细菌和噬菌体的重组和连锁.ppt

n第一节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位n第二节 细菌的遗传分析n第三节 噬菌体的遗传分析n本章要点第五章第五章 细菌和噬菌体的重组和连锁细菌和噬菌体的重组和连锁第一节 细菌和病毒在遗传学研究中的地位n细菌和病毒在遗传学研究中的优越性:繁殖速度快、世代所需时间短，缩短了实验周期；便于研究基因的突变：细菌和病毒均属于单倍体，所有突变都能立即表现出来，不存在显性掩盖隐性的问题；便于研究基因的作用：通过基本培养基和选择培养基的影印培养，很容易筛选出营养缺陷型，利于生化研究。易于管理和进行化学分析：个体小，繁殖方便，可以大量节省人力、物力和财力；且代谢旺盛，繁殖又快，累积大量的代谢产物。遗传物质较简单，便于用作研究基因结构、功能及调控机制的材料。可作为研究高等生物的简单模型；第二节、细菌的遗传分析第二节、细菌的遗传分析一、细菌概述一、细菌概述无真正的细胞核，只有染色体区，称拟核区。不进行减数分裂和有丝分裂。而是简单地复制和一分为二。缺乏线粒体、叶绿体等细胞器。单细胞生物，其染色体为环形、裸露双链DNA分子，较易插入DNA片断。细胞壁细胞壁(cell wall)细胞膜细胞膜(plasma membrane)拟核拟核(Nucleoid)性纤毛性纤毛(pili)核糖体核糖体(Ribosome)(Flagella)（一）细菌的突变型（一）细菌的突变型1.1.合成代谢功能突变型合成代谢功能突变型:营养缺陷型（营养缺陷型（auxotroph)auxotroph)野生型（野生型（wild type)wild type)缺陷型（缺陷型（deficient)deficient)原养型（原养型（prototroph)prototroph)Met-Met-甲硫氨基酸甲硫氨基酸缺陷缺陷型型 Met+Met+Thi-Thi-硫胺硫胺缺陷缺陷型型 Thi+Thi+Pur-Pur-嘌呤嘌呤缺陷缺陷型型 Pur+Pur+2.2.分解代谢功能突变型：分解代谢功能突变型：lac-lac-乳糖突变型，野生型为乳糖突变型，野生型为lac+lac+3.3.抗性突变型：抗性突变型：抗药性或抗感染性抗药性或抗感染性StrStrr r,StrStrs s 分别表示对链霉素有抗性和敏感分别表示对链霉素有抗性和敏感T1r,T1sT1r,T1s分别表示对分别表示对T1T1噬菌体有抗性和敏感噬菌体有抗性和敏感 二、二、细菌细菌的突变型和筛选的突变型和筛选（二）突变型的筛选（二）突变型的筛选1.1.根据菌落特点筛选选择培养基：如Lac-突变菌株在伊红-美蓝培养基（EMB）上形成白色或粉红色菌落，而lac+菌落为有金属光泽的紫色菌落。2.抗性突变型的筛选：将细菌涂布在含有某种抗生素或噬菌体的培养基上，能形成菌落的就是抗性突变菌株。3.营养缺陷型的筛选：用印迹法把在完全培养基上生长的菌落影印到基本培养基上，鉴别出不能生长的克隆。再把它们转移到含有单一营养物质的培养基上，判定该突变型需要哪一种营养物质。三三 细菌的杂交和性别细菌的杂交和性别 细菌之间遗传物质的转移主要有四种方式：转化:n指某些细菌(或其它生物)能通过其细胞膜摄取周围介质中的DNA片段，并将此外源DNA片段整合到自己染色体组中的过程。n转化的过程 非感受态细胞 外源DNA被洗掉了转化因子 感受态细胞 外源DNA仍与细胞结合 整合 吸收洗涤吸附 接合：由供体菌和受体菌之间的直接接触而导致的遗传物质的单向转移。接合管的形成：菌株靠近细胞膜融合两细胞间形成接合管 性导：是接合的一种，F因子所携带的细菌基因通过接合而导入受体细菌。转导：由噬菌体所介导的DNA从供体菌到受体菌的转移。