碱裂解法从Ecoli中制备质粒DNA.ppt

质粒质粒DNADNA制备制备一、质粒简介一、质粒简介l质质粒粒是是细细菌菌内内独独立立于于染染色色体体并并能能自自我我复复制制的小的小环环状状DNADNA分子分子 l其大小范围从其大小范围从lkblkb至至200200kbkb以上不等。以上不等。l已经在形形色色的细菌类群中发现质粒已经在形形色色的细菌类群中发现质粒.l这这些些质质粒粒都都是是独独立立于于细细菌菌染染色色体体之之外外进进行行复制和遗传的辅助性遗传单位。复制和遗传的辅助性遗传单位。l质质粒粒通通过过细细菌菌间间的的接接合合作作用用，从从雄雄性性体体转转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子l1946年年，Lederburg和和Fatum发发现现的的F因因子子是是最最早早发发现现的的质质粒粒，F因因子子与与高高等等生生物物细胞质中的染色体外遗传单位极为相似。细胞质中的染色体外遗传单位极为相似。l 1952年，由年，由Lederburg正式命名为质粒。正式命名为质粒。l确确切切地地说说，质质粒粒是是细细菌菌内内的的共共生生型型遗遗传传因因子子，它它能能在在细细菌菌中中垂垂直直遗遗传传并并且且赋赋予予宿宿主主细细胞胞表表型型，是是比比病病毒毒更更简简单单的的原原始始生命。生命。l质质粒粒依依赖赖于于宿宿主主编编码码的的酶酶和和蛋蛋白白质质来来进进行行复复制制和和转转录录。通通常常，质质粒粒含含有有编编码码某某些些酶酶的的基基因因，这这些些酶酶事事实实上上在在一一定定的的环环境境下下对对细菌宿主有利。细菌宿主有利。l由由质质粒粒产产生生的的表表型型包包括括对对抗抗生生素素的的抗抗性性、产产抗抗生生素素、降降解解复复杂杂有有机机化化合合物物，以以及及产产生生大大肠肠杆杆菌菌素素、肠肠毒毒素素及及限限制制酶酶与与修修饰饰酶酶等等。等等。l质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术技术 二、二、质粒特性质粒特性1.分子相对小分子相对小 l 在在5 5kbkb左右，质粒较小，比较稳定，左右，质粒较小，比较稳定，不易受物理因素的损伤，此外，较小不易受物理因素的损伤，此外，较小的质粒一般有较高的拷贝数。的质粒一般有较高的拷贝数。2.含有高效的自主复制成分含有高效的自主复制成分l质粒的复制与宿主细胞的繁殖不相关，在质粒的复制与宿主细胞的繁殖不相关，在抑制细菌蛋白质合成时，细菌染色体抑制细菌蛋白质合成时，细菌染色体DNADNA停止复制，但这种质粒可继续利用细菌原停止复制，但这种质粒可继续利用细菌原有的酶系进行复制有的酶系进行复制 l质粒含有复制起始点，此起始点及顺式作质粒含有复制起始点，此起始点及顺式作用调控元件组成一个复制子用调控元件组成一个复制子(repliconreplicon)，能利用细菌染色体能利用细菌染色体DNADNA复制所用的同一套复制所用的同一套酶系统，在细菌细胞中独立地进行自我复酶系统，在细菌细胞中独立地进行自我复制及转录。制及转录。l根据所含复制起始区的不同，有些质粒的根据所含复制起始区的不同，有些质粒的复制与宿主细胞染色体的复制同步，每个复制与宿主细胞染色体的复制同步，每个细胞只含有一个或几个拷贝的质粒，即处细胞只含有一个或几个拷贝的质粒，即处于于“严密控制严密控制”。l有些质粒则处于有些质粒则处于“松弛控制松弛控制”，每个细胞，每个细胞可含达可含达15-2015-20乃至数百拷贝的质粒。这类乃至数百拷贝的质粒。