实时荧光定量PCR技术详解和总结概述.pptx

实时荧光定量实时荧光定量PCR技术详解和总结概述技术详解和总结概述目录实时定量实时定量实时定量实时定量PCRPCRPCRPCR基本原理基本原理基本原理基本原理实时定量实时定量实时定量实时定量PCRPCRPCRPCR实验材料实验材料实验材料实验材料实时定量实时定量实时定量实时定量PCRPCRPCRPCR实验方法实验方法实验方法实验方法实时定量实时定量实时定量实时定量PCRPCRPCRPCR实验结果实验结果实验结果实验结果第1页/共22页实时定量PCR基本原理1实时定量PCR的定义2实时定量PCR标准曲线第2页/共22页定量定量定量定量PCRPCR技术：利用技术：利用技术：利用技术：利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCRPCRPCRPCR扩增反应中扩增反应中扩增反应中扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对最终精确的对最终精确的对最终精确的对起始模板起始模板起始模板起始模板的定量分析的定量分析的定量分析的定量分析实时定量PCR的定义第3页/共22页定量PCR三个基本概念扩增曲线扩增曲线扩增曲线扩增曲线指数增长期 平台期线性增长期背景期第4页/共22页阈值与C(t)值阈值：阈值：阈值：阈值：是循环开始是循环开始是循环开始是循环开始3 31515个循环的荧光信号的标准偏差个循环的荧光信号的标准偏差个循环的荧光信号的标准偏差个循环的荧光信号的标准偏差的的的的10101010倍，设定在倍，设定在倍，设定在倍，设定在扩增曲线扩增曲线扩增曲线扩增曲线指数增长期指数增长期C(t)C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩扩增循环次数增循环次数Threshold line C(t)value C(t)value18.12+/-0.04Threshold line C(t)value C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04第5页/共22页定量PCR的数学原理理想的理想的理想的理想的PCRPCRPCRPCR反应：反应：反应：反应：X X X Xn n n n=X=X=X=X0 0 0 02222n n n n非理想的非理想的非理想的非理想的PCRPCRPCRPCR反应：反应：反应：反应：X X X Xn n n n=X=X=X=X0 0 0 0(1+Ex)(1+Ex)(1+Ex)(1+Ex)n n n n方程式两边同时取对数得方程式两边同时取对数得:log Xlog Xn n=log(X=log(X0 0(1+Ex)(1+Ex)n n)整理方程式得整理方程式得:log Xlog X0 0=(-log(1+Ex)n+log X=(-log(1+Ex)n+log Xn n将将C(t)C(t)和达到和达到C(t)C(t)值时终产物的值时终产物的量量Xc(t)带入上式得：带入上式得：log Xlog X0 0=(-log(1+Ex)=(-log(1+Ex)C(tC(t)+log)+log Xc(t)Xc(t)初始浓度的对数与循环数呈线性关系初始浓度的对数与循环数呈线性关系初始浓度的对数与循环数呈线性关系初始浓度的对数与循环数呈线性关系n n：扩增反应的循环次数：扩增反应的循环次数X Xn n：第：第n n次循环后的产物量次循环后的产物量X X0 0：初始模板量：初始模板量ExEx：扩增效率：扩增效率第6页/共22页荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线循环数标准曲线10410310610510210初始模板量越多，初始模板量越多，C(t)C(t)值越小值越小C(t)C(t)C(t)C(t)与初始与初始与初始与初始模板浓度的对数值成线性关系模板浓度的对数值成线性关系模板浓度的对数值成线性关系模板浓度的对数值成线性关系实时定量PCR标准曲线第7页/共22页定量原理浓度的对数值浓度的对数值浓度的对数值浓度的对数值与与与与循环数循环数循环数循环数呈线性关系，根据样品呈线性关系，根据样品呈线性关系，根据样品呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数扩增达到域值的循环数扩增达到域值的循环数扩增达到域值的循环数（CtCt值）就可分析样品值）就可分析样品值）就可分析样品值）就可分析样品中起始模板量中起始模板量中起始模板量中起始模板量第8页/共22页定量PCR的实验步骤1 1 1 1标准菌株标准菌株标准菌株标准菌株DNADNADNADNA的提取的提取的提取的提取2 2 2 2QPCRQPCRQPCRQPCR探针和引物的设计探针和引物的设计探针和引物的设计探针和引物的设计3 3 3 3阳性克隆质粒的构建阳性克隆质粒的构建阳性克隆质粒的构建阳性克隆质粒的构建4 4 4 4荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCRPCRPCR反应反应反应反应5 5 5 5定量标准曲线定量标准曲线定量标准曲线定量标准曲线6 6 6 6重复性实验重复性实验重复性实验重复性实验7 7 7 7灵敏性实验灵敏性实验灵敏性实验灵敏性实验第9页/共22页实验材料实验材料第10页/共22页第11页/共22页第12页/共22页第13页/共22页第14页/共22页第15页/共22页第16页/共22页第17页/共22页第18页/共22页第19页/共22页第20页/共22页第21页/共22页