(一一)细菌的杂交细菌的杂交1 1、大肠杆菌杂交试验、大肠杆菌杂交试验菌株菌株A:met-bio-thr+leu+thi+A:met-bio-thr+leu+thi+（需甲硫氨酸和生物素）（需甲硫氨酸和生物素）菌株菌株B:met+bio+thr-leu-thi-B:met+bio+thr-leu-thi-（需苏氨酸，亮氨酸和硫胺）（需苏氨酸，亮氨酸和硫胺）A B完全液体培养基完全液体培养基基本固体培养基基本固体培养基 出现若干原养型菌落，出现若干原养型菌落，频率为频率为1010-7-7，。说明菌株说明菌株A和和B可以杂交，可以杂交，交换遗传物质，出现基因重组交换遗传物质，出现基因重组不是基因突变不是基因突变 2 2、U U实验实验 1950年Davis（戴维斯），做了U实验，在U底部中间用滤片隔开，交替吸压原养型（原养型（基因重组）产生的基因重组）产生的必要条件：必要条件：A A、B B两菌株直接接触两菌株直接接触(二二)细菌的性别细菌的性别？ABAB两细胞遗传物质是混合，还是单向转移两细胞遗传物质是混合，还是单向转移1953年Hayes(海斯)在验证杂交时偶尔发现杂交中AB细菌作用不同，遗传物质是单向转移，遗传物质是单向转移，ABAB，不能，不能BABA。实验：菌株A:met-thr+leu+thi+（需甲硫氨酸）菌株B:met+thr-leu-thi-（需苏氨酸，亮氨酸和硫胺）结果不同，表明A、B有性杂交作用不同，提出遗传物质单向转移。供体：提供遗传物质的细菌 雄性 A受体：接受遗传物质的细菌 雌性 B 所以 AB不久发现导致单向转移的是细胞质中一个微小可转移因子 F F因子因子 四、大肠杆菌四、大肠杆菌 F F-F F+Hfr Hfr F菌株菌株 （一）（一）F F-F F+菌株菌株1、F因子结构:细胞质中环状DNA 原点：转录起点 形成性伞毛的基因群：通过性伞毛与F-细菌接合。DNA复制酶基因：与F因子本身的复制有关；插入序列：与其插入细菌染色体的过程有关。2、F因子存在方式 游离状态：在细胞质中，能自我复制独立遗传 整合状态：整合到细菌环状染色体上，与细菌染色体一起遗传。3、F因子的特性（1）决定大肠杆菌育性：F+菌株，含游离F因子 供体 雄性 F菌株，无游离F因子 受体 雌性（2）F因子高频率转移 当F+F,F+的F因子复制为二,通过接合管将F因子传递给F菌株,使F转变为F+,频率高达95%,即高频率的转移F因子.F因子转移：F因子从原点断裂，以原点为先导，边复制边转移（因此叫滚环复制），复制后的F因子转移到另一个细胞中。细胞分开，使F-变成F+。(3)基因重组的频率低当F+F,F+菌株环状DNA复制通过接合管进入F-细菌细胞，与F-细菌的基因交换，使基因重组，但频率很低，不到百万分之一。(4)F因子可以自发丧失（二）高频重组菌株（二）高频重组菌株 （HfrHfr菌株）菌株）1951年，卡瓦里（Cavalli）等人，1954年海斯（Hayes）先后在A菌株中分离出新的菌株。1、Hfr形成 F因子整合到细菌环状DNA上，这种整合状态F菌株叫Hfr（高频重组）。2、特点(1)可以作为供体，与B杂交，重组频率比AB高1000倍，称高频重组菌株。(2)转移F因子频率低3、HfrF-杂交过程也是先形成接合管，然后Hfr边复制边转移。整合到细菌环状染色体上的F因子容易在原点处断开，将细菌环状染色体上基因带入受体细胞中，基因重组频率高。但在转移过程中，结合管很易断开，这样转移到受体的部分只是靠近原点的一部分（全部转移需温和条件120分钟），形成部分二倍体。致育基因位于最后，而接合管随时可能断开，转移F因子频率低。(三三)接合生殖和交换特点接合生殖和交换特点 1、接合生殖 供体细菌的DNA通过接合管进入受体细菌，实现基因重组的方式。