这类质粒在宿主细胞蛋白质停止合成质粒在宿主细胞蛋白质停止合成(加入氯加入氯霉素霉素)、染色体、染色体DNADNA停止复制的条件下，拷停止复制的条件下，拷贝数继续增加至数千。贝数继续增加至数千。3.3.不相容性不相容性l利利用用同同一一复复制制系系统统的的不不同同质质粒粒不不能能稳稳定定地地和和平平共共处处，可可称称之之为为不不相相容容质质粒粒，当当两两个个上上述述质质粒粒被被导导入入同同一一细细胞胞时时，它它们们在在复复制制及及随随后后分分配配到到子子细细胞胞的的过过程程中中彼彼此竞争。此竞争。l由由于于质质粒粒分分子子是是从从细细胞胞内内的的质质粒粒库库中中随随机机选选取取出出来来进进行行复复制制的的，所所以以两两个个不不同同的的质质粒粒在在一一个个单单细细胞胞中中的的拷拷贝贝数数并并不不总总能能保保持持相相同同。最最初初在在随随机机过过程程中中产产生生的的微微小小差差异异，将将很很快快导导致致两两种种质质粒粒在在拷拷贝贝数数上上更更严严重重地地失衡。失衡。l在在一一些些细细胞胞中中，一一种种质质粒粒处处于于优优势势，而而在在另另一一些些细细胞胞中中，与与之之不不相相容容的的另另一一种种质质粒粒却却占占尽尽上上风风。细细菌菌生生长长几几代代之之后后，占占少少数数的的质质粒粒将将会会丧丧失失殆殆尽尽，在在原原始始细细胞胞的的后后代代中中可可含含有有两两种种质质粒粒中中的的任任意意一一种种，但但不不会会兼而有之。兼而有之。l通过检查不同质粒在同一细胞中共存的能通过检查不同质粒在同一细胞中共存的能力，可以把它们分为若干不相容组。带有力，可以把它们分为若干不相容组。带有相同复制子的质粒属于同一不相容组，而相同复制子的质粒属于同一不相容组，而带有不可互换成分的复制子的质粒则属于带有不可互换成分的复制子的质粒则属于不同的不相容组。现已发现不同的不相容组。现已发现3030多个这样的多个这样的不相容组。不相容组。4.转移性转移性l在自然条件下，很多质粒都可以通过在自然条件下，很多质粒都可以通过一种称为细菌接合的作用转移到新宿一种称为细菌接合的作用转移到新宿主内。主内。5.选择的标记选择的标记l质粒应带有一个或几个可供选择的标质粒应带有一个或几个可供选择的标记，便于对转化株的筛选。记，便于对转化株的筛选。l常用来作为标记的有氨苄青霉素抗性常用来作为标记的有氨苄青霉素抗性(ampicillinampicillin resistance resistance，ampampr r)基因，基因，此基因编码此基因编码内酰胺酶，该酶能水内酰胺酶，该酶能水解氨苄青霉素的解氨苄青霉素的内酰胺环使之失内酰胺环使之失效，从而赋予细菌抗药性。效，从而赋予细菌抗药性。l另一常用的抗药性基因为四环素抗性另一常用的抗药性基因为四环素抗性(tetracycline resistancetetracycline resistance，tettetr r)基因，基因，该基因编码一种含该基因编码一种含399399氨基酸残基的膜相氨基酸残基的膜相关蛋白质，能阻止四环素进入细胞。关蛋白质，能阻止四环素进入细胞。lampampr r基因或基因或tettetr r基因若被外源基因插入，基因若被外源基因插入，便失去相便失去相应应的抗的抗药药性，便于分子克隆的性，便于分子克隆的筛筛选选。l大大肠肠杆杆菌菌的的laclac Z Z基基因因也也常常被被用用作作为为选选择择的的标标记记，此此基基因因编编码码半半乳乳糖糖苷苷酶酶，能能分分解解一一种种有有色色基基因因(x)x)与半乳糖以糖苷键连结成的化合物与半乳糖以糖苷键连结成的化合物x-galx-gal。