIN2-CIN2患者的分流治疗患者的分流治疗患者的分流治疗患者的分流治疗TERCTERC在临床中的意义在临床中的意义在临床中的意义在临床中的意义-术后评估，复发监测术后评估，复发监测术后评估，复发监测术后评估，复发监测nnTERCTERC（-）：手术病灶切除干净，并无复发，定期）：手术病灶切除干净，并无复发，定期）：手术病灶切除干净，并无复发，定期）：手术病灶切除干净，并无复发，定期随访观察随访观察随访观察随访观察nnTERCTERC（+）：高度怀疑有病灶没有被完全切除，或）：高度怀疑有病灶没有被完全切除，或）：高度怀疑有病灶没有被完全切除，或）：高度怀疑有病灶没有被完全切除，或者有复发。根据病人情况再次进行手术治疗者有复发。根据病人情况再次进行手术治疗者有复发。根据病人情况再次进行手术治疗者有复发。根据病人情况再次进行手术治疗TERCTERC在临床中的意义在临床中的意义在临床中的意义在临床中的意义-鉴别诊断鉴别诊断鉴别诊断鉴别诊断对于对于30岁以前岁以前HPV阳性的病人阳性的病人，大多是一过性感染，可用，大多是一过性感染，可用TERC探针进行鉴别诊断。探针进行鉴别诊断。TERC（-）：一过性感染）：一过性感染TERC（+）：有癌变风险，采取治疗措施）：有癌变风险，采取治疗措施对于怀孕期的妇女对于怀孕期的妇女，雌激素可使移行带区的基底细胞出现不典型雌激素可使移行带区的基底细胞出现不典型增生甚至类似原位癌的改变，与宫颈原位癌鉴别困难。但前者在产增生甚至类似原位癌的改变，与宫颈原位癌鉴别困难。但前者在产后能恢复正常。后能恢复正常。TERC（-）：雌激素引起，无需治疗，产后自然恢复正常）：雌激素引起，无需治疗，产后自然恢复正常TERC（+）：高度怀疑原位癌，密切随诊，产后六周进行相应治疗）：高度怀疑原位癌，密切随诊，产后六周进行相应治疗TERCTERC在临床中的意义在临床中的意义在临床中的意义在临床中的意义-鉴别诊断鉴别诊断鉴别诊断鉴别诊断CIN1CIN1和和和和CIN2CIN2病理学上有时难以区分，但病理学上有时难以区分，但病理学上有时难以区分，但病理学上有时难以区分，但是对指导临床的治疗有重要意义是对指导临床的治疗有重要意义是对指导临床的治疗有重要意义是对指导临床的治疗有重要意义TERCTERC（-）：）：）：）：90%90%可能为可能为可能为可能为CIN1CIN1，按，按，按，按CIN1CIN1方案治疗方案治疗方案治疗方案治疗TERCTERC（+）：）：）：）：90%90%可能为可能为可能为可能为CIN2CIN2，按，按，按，按CIN2CIN2方案治疗方案治疗方案治疗方案治疗TERCTERC指导临床治疗小结指导临床治疗小结指导临床治疗小结指导临床治疗小结临床常用检测项目临床常用检测项目临床常用检测项目临床常用检测项目-宫颈癌宫颈癌宫颈癌宫颈癌三种检测方法比较三种检测方法比较三种检测方法比较三种检测方法比较方法方法方法方法特异性（）特异性（）特异性（）特异性（）敏感性（）敏感性（）敏感性（）敏感性（）形态学检测形态学检测形态学检测形态学检测909055-8055-80HPVHPV检测检测检测检测6464959584-10084-100FISHFISH90909090TERCTERC基因阳性图基因阳性图基因阳性图基因阳性图原位癌原位癌术后复查术后复查TERCTERC基因阴性图基因阴性图基因阴性图基因阴性图TERCTERCTERCTERC基因基因基因基因FISHFISHFISHFISH检测检测检测检测检测样本：检测样本：检测样本：检测样本：TCTTCT采集、采集、采集、采集、生理盐水采集、生理盐水采集、生理盐水采集、生理盐水采集、活检标本石蜡切片、活检标本石蜡切片、活检标本石蜡切片、活检标本石蜡切片、手术标本石蜡切片手术标本石蜡切片手术标本石蜡切片手术标本石蜡切片FISHFISH检测检测TERCTERC基因的结果判读：基因的结果判读：标本为新鲜宫颈细胞制片：标本为新鲜宫颈细胞制片：阈值建立阈值建立采集采集2020例正常人宫颈细胞。例正常人宫颈细胞。阈值测定：每例分析至少阈值测定：每例分析至少100100个细胞，统计出现个细胞，统计出现2 2个以上个以上TERCTERC信号细胞数信号细胞数目的百分比。