2、基因重组 （1）形成部分二倍体：一个完整的基因组和一个不完整的基因组所构成的二倍体。其中受体的基因组叫内基因子，供体的基因组叫外基因子。外基因子转移到受体以后：a)以游离状态存在，随着细胞分裂代数的增加被稀释，消失；b）与内基因子发生交换、重组。(2)基因交换过程：（3）交换特点 交换发生在完整的F环状染色体和供体线性染色体片段之间即部分二倍体 只有偶数交换才能产生平衡的重组子。只出现一种重组子（杂交后代），无对应重组体，真核生物出现四种杂交后代。(五五)F)F-,F,F+,Hfr,Hfr,F细菌的相互转化细菌的相互转化F+F-HfrF+F-F+F-接合吖黄素高频重组低频重组整合F F 重组频率较低(四四)F菌株菌株F因子可从Hfr脱离成为F+，通常准确脱离，偶尔不准，使F因子带有细菌的个别基因。这种带有细菌个别基因的F因子，称F菌株。五、细菌的遗传作图五、细菌的遗传作图（一）利用中断杂交试验作图（一）利用中断杂交试验作图 叠氮化钠 噬菌体 乳糖 半乳糖 链霉素Hfr azir tonr lac+gal+strsF-：azis tons lac-gal-strr 将 Hfr与F-同时加入装有完全培养基的大试管中，一定时间取样振荡，稀释接种至添加str的基本培养基（葡萄糖和无机盐）上，生长形成的菌落基因型为F-或具Hfr部分基因的F-，再把菌落分别转移到只添加azi、ton、以lac或gal为炭源的选择性培养基上。时间 进入F-的Hfr基因9 不生长 有噬菌斑 不生长 不生长 无 9/生长 有噬菌斑 不生长 不生长 azir11/生长 无噬菌斑 不生长 不生长 azir tonr 18/生长 无噬菌斑 生长 不生长 azir tonr lac+24/生长 无噬菌斑 生长 生长 azir tonr lac+gal+F因子约在120分钟后进入。（1）Hfr的基因按一定顺序和时间间隔进入F-（2）每个基因进入F-有一定频率，且在短时间内达到最高（3）进入F-越早，频率越高（4）F因子进入迟，频率低3 3、HfrHfr染色体上基因排列顺序染色体上基因排列顺序4 4、细菌染色体为环状、细菌染色体为环状用不同Hfr菌株进行中断杂交试验，基因转移的顺序，转移起点和转移方向很不相同。abcdefgh(二）重组作图二）重组作图 当两个基因间的转移时间小于两分钟时，则用中断杂交作图就不可当两个基因间的转移时间小于两分钟时，则用中断杂交作图就不可靠，而必须用传统的重组作图靠，而必须用传统的重组作图(recombination mapping)(recombination mapping)与中断杂交技与中断杂交技术相互对照和补充，提高作图精度。如根据中断杂交，术相互对照和补充，提高作图精度。如根据中断杂交，知道知道laclac与与adeade紧紧密连锁且密连锁且ade+是在是在lac+后进入后进入，距离约为，距离约为1 1分钟，进行以下杂交：分钟，进行以下杂交：紫红色菌落：紫红色菌落：lac+ade+780lac+ade+780（亲本型）（亲本型）白色或粉红色菌落：白色或粉红色菌落：lac-ade+220lac-ade+220（重组型）（重组型）Hfr:lac+ade+strHfr:lac+ade+strs s X F-:lac-ade-str X F-:lac-ade-strr r混合作用混合作用60min60min，在含链霉素、，在含链霉素、不加腺嘌呤不加腺嘌呤的完全培养基上的完全培养基上涂板，只有重组子能够存活：涂板，只有重组子能够存活：F-:ade+strF-:ade+strr r 10001000 影印到影印到EMBEMB培养基上培养基上 (1)(1)重组子的产生重组子的产生Lac-ade+strrLac+ade+strrLac+ade+strs Lac-ade-strrLac-ade-strsLac+ade+strs Lac-ade-strrLac+ade-strs两基因两基因间未发间未发生交换生交换两基因两基因间发生间发生交换交换(2)(2)重组频率的计算重组频率的计算RFlac-ade =*100%lac-ade+lac+ade+lac-ade+用重组频率（用重组频率（RFRF）所测得的基因距离与用中断杂交技术）所测得的基因距离与用中断杂交技术以时间为单位的基因距离基本上是成正比的，大致是以时间为单位的基因距离基本上是成正比的，大致是1 1分钟分钟相当于相当于20%20%重组值，即：重组值，即：1min=20cM1min=20cM =*100%=22%220 1000 一一 病毒概述病毒概述 病毒是比细菌更为简单的生物，它们也只有一条染色体，即单倍体。有些病毒的染色体是DNA，还有一些病毒是RNA。病毒主要是由蛋白质外壳及其包被的核酸所组成的颗粒。病毒可根据宿主(动物、植物、细菌)或遗传物质(DNA或RNA)来分类。第三节第三节 噬菌体的遗传分析噬菌体的遗传分析T T噬菌体的结构噬菌体的结构蛋白质外壳蛋白质外壳核酸核酸二二 噬菌体的繁殖和感染周期噬菌体的繁殖和感染周期（一）（一）烈性噬菌体烈性噬菌体:是使宿主菌发生裂解的是使宿主菌发生裂解的噬菌体，如噬菌体，如T T噬菌体。噬菌体。吸附吸附细菌裂解细菌裂解,释放出子释放出子代噬菌体颗粒代噬菌体颗粒细菌染色体降解细菌染色体降解噬菌体噬菌体DNADNA和蛋白和蛋白质外壳包装成质外壳包装成子代噬菌体颗粒子代噬菌体颗粒(二二)温和噬菌体温和噬菌体 温和噬菌体侵入细菌后，不立即导致溶菌，这种现象称为溶源性。整合的噬菌体称为原噬菌体。原噬菌体。吸附吸附溶菌溶菌周期周期-uvuv诱导诱导细菌裂解细菌裂解溶源溶源周期周期如如 噬菌体噬菌体:原噬菌体原噬菌体三三 噬菌体的突变型噬菌体的突变型（一）宿主范围突变型（一）宿主范围突变型 E.coli B E.coli B/2 E.coli B+E.coli B/2 E.coli B E.coli B/2 E.coli B+E.coli B/2 h h+-半透明噬菌斑半透明噬菌斑h h +透明噬菌斑透明噬菌斑（二）噬菌斑形态突变型（二）噬菌斑形态突变型1.r1.r+小噬菌斑小噬菌斑,边缘模糊边缘模糊:2:2个以上噬菌体同时侵袭时个以上噬菌体同时侵袭时,出现溶菌阻碍现象出现溶菌阻碍现象(lysis inhibition).(lysis inhibition).2.r 2.r 大噬菌斑大噬菌斑,边缘清晰边缘清晰:快速溶菌快速溶菌(rapid lysis),(rapid lysis),无无溶菌阻碍现象溶菌阻碍现象(lysis inhibition)(lysis inhibition)四四 噬菌体的基因重组噬菌体的基因重组用用T2T2噬菌体噬菌体hr+hr+和和h+rh+r混合感染混合感染E.coli B,E.coli B,再再用释放出来的子代噬菌体感染用释放出来的子代噬菌体感染E.coli E.coli B+E.coli B/2,B+E.coli B/2,出现四种噬菌斑出现四种噬菌斑:透明小噬菌斑透明小噬菌斑(hr+)(hr+)半透明大噬菌斑半透明大噬菌斑(h+r)(h+r)透明大噬菌斑透明大噬菌斑(hr)(hr)半透明小噬菌斑半透明小噬菌斑(h+r+)(h+r+)重组率重组率=重组噬菌斑数重组噬菌斑数 总噬菌斑数总噬菌斑数 h+r+hr总噬菌斑数总噬菌斑数=连锁图连锁图 T2快速溶菌突变型有多种，如ra、rb、rc都形成大噬菌斑，用不同类型快速溶菌突变型与宿主范围突变型杂交（rxhrh+)，结果如下：杂交组合 