l 半乳糖苷酶半乳糖苷酶l X-gal X-gal X +gal X +gall 无色无色 蓝色产物蓝色产物 半乳糖半乳糖l l若在含有若在含有X-galX-gal的培养剂中，在乳糖操纵的培养剂中，在乳糖操纵子子(lac operonlac operon)诱导物异丙硫半乳糖苷诱导物异丙硫半乳糖苷(isopropylthiogalactosideisopropylthiogalactoside，IPTG)IPTG)的作的作用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解XgalXgal，此菌落成为蓝色。此菌落成为蓝色。l若若lacZlacZ基因被外源基因被外源DNADNA片断插入而破坏，片断插入而破坏，则不能制造半乳糖苷酶，菌落为白斑。则不能制造半乳糖苷酶，菌落为白斑。6.限制性内切酶单一切口限制性内切酶单一切口l在质粒复制子以外的部位具有一种或多在质粒复制子以外的部位具有一种或多种限制性内切酶的单一切口，便于外源种限制性内切酶的单一切口，便于外源基因的插入。基因的插入。l若这种单一的限制性内切酶位点处于选若这种单一的限制性内切酶位点处于选择标记基因的内部，外源基因片断插入择标记基因的内部，外源基因片断插入后会导致该基因失活便于筛选。后会导致该基因失活便于筛选。三、常用三、常用质粒载体质粒载体1.pBR322l pBR322pBR322是一种使用最广泛的质粒，全长是一种使用最广泛的质粒，全长为为4 3634 363bpbp，由由3 3种野生型质粒成分组成，种野生型质粒成分组成，ampampr r基因来自基因来自pRSF2124pRSF2124，tettetr r来自来自pSCl01pSCl01，复制起始点来自复制起始点来自pM9pM9。核苷酸的序次号，核苷酸的序次号，以以EcoRIEcoRI序列序列GAATTCGAATTC的第一个的第一个T T为第一个核为第一个核苷酸。苷酸。2.pUCpUC系统系统l如如pUCl8pUCl8和和pUCI9pUCI9，由，由pBR322pBR322的的ampampr r基因和基因和复制子，以及大肠杆菌部分复制子，以及大肠杆菌部分1 1acZacZ基因和一基因和一个多种限制性内切酶单一位点的接头构成，个多种限制性内切酶单一位点的接头构成，全长全长2 6662 666bpbp，pUCl8pUCl8和和pUCl9pUCl9所含多位点所含多位点接头的方向正好相反。接头的方向正好相反。3表达载体表达载体l载载体体含含有有tac启启动动子子、Lac操操纵纵基基因因、SD序列、序列、Lac I阻遏蛋白基因等。阻遏蛋白基因等。四、质粒四、质粒DNA的提取和纯化的提取和纯化（一）、一）、质粒提取的主要步骤质粒提取的主要步骤 1 1细菌的培养：细菌的培养：l先分离单个菌落，先分离单个菌落，接种到含少量适当抗接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒质粒DNADNA也在自主复制。也在自主复制。l对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度上受到宿主细胞的控制，故在细菌对数度上受到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白质的生长后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白质的合成和染色体合成和染色体DNADNA的复制。