实验八亲和层析分离纯化蛋白质课件.pptx

实验目的掌握GST亲和层析分离纯化目标蛋白的原理和实验方法（第一部分）掌握SDS-PAGE检测目标蛋白原理和方法（第二部分）第1页/共34页第一部分 GST亲和层析分离纯化目标蛋白第2页/共34页 一、实验原理第3页/共34页亲和层析 生物大分子与配体特异非共价可逆结合。酶-底物或底物类似物抗体-抗原激素-受体外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体核酸-互补核苷酸序列（Oligo-dT）第4页/共34页亲和层析原理第5页/共34页GST亲合层析 谷胱甘肽硫转移酶（GST，26kd，与谷胱甘肽GSH特异结合）GSH作为配体，共价结合在葡聚糖上，（Sepharose 4B）GST融合目标蛋白葡聚糖上的GSH与GST融合蛋白结合用还原型GSH洗脱GST融合蛋白第6页/共34页GSH-Sepharose 4B第7页/共34页GSH-Sepharose 4B第8页/共34页第9页/共34页第10页/共34页外源蛋白的表达和纯化第11页/共34页 二、实验步骤第12页/共34页第13页/共34页 （一）目标蛋白诱导表达和菌体收集 10.5 mmol/L IPTG诱导大肠杆菌中的蛋白表达，28，200 rpm培养3-6 h。25000 rpm离心5 min，倒掉上清。3沉淀加40 ml水，5000 rpm离心5 min。第14页/共34页（二）细胞破碎1倒掉上清，加30 ml PBS缓冲液悬浮菌体。2破碎菌体，超声波2 min，停止1 min。（菌液始终保持在冰浴中）3重复8-10遍，直至菌液清澈。第15页/共34页（三）离心1每个小组分取1-2 ml细胞破碎液，12000 rpm，离心5 min。2分取50 uL上清液，4保存。3其余的上清液准备过GST柱子。第16页/共34页（四）装GST柱子1清洗和装好层析柱，封闭出口。2加入2 mL PBS。3用滴管取0.5-1 ml GST填料，加入柱子中。4打开柱子出口，使PBS缓慢流出。注意：始终保持柱内的液面高于GST树脂。第17页/共34页（五）纯化目的蛋白1用5 ml PBS缓冲液洗柱床，重复3遍。2将混合蛋白质溶液加到柱子中。3用5 ml PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。4加入1ml 洗脱液。第18页/共34页5用离心管收集洗脱液，每管收集0.2ml。6PBS 缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。7用分光光度计测定每一管的吸光度值，记录读数，绘制洗脱曲线。8将读数最大的一管用于SDS-PAGE分析。第19页/共34页第二部分SDS-PAGE检测目标蛋白第20页/共34页 一、实验原理第21页/共34页蛋白质与SDS按1：1.4比例形成复合物，消除了蛋白质间原有的电荷差异。蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在15-200 KD之间，迁移率和分子量的对数呈线性关系：log MW=K-bm第22页/共34页第23页/共34页浓缩胶浓缩胶pH6.8，Gly pI6.0，三类离子在电场中的迁移速度：Cl-蛋白质Gly-。电泳时，Cl-快，Gly-慢，在快慢离子间形成了一个低离子浓度的高压区，区内的蛋白质加速移动。当蛋白质移到Cl-区时，高电压消失，蛋白质的移动速度减慢，在快慢离子间被浓缩。第24页/共34页二、实验步骤1洗净玻璃板，用蒸馏水冲洗干净后吹干，安装制胶器。2根据下列配方制作12%分离胶。第25页/共34页12%分离胶试剂名称试剂名称12%分离胶分离胶蒸馏水蒸馏水2.5 ml30%丙烯酰胺（丙烯酰胺（29:1）3.0 ml1.5M Tris-HCl（pH8.8）2.0 ml10%SDS75 ul四甲基乙二铵四甲基乙二铵（TEMED）10 ul10%过硫酸铵（过硫酸铵（AP）75 ul总体积总体积7.5 ml第26页/共34页按上表中所列顺序加试剂，加完AP后轻轻摇匀，迅速加入两块玻璃板间。在分离胶液面上缓慢滴加1 mL蒸馏水，聚合15 min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倒掉水层，用滤纸条吸干残余的水。第27页/共34页试剂名称试剂名称5.0%蒸馏水蒸馏水1.7 ml30%丙烯酰胺（丙烯酰胺（29:1）430 ul1M Tris-HCl（pH6.8）310 ul10%SDS25 ul四甲基乙二铵四甲基乙二铵（TEMED）10 ul10%过硫酸铵（过硫酸铵（AP）25 ul总体积总体积2.5 ml3制作5.0%浓缩胶 按照下表配好浓缩胶，轻轻混匀，灌胶2ml，插入梳子，聚合15 min。第28页/共34页4把胶板放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，拔掉梳子，电极缓冲液应该完全没过电极。5每个点样孔加30ul样品，每板胶加10ul Marker。650V电泳20min，等蛋白进入分离胶后，将电压调节到80V，电泳2-3h。7等到溴酚蓝接近胶底部时，关闭电源。第29页/共34页8撬开玻璃板，将凝胶放在塑料盒内，加入染色液，染色30min。9染色后的凝胶用蒸馏水漂洗，用脱色液脱色。（或用蒸馏水加热脱色）第30页/共34页pGEX-4T-3 纤维素酶的纯化非诱导非诱导诱导诱导纯化纯化1 纯化纯化2 Marker100KD75KD50KD32KD25KD15KD37，OD=0.8，0.5mmol/L，IPTG，28，200rpm，6h第31页/共34页SDS-PAGE样品制备 1号样，过亲和层析柱前的蛋白质溶液25uL，加5uL 5X上 样缓冲液。2号样，分离纯化后的蛋白质溶液25uL，加5uL 5X上样缓冲液 3号样，蛋白质分子量标准，老师准备。第32页/共34页标准蛋白质分子量（marker）兔磷酸化酶B 97400牛血清白蛋白 66200兔肌动蛋白 43000牛碳酸酐酶 31000胰蛋白酶抑制剂 20100鸡蛋清溶菌酶 14400第33页/共34页感谢您的观看！第34页/共34页