h+r hr+h+r+hr 重组值 h-r图距 h+rahr+34.0%42%12%12%24%24 h+rbhr+32.0%56%5.9%6.4%12.3%12.3 h+rchr+39.0%59%0.7%0.9%1.6%1.6按图距h、ra、rb、rc有4种排列如（如（1）（）（2）rb、rc同侧，同侧，则则drb-rcdrb-h如（如（3）（）（4）rb、rc两侧，两侧，则则drb-rcdrb-h求drb-rcB型快速溶菌 rbrc+C型快速溶菌 rb+rc,混合感染大肠杆菌B子代噬菌体 rbrc+rb+rc rb+rc+rbrc噬菌斑 大 大 小 大交换值 (rb+rc+rbrc)/总100%2小噬菌斑/总100%求出drb-rcdrb-h，rb、rc在同侧实验表明（1）（2）都成立，提出连锁图为环状五五 转导与作图转导与作图 转导转导(transduction):(transduction):以噬菌体为媒介以噬菌体为媒介,将细菌将细菌的染色体片段或基因从一个细菌转移到另一个细菌的染色体片段或基因从一个细菌转移到另一个细菌.供体供体A A 受体受体B B（一）普遍性转导（一）普遍性转导（二）局限性转导（二）局限性转导（三）转导的特点（三）转导的特点（1）转导是以噬菌体为介导的；）转导是以噬菌体为介导的；（2）重组发生在部分二倍体中；）重组发生在部分二倍体中；（3）只出现一种重组子，不出现相反的重组子（如）只出现一种重组子，不出现相反的重组子（如gal-消失，消失，只剩下只剩下gal+）。）。噬菌体噬菌体(一一)普遍性转导普遍性转导 普遍性转导普遍性转导(generalized transduction):(generalized transduction):噬菌体噬菌体携带供体染色体片段是携带供体染色体片段是完全随机完全随机的的,供体染色体中所有供体染色体中所有基因具有同等机会被转导入受体基因具有同等机会被转导入受体,而且各个标记基因被而且各个标记基因被转移的频率大致相等转移的频率大致相等.这是因为噬菌体将供体染色体降这是因为噬菌体将供体染色体降解，在合成自身解，在合成自身DNADNA和包装时，偶尔会将细菌染色体片和包装时，偶尔会将细菌染色体片段包装进入子代噬菌体颗粒，并带入受体菌。段包装进入子代噬菌体颗粒，并带入受体菌。普遍性转导的频率较低普遍性转导的频率较低,约为约为1010-5-5,两个基两个基因同时转导的频率则更低因同时转导的频率则更低,仅有仅有1010-5-5 1010-5=5=1010-10-10.如果两个基因同时转导的频率则较高如果两个基因同时转导的频率则较高,则则说明它们相互连锁说明它们相互连锁,成为共转导成为共转导(cotransduction).(cotransduction).共转导的频率越高共转导的频率越高,则基则基因连锁越紧密因连锁越紧密.反之则基因距离越远反之则基因距离越远.据此可据此可用于细菌染色体的基因作图用于细菌染色体的基因作图.(二二)局限性转导局限性转导(restricted transduction)(restricted transduction)又叫特异性转导又叫特异性转导(specialized transduction),(specialized transduction),这类噬这类噬菌体只能转移细菌染色体的特定部分和基因菌体只能转移细菌染色体的特定部分和基因.如如 噬菌体是一种附加体噬菌体是一种附加体(episome),(episome),即可作为一个复制即可作为一个复制因子独立存在，又可以整合到细菌染色体上的特定位点因子独立存在，又可以整合到细菌染色体上的特定位点attBattB位点位点,而形成原噬菌体。而形成原噬菌体。