质粒的复制。质粒DNADNA的复制的复制不受影响而大量扩增。不受影响而大量扩增。l对于新一代的质粒对于新一代的质粒如如pUCpUC系列等，由于宿系列等，由于宿主对这些松弛型质粒的复制控制不严，利主对这些松弛型质粒的复制控制不严，利用氯霉素对质粒用氯霉素对质粒DNADNA的选择性扩增并不十的选择性扩增并不十分必要。分必要。l长长时时间间在在氯氯霉霉素素存存在在下下，质质粒粒DNADNA合合成成过过程程中中，复复制制链链中中会会掺掺入入核核糖糖核核苷苷酸酸，对对碱碱性性条条件件敏敏感感，将将会会导导致致大大量量的的缺缺口口环环状状DNADNA和线性质粒的产生和线性质粒的产生 l但但有有些些人人仍仍然然偏偏爱爱用用氯氯霉霉素素选选择择性性扩扩增增质质粒粒，其其理理由由是是在在中中等等体体积积培培养养物物中中能能获获取取与与大大量量培培养养物物等等同同的的质质粒粒产产量量。而而且且细细菌菌量量的的减减少少，使使得得裂裂解解物物的的复复杂杂性性和和粘粘稠稠度度降降低低，操操作作更更方方便便、有有效效，对对煮煮沸沸法法更更是是如如此此。所所以以使使用用氯氯霉霉素素的的主主要要目目的的，是是在在不不减减低低质质粒粒产产量量的的前前提提下下，减减少少细细菌菌的的培培养体积和细菌的数量养体积和细菌的数量 l有有时时质质粒粒在在细细菌菌中中的的扩扩增增状状况况很很差差，常常是是由由于于质质粒粒携携带带外外源源基基因因或或质质粒粒分分子子量量过过大大所致。所致。l这这种种低低效效率率扩扩增增，可可利利用用高高营营养养培培养养基基促促进生长，一般可增加质粒产量进生长，一般可增加质粒产量4-64-6倍。倍。2 2细菌的收集与裂解细菌的收集与裂解l细细胞胞生生长长过过程程中中，排排出出大大量量代代谢谢产产物物，为为了了提提高高质质粒粒DNADNA的的纯纯度度，离离心心弃弃上上清清，细细菌菌沉沉淀淀最最好好用用STESTE或或生生理理盐盐水水悬悬浮浮，漂漂洗洗l-2l-2次次，离离心心管管壁壁上上的的液液体体也也应应该该仔细去除干净。仔细去除干净。l细细胞胞的的裂裂解解方方法法很很多多，如如去去污污剂剂法法，沸沸水水热热裂裂法法、碱碱变变性性法法，有有机机溶溶剂剂法法和和溶溶菌菌酶酶法等。法等。l不同方法各有利弊，一般要根据质粒性质、不同方法各有利弊，一般要根据质粒性质、宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后加以选择。素综合后加以选择。3 3质粒质粒DNADNA纯化纯化l 质粒从细菌中分离出来以后，为满足质粒从细菌中分离出来以后，为满足有些实验的要求还应进一步纯化。有些实验的要求还应进一步纯化。CsClCsCl溴溴乙锭平衡超速离心法是纯化质粒的可靠经乙锭平衡超速离心法是纯化质粒的可靠经典方法典方法。l但是由于此法费用昂贵及流程长，近年来，但是由于此法费用昂贵及流程长，近年来，发展了几种不同的方法取代了超离法。如发展了几种不同的方法取代了超离法。如离子交换层析法或排阻层析法，分级聚乙离子交换层析法或排阻层析法，分级聚乙二醇沉淀法等，也可获得较好质量的质粒二醇沉淀法等，也可获得较好质量的质粒DNADNA。l转基因动物，真核细胞转染及转基因动物，真核细胞转染及DNADNA外切酶外切酶酶切缺失等实验，对闭合环状双链酶切缺失等实验，对闭合环状双链DNADNA的的要求较高，一般还是用超速离心法纯化质要求较高，一般还是用超速离心法纯化质粒。粒。