目的百分比。阈值阈值=平均数（平均数（M M）+3X+3X标准差（标准差（SDSD）结果判断结果判断每例样本随机计数细胞（至少每例样本随机计数细胞（至少100100个），如果检测值大于阈值，判定为个），如果检测值大于阈值，判定为阳性结果；如果检测值小于阈值，判定为阴性结果；如果检测值等于阈阳性结果；如果检测值小于阈值，判定为阴性结果；如果检测值等于阈值，加大观测样本细胞数目。值，加大观测样本细胞数目。标本为组织石蜡切片：标本为组织石蜡切片：连续连续3 3个细胞出现个细胞出现2 2个以上个以上TERCTERC信号，即判为阳性。信号，即判为阳性。FISHFISH检测检测Her-2Her-2基因扩增基因扩增Her-2基因扩增模式基因扩增模式Her-2基因扩增模式基因扩增模式赫赛汀在胃癌中的应用赫赛汀在胃癌中的应用赫赛汀在胃癌中的应用赫赛汀在胃癌中的应用随访终点指标随访终点指标赫赛汀在胃癌中的应用赫赛汀在胃癌中的应用赫赛汀在胃癌中的应用赫赛汀在胃癌中的应用小结小结小结小结TOP2ATOP2A基因基因基因基因测测测测TOP2ATOP2A基因的意义基因的意义基因的意义基因的意义nn计数计数计数计数100100100100个细胞，统计个细胞，统计个细胞，统计个细胞，统计RatioRatioRatioRatio值（红信号数值（红信号数值（红信号数值（红信号数/绿信号数）绿信号数）绿信号数）绿信号数）nnFISHFISHFISHFISH阳性：阳性：阳性：阳性：1.EGFR1.EGFR1.EGFR1.EGFR基因扩增基因扩增基因扩增基因扩增（1 1 1 1）Ratio2Ratio2Ratio2Ratio2为阳性结果，提示该样本有为阳性结果，提示该样本有为阳性结果，提示该样本有为阳性结果，提示该样本有EGFREGFREGFREGFR基因扩增基因扩增基因扩增基因扩增（2 2 2 2）大于等于）大于等于）大于等于）大于等于15151515个红色信号的细胞数占细胞总数的个红色信号的细胞数占细胞总数的个红色信号的细胞数占细胞总数的个红色信号的细胞数占细胞总数的10%10%10%10%以上，为阳性结果，以上，为阳性结果，以上，为阳性结果，以上，为阳性结果，提示该样本有提示该样本有提示该样本有提示该样本有EGFREGFREGFREGFR基因扩增基因扩增基因扩增基因扩增（3 3 3 3）出现成团扩增的细胞，为阳性结果，提示该样本有）出现成团扩增的细胞，为阳性结果，提示该样本有）出现成团扩增的细胞，为阳性结果，提示该样本有）出现成团扩增的细胞，为阳性结果，提示该样本有EGFREGFREGFREGFR基因扩增基因扩增基因扩增基因扩增2.2.2.2.高多体性高多体性高多体性高多体性 RatioRatioRatioRatio2 2 2 2，但大于等于，但大于等于，但大于等于，但大于等于4 4 4 4个红色信号的细胞占细胞总数的个红色信号的细胞占细胞总数的个红色信号的细胞占细胞总数的个红色信号的细胞占细胞总数的40%40%40%40%以上，为阳性以上，为阳性以上，为阳性以上，为阳性结果，提示该样本为结果，提示该样本为结果，提示该样本为结果，提示该样本为EGFREGFREGFREGFR基因高多体性扩增基因高多体性扩增基因高多体性扩增基因高多体性扩增nnFISHFISHFISHFISH阴性阴性阴性阴性除以上阳性情况上，其余结果均为阴性结果除以上阳性情况上，其余结果均为阴性结果除以上阳性情况上，其余结果均为阴性结果除以上阳性情况上，其余结果均为阴性结果淋巴瘤的诊断和治疗淋巴瘤的诊断和治疗 对病理医生和临床医生的挑战对病理医生和临床医生的挑战l 淋巴瘤的分类复杂（淋巴瘤的分类复杂（20082008年年WHOWHO分类）分类）l 不同类型的淋巴瘤有着不同的预后，需要不同的治疗；不同类型的淋巴瘤有着不同的预后，需要不同的治疗；l 即使是相同类型的肿瘤，由于携带不同的分子遗传学异即使是相同类型的肿瘤，由于携带不同的分子遗传学异 常，对治疗的反应也可能不同常，对治疗的反应也可能不同;l 多数淋巴瘤综合临床特征、组织形态学、
