Realtime PCR原理和应用学习.pptx

提纲 l实时荧光定量PCR原理l实时荧光定量PCR的定量方法l平台定量PCR仪器介绍第1页/共26页实时荧光定量PCR的定义定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法第2页/共26页与普通PCR的区别l普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析l实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量第3页/共26页起点定量和终点定量l起始DNA量是“天然”的量，更有意义；终点DNA量是经过PCR“加工”后的量，存在部分失真l起点定量重现性好，终点定量误差较大第4页/共26页扩增曲线：四个阶段对数图谱第5页/共26页扩增曲线：四个阶段线性图谱第6页/共26页一些主要概念什么是基线？基线就是扩增曲线中的水平部分线性图谱对数图谱第7页/共26页l荧光阈值：是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线荧光信号的标准偏差的10倍lCT值：是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数l拷贝数：DNA（包括质粒）拷贝数通常指生长在标准的培养基下每个细菌或者细胞中所含有的DNA分子的数目一些主要概念第8页/共26页基线和域值第9页/共26页CT值第10页/共26页标准曲线由此可见，Ct值与模板DNA的起始拷贝数成反比第11页/共26页荧光定量PCR化学原理SYBRGreenI荧光染料TaqMan探针第12页/共26页lSYBRGreenI是一种只与双链DNA小沟结合的染料lSYBRGreenI只有和双链DNA结合后才发出荧光，变性时DNA双链分开，无荧光l在延伸结束阶段采集荧光信号SYBRGreenI荧光染料第13页/共26页SYBRGreenI工作原理变性退火延伸l每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去，染料一结合，就产生荧光信号l信号强度与DNA分子总数目成正比第14页/共26页SYBR Green I 荧光染料法的优缺点l优点：1、对DNA模板没有选择性，适用于任何DNA2、不必设计复杂探针3、价格便宜l缺点：1、容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性2、对引物特异性要求较高第15页/共26页TaqMan探针法l5端标记有荧光报告基团（Reporter，R），如FAM、VIC等l3端标记有荧光淬灭基团（Quencher，Q）l探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，则发出荧光lTaq酶有53外切核酸酶活性，可水解探针第16页/共26页TaqMan探针法工作原理第17页/共26页l每产生一条DNA链，就切断一条探针l每切断一条探针，就产生一个单位信号l信号强度与结合探针的DNA分子数成正比TaqMan探针法工作原理第18页/共26页l优点：1、对目标序列的高特异性2、引物设计相对简单3、重复性比较好l缺点：1、只适合一个特定的目标2、价格昂贵TaqMan探针法的优缺点第19页/共26页如何对未知拷贝数的模板进行定量第20页/共26页平台PCR仪介绍Rotor-Gene6000特征：36孔（0.2mlPCR管）或者72孔（特殊0.1mlPCR管），离心式检测第21页/共26页平台PCR仪介绍AppliedBiosystems7500特征：可以使用96孔板，样品量大，也可以使用8连管第22页/共26页PCR扩增原理第23页/共26页Real-time PCR探针工作原理第24页/共26页谢谢！第25页/共26页感谢您的观看！第26页/共26页