基因治疗2学习.pptx
1基因治疗分类体细胞(somatic cell)somatic cell)基因治疗生殖细胞(germline)germline)基因治疗v只限于某一体细胞的基因的改变v只限于某个体的当代v对缺陷的生殖细胞进行矫正v当代及子代第1页/共41页2一、基因治疗的策略 内容提要二、基因转移技术 四、治疗基因的受控表达三、基因干预五、基因治疗的应用研究第2页/共41页3 一、基因治疗的策略一、基因治疗的策略The Strategy of Gene Therapy第3页/共41页4 （一）基因置换（一）基因置换（gene gene replacementreplacement）定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。第4页/共41页5又称为基因打靶(gene targeting）定点整合的条件:转导基因的载体与染色体上的DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换，使基因置换这一治疗策略得以实现。基因同源重组技术第5页/共41页6要要实实现现基基因因置置换换，需需要要采采用用同同源源重重组组技技术术使使相相应应的的正正常常基基因因定定向向导导入入受受体细胞的基因缺陷部位。体细胞的基因缺陷部位。n定向导入的发生率约1/100万，采用胚胎干细胞培养的方法，这种同源重组的检出率最高可达1/10。第6页/共41页7（二）（二）基因添加基因添加 基因添加或称基因增补（gene augmentation）:通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。类型:n在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；n向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。第7页/共41页8（三）基因干预（三）基因干预基因干预基因干预（gene interferencegene interference）:采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。不能表达，以达到治疗疾病的目的。第8页/共41页9（四）自杀基因治疗（四）自杀基因治疗自杀基因治疗自杀基因治疗:恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。原原理理:将将“自自杀杀”基基因因导导入入宿宿主主细细胞胞中中，这这种种基基因因编编码码的的酶酶能能使使无无毒毒性性的的药药物物前前体体转转化化为为细细胞胞毒毒性性代代谢谢物物，诱诱导导靶靶细细胞胞产产生生“自自杀杀”效效应应，从从而而达到清除肿瘤细胞的目的。达到清除肿瘤细胞的目的。第9页/共41页10自杀基因的作用机制 第10页/共41页11TK/GCVTK/GCV 单单纯纯疱疱疹疹病病毒毒（herps herps simplex simplex virus,virus,HSVHSV）型型胸胸苷苷激激酶酶（thymidine thymidine kinase,kinase,tktk）基基因因编编码码胸胸苷苷激激酶酶，特特异异性性地地将将无无毒毒的的核核苷苷类类似似物物丙丙氧氧鸟鸟苷苷（ganciclovir,ganciclovir,GCVGCV）转转变变成成毒毒性性GCVGCV三三磷磷酸酸核核苷苷，后后者者能能抑抑制制DNADNA聚聚合合酶酶活活性性，导导致致细细胞胞死死亡。亡。CD/5-FC 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,CD）基因，在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）转变成毒性产物5-氟尿嘧啶（5-FU）。1.自杀基因系统第11页/共41页12 旁观者效应:“自杀基因”治疗不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。2.旁观者效应第12页/共41页13（五）基因免疫治疗（五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。第13页/共41页14二、基因转移技术二、基因转移技术 The Technique of Gene Transfer第14页/共41页15基因治疗的两种途径基因治疗的两种途径载体目的基因in vivoex vivo靶细胞第15页/共41页16 基因转移基因转移(gene transfer)gene transfer)技术：技术：1.病毒介导的基因转移系统。2.非病毒介导的基因转移系统。第16页/共41页17 1.1.病毒介导的基因转移系统病毒介导的基因转移系统 病毒载体介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体。第17页/共41页18Retrovirus （1）逆转录病毒 第18页/共41页19第19页/共41页20（1 1）两端各有一长末端重复序列）两端各有一长末端重复序列LTRLTR。逆转录病毒前病毒的结构特点 （2）LTR由U3、R和U5三部分组成。（3）病毒有三个结构基因（4）5端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（）及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。（5）含有负链DNA转录的引物结合位点(PBS)和正链DNA转录的引物结合位点(PPT)。(1)在U3内有增强子和启动子；(2)U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS)；(3)在R内还有poly(A)加尾信号。(1)gag基因，编码核心蛋白和属特异性抗原；(2)pol基因，编码逆转录酶；(3)env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。第20页/共41页21第21页/共41页22逆转录病毒介导的基因转移系统逆转录病毒介导的基因转移系统由两部分组成：由两部分组成：(1)逆转录病毒载体 (2)辅助细胞株(如PA317)第22页/共41页23Retroviral packaging system第23页/共41页24 逆转录病毒载体的特点逆转录病毒载体的特点 逆转录病毒包膜上由env编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。第24页/共41页25 逆转录病毒载体的主要缺点逆转录病毒载体的主要缺点 随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳7 kb以下的外源基因。