l对于对于DNADNA片段酶切回收，内切酶图谱分析、片段酶切回收，内切酶图谱分析、细菌转化、亚克隆及探针放射性标记等实细菌转化、亚克隆及探针放射性标记等实验，直接用小量或中量提取的验，直接用小量或中量提取的DNADNA样品，样品，并不需要超速离心纯化，一般可满足实验并不需要超速离心纯化，一般可满足实验要求。要求。（二）（二）质粒质粒DNADNA的制备的制备l质粒质粒DNADNA的小量制备的小量制备 2-5mll质粒质粒DNADNA的大量制备的大量制备 500mll碱裂解法碱裂解法 l煮沸法煮沸法 lSDSSDS裂解法裂解法 lTriton-Triton-溶菌酶法溶菌酶法（三）质粒（三）质粒DNA提取方法的选择提取方法的选择 l常常用用的的煮煮沸沸法法，碱碱法法,SDSSDS法法均均可可获获得得较较满满意意效效果果至至于于有有人人采采用用碱碱法法提提取取小小量量细细菌菌培培养养物物的的质质粒粒，用用煮煮沸沸法法或或SDSSDS法法进进行行质质粒粒DNADNA的的大大量量分分离离，只只是是各各个个实实验验室室的的习习惯问题惯问题.l但但是是对对于于不不同同的的菌菌株株和和不不同同大大小小的的质质粒粒DNADNA分分子子及及以以后后进进行行的的不不同同实实验验等等具具体体情情况况，选选择择哪哪种种方方法法制制备备质质粒粒DNADNA，应考虑以下因素：应考虑以下因素：1 1菌株类型菌株类型l 大大量量提提取取HB101HB101，TGlTGl菌菌株株中中的的质质粒粒不不提提倡倡选选择择煮煮沸沸法法，这这类类细细菌菌富富含含糖糖类类，在在煮煮沸沸或或去去污污剂剂裂裂解解细细菌菌时时，大大量量释放出来。释放出来。l若若用用CsClCsCl-EB-EB梯梯度度平平衡衡超超速速离离心心，糖糖类类的的密密度度平平衡衡区区域域与与闭闭环环共共价价质质粒粒DNADNA带带非非常常邻邻近近，在在抽抽取取闭闭环环质质粒粒DNADNA时时，不不可可避避免免地地污污染染有有糖糖类类，它它们们可可抑抑制制许许多多DNADNA限制性内切酶的活性。限制性内切酶的活性。l另另外外，HB101HB101及及其其它它含含有有endAendA+基基因因型型的的菌菌株株表表达达中中的的核核酸酸内内切切酶酶A A，在在煮煮沸沸时时不不能能完完全全失失活活，在在以以后后操操作作中中，只只要要有有MgMg2+2+存存在在(如如内内切切酶酶反反应应缓缓冲冲液液)，核核酸酸内内切切酶酶A A就就可可将将质质粒粒DNADNA降降解解，而影响实验结果。而影响实验结果。l若一定要用煮沸法提取这类菌株的质粒若一定要用煮沸法提取这类菌株的质粒DNADNA，不管是大量还是小量制备，必须不管是大量还是小量制备，必须用酚、氯仿反复抽提几次以去除该酶用酚、氯仿反复抽提几次以去除该酶2质粒的大小质粒的大小l 大大于于15kb的的质质粒粒DNA易易被被强强烈烈的的物物理理或或化化学学作作用用损损坏坏，所所以以常常选选用用操操作作过过程程较较温温和和的的SDS法法。细细菌菌悬悬浮浮液液中中含含有有10%蔗蔗糖糖以以提提高高溶溶液液的的渗渗透透压压，减减轻轻细细菌菌裂裂解解时时DNA泄泄漏漏过过快快产产生生的的机机械械剪剪切切力。力。l在在溶溶菌菌酶酶消消化化细细菌菌壁壁与与膜膜后后，再再加加SDS解聚蛋白质与解聚蛋白质与DNA的结合。的结合。l整个操作中物理剪切力小，整个操作中物理剪切力小，适用于大分适用于大分子量的质粒子量的质粒DNA的提取。的提取。3 3细菌染色体细菌染色体DNADNA变性条件强弱的控制变性条件强弱的控制l 碱碱法法是是目目前前实实验验室室中中最最常常用用的的质质粒粒DNADNA提提取取方方法法。