attBattB位点一边是位点一边是galgal基因，另基因，另一边是一边是biobio。在紫外线诱导下，原噬菌体从细菌染色体上离。在紫外线诱导下，原噬菌体从细菌染色体上离开时，偶尔带有宿主细菌基因，包装形成局限性转导的噬菌开时，偶尔带有宿主细菌基因，包装形成局限性转导的噬菌体颗粒，可将供体基因转移至受体细菌，但仅限于靠近体颗粒，可将供体基因转移至受体细菌，但仅限于靠近attBattB位点附近的基因，如位点附近的基因，如 噬菌体专门转导噬菌体专门转导galgal和和biobio基因。基因。局限性转导的特点局限性转导的特点1.1.受包装容量限制，局限性转导形成的受包装容量限制，局限性转导形成的 噬菌体颗粒往往是缺失体噬菌体颗粒往往是缺失体(defective)(defective)，用，用 dgaldgal或或 dbiodbio表示。由于缺失一段自身表示。由于缺失一段自身DNADNA，不能产生成熟的颗粒，因此局限性转导的频率很低，只有不能产生成熟的颗粒，因此局限性转导的频率很低，只有1010-6-6，所以又称为低频转导（所以又称为低频转导（low frequency transductionlow frequency transduction，LFTLFT）。）。2.2.供体基因不是置换受体基因，而是插入供体基因不是置换受体基因，而是插入attBattB位点，因此使位点，因此使宿主体内宿主体内带有两个拷贝的转导基因带有两个拷贝的转导基因。例如用。例如用 dgal+dgal+转导受体转导受体gal-gal-后，宿主后，宿主体内将既有体内将既有gal+gal+又有又有gal-gal-基因，由于基因，由于gal+gal+对对gal-gal-为显性，因此宿为显性，因此宿主能够利用半乳糖。主能够利用半乳糖。本章要点本章要点nF-菌株、F+菌株、Hfr菌株nF因子、F因子n转化、接合、性导与转导(普遍性转导、局限性转导、)n温和噬菌体、烈性噬菌体、原噬菌体本章要点本章要点 细菌中遗传物质的交换有三种主要的机制：转化、接合和转导。细菌中遗传物质的交换有三种主要的机制：转化、接合和转导。接合需要两个细菌细胞间的物理接触，接合需要两个细菌细胞间的物理接触，F+F+细胞能将细胞能将F F因子转移给不因子转移给不具具F F因子的因子的F-F-细胞，使之成为细胞，使之成为F+F+细胞。如果细胞。如果F F因子整合到染色体上，它因子整合到染色体上，它就成为就成为HFrHFr菌株，能将细菌染色体转移到菌株，能将细菌染色体转移到F-F-细胞。细胞。F F因子从因子从HFrHFr染色体上染色体上分离出来时带有一小段宿主染色体，这种含有细菌基因组的分离出来时带有一小段宿主染色体，这种含有细菌基因组的F F因子就叫因子就叫做做FF因子。在接合过程中通过因子。在接合过程中通过FF因子将某个特异的细菌基因传递给因子将某个特异的细菌基因传递给受体的过程称为性导。利用接合可制作远距离基因的遗传图。受体的过程称为性导。利用接合可制作远距离基因的遗传图。在转化中，单链在转化中，单链DNADNA从周围环境中通过细胞膜进入受体细胞，并且从周围环境中通过细胞膜进入受体细胞，并且通过重组整合到受体细胞的通过重组整合到受体细胞的DNADNA上。转化对于将外源上。转化对于将外源DNADNA整合到细菌细整合到细菌细胞中特别有用，是现代基因工程中常用的技术。胞中特别有用，是现代基因工程中常用的技术。转导可用于紧密连锁基因的精确定位。因此，两个紧密连锁的遗转导可用于紧密连锁基因的精确定位。因此，两个紧密连锁的遗传标记通过它们的共转导频率能进行精确的定位。转导分为普遍性转传标记通过它们的共转导频率能进行精确的定位。转导分为普遍性转导和特异性转导两种。导和特异性转导两种。