第25页/共41页26 （2 2）腺病毒）腺病毒(adenovirusadenovirus，AV)AV)载体载体 腺病毒是一种大分子腺病毒是一种大分子(36(36 kb)kb)双链无包膜双链无包膜DNADNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。第26页/共41页27第27页/共41页28腺病毒的优点腺病毒的优点1.基因导入效率高，对人类安全；2.宿主范围广；3.基因转导与细胞分裂无关；4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；5.腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因；第28页/共41页29 腺病毒载体缺点腺病毒载体缺点2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。3.有两个环节可能产生复制型腺病毒。4.靶向性差。1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。(1)腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同源重组；(2)腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。第29页/共41页30 （3 3）腺病毒相关病毒载体）腺病毒相关病毒载体 腺病毒相关病毒腺病毒相关病毒(adenovirus associated virusadenovirus associated virus，AAV)AAV)是一类单链线状是一类单链线状DNADNA缺陷型病毒。其基因组缺陷型病毒。其基因组DNADNA小于小于5 5 kbkb，无包膜，外形为裸露的无包膜，外形为裸露的2020面体颗粒。面体颗粒。AAVAAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染潜伏感染。AAV Virus Particles第30页/共41页31Structure of AAV Virus Genomic DNAREP:病毒复制基因,CAP:编码衣壳蛋白的基因第31页/共41页32AAVAAV的特点的特点 以潜伏感染为主；以潜伏感染为主；病毒基因组与细胞共存；病毒基因组与细胞共存；只要宿主细胞正常，只要宿主细胞正常，AAVAAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；若细胞受刺激，表达应激基因，若细胞受刺激，表达应激基因，AAVAAV基因表达从而使基因表达从而使AAVAAV病毒复制；病毒复制；产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。第32页/共41页33 AAV AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。载体，它对人类无致病性。AAV AAV可以高效可以高效定点整合定点整合至人至人1919号染色体的号染色体的特定区域特定区域1919q13.4q13.4中，并能较稳定地存在。这种中，并能较稳定地存在。这种靶向定点整合可以避免随机整合可能带来的抑靶向定点整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。体两者的优点。第33页/共41页34 AAVAAV载体的缺陷：载体的缺陷：AAVAAV载体容量小，目前最多只能容载体容量小，目前最多只能容纳纳5 5 kbkb外源外源DNADNA片段；片段；感染效率比逆转录病毒载体低。感染效率比逆转录病毒载体低。在在40%-80%40%-80%的成人中存在过感染，的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。可能会引起免疫排斥。第34页/共41页35 2.2.非病毒载体介导的基因转移系统非病毒载体介导的基因转移系统 （1 1）脂质体介导的基因转移技术）脂质体介导的基因转移技术 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。基本原理基本原理:利用阳离子脂质体单体与利用阳离子脂质体单体与DNADNA混合后，可以自动形成包埋外源混合后，可以自动形成包埋外源DNADNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNADNA（即目即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。的基因）转移至细胞内，并进行表达。第35页/共41页36 脂质体介导的基因转移示意图第36页/共41页37（2 2）受体介导转移技术）受体介导转移技术 将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。第37页/共41页38受体介导转移技术示意图第38页/共41页39 （3 3）基因直接注射技术）基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因基因DNADNA注入动物肌肉或某些器官组织内。注入动物肌肉或某些器官组织内。动物实验表明：接受注射外源动物实验表明：接受注射外源DNADNA的小鼠能够的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。久。1.1.将促进心脏血管生长的基因直接注入实验将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%30%40%40%；2.2.将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；分泌糖尿病所缺少的胰岛素；3.3.肌内注射凝血因子肌内注射凝血因子基因，可产生血友病基因，可产生血友病所需的凝血因子等等。所需的凝血因子等等。第39页/共41页40 基因直接注射法的优点基因直接注射法的优点1.制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易；2.排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；3.导入的基因不需整合即可表达，避免了逆转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点；4.基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。第40页/共41页41感谢您的观看。第41页/共41页