它它对对细细菌菌的的裂裂解解，细细菌菌染染色色体体DNADNA及及蛋蛋白白质质变变性性充充分分，所所以以提提取的质粒取的质粒DNADNA产量高纯度好。产量高纯度好。l但但是是暴暴露露在在强强碱碱性性环环境境中中时时间间过过长长，共共价价闭闭合合环环状状质质粒粒DNADNA可可发发生生不不可可逆逆的的变变性性，导导致致内内切切酶酶切切割割困困难难，质质粒粒DNADNA迁移速度降低迁移速度降低1 1倍左右，倍左右，EBEB染色效率低。染色效率低。l19661966年年VinogradVinograd等等人人对对这这个个问问题题作作过过报报道道，但但目目前前，仍仍有有些些实实验验人人员员，对对这这一一关关键键问问题题并并没没有有足足够够的的重重视视。如如出出现现这这种种状状况况，在在下下次次提提取取时时，可可以以适适当当缩缩短短碱碱变变性性时时间间，不不必必按按某某些些书书籍中规定的籍中规定的1010分钟时间操作分钟时间操作l l在在煮煮沸沸法法中中，过过长长时时间间，过过高高热热度度也也会会导导致致类类似似问问题题的的出出现现，这这种种影影响响实实验验结结果果的的操操作作细细节节应应根根据据具具体体的的菌菌株株和质粒情况加以适当改进。和质粒情况加以适当改进。4细菌的培养与收集细菌的培养与收集l 细菌生长过程中的代谢废物和脱落的细细菌生长过程中的代谢废物和脱落的细胞壁成分，也会影响到质粒的质量和内切胞壁成分，也会影响到质粒的质量和内切酶酶解效果。所以离心收集细菌时，上清酶酶解效果。所以离心收集细菌时，上清液应去除干净，最好用液应去除干净，最好用STE或生理盐水再或生理盐水再悬浮，漂洗菌体悬浮，漂洗菌体1-2次。次。（四）碱裂解法原理（四）碱裂解法原理：l在在pHl2.0-12.6pHl2.0-12.6碱碱性性环环境境中中，线线性性的的大大分分子子量量细细菌菌染染色色体体DNADNA变变性性，而而共共价价闭闭环环(CC)CC)质粒质粒DNADNA仍为自然状态。仍为自然状态。l将将pHpH调调至至中中性性并并有有高高盐盐浓浓度度存存在在的的条条件件下下，染染色色体体DNADNA之之间间交交联联形形成成不不溶溶性性网网状状结结构构。大大部部分分DNADNA和和蛋蛋白白质质在在去去污污剂剂SDSSDS的的作作用用下下形形成成沉沉淀淀，而而CCCC质质粒粒DNADNA仍然为可溶状态。仍然为可溶状态。l通通过过离离心心，可可去去除除大大部部分分细细胞胞碎碎片片染染色色体体DNADNA、RNARNA及及蛋蛋白白质质，质质粒粒DNADNA尚尚在在上上清清中中，再再用用酚酚、氯氯仿仿抽抽提提进进一一步步纯纯化质粒化质粒DNADNA。问题：问题：l）有有些些工工作作者者首首次次进进行行小小量量制制备备时时，有有时时会会发发现现质质粒粒不不能能被被限限制制酶酶所所切切割割，这这几几乎乎总总是是由由于于从从细细菌菌沉沉淀淀或或从从核核酸酸沉沉淀淀中中去去除除所所有有上上清清液液时时注注意得不够。意得不够。l大大多多数数情情况况下下，用用酚酚：氯氯仿仿对对溶溶液液进进行行抽抽提提可可以以去去除除小小量量制制备备物物中中的的杂杂质质。如如果果依依然然存存在在，可可用用离离心心柱柱层层析析法法纯纯化。化。l）在在十十分分偶偶然然的的情情况况下下，个个别别小小量量制制备备物物会会出出现现无无质质粒粒的的现现象象。这这几几乎乎肯肯定定是是由由于于核核酸酸沉沉淀淀颗颗粒粒已已同同乙醇一起被弃去。乙醇一起被弃去。