分子分型方法在流行病学调查中的应用景怀琦.pptx

细菌的分子分型方法的分子分型方法近年来分子生物学技术在各个方面得到广泛地应用，这些技术渗透到流行病学之中，形成了一门新的分支学科 分子流行病学。分子流行病学中重要的一点是利用合适的分型方法对分离到的病原进行分析。第1页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法一种方法是否能应用于分子分型以及其分型效果如何大致可以从以下几个方面考虑：第2页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法1、分型力 是指对所分析菌株能够得到明确的阳性结果的能力。2、重复性 是指当重复测试相同菌株时能够得到相同结果。3、鉴别能力 是指区别非相关菌株的能力。理想的分型方法应该能识别每一无关的分析菌株。4、结果易于解释 这是非常重要的。5、快速、廉价、技术简单。第3页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法肠道致病性的分型技术大致如下：1、表现型分型方法。抗生素敏感性噬菌体分型第4页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法2、基因分型技术，A 质粒图谱分析B 以PCR为基础的分型方法，如随机扩增多态性分析法（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）；C 限制性片段长度多态性（RFLPs）的Southern Blot分析。D 脉冲场凝胶电泳方法（PFGE）。第5页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法1、抗生素敏感性试验抗生素敏感性测试是临床微生物实验室常规应用的方法，手工和自动的方法都可以做到，也可以进行严格地质量控制。操作简单，相对经济。第6页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法如果要进行详尽的流行病学分析，抗生素敏感性试验资料的用途就相对有限了。这不仅是因为表现型有变种的存在，更是因为现代的医院中，存在中非常大的抗生素的选择压力。一个特定的菌株，可以通过多种遗传学机制，“突然”对某种抗生素表现出抗性。第7页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法另一方面，如果没有特定的选择压力，这些遗传元件也可以丢失（如R因子）。所以，不同的菌株可能具有相同的抗性图谱，在患者不同时期分离到的同一种细菌菌株，也可能会表现出不同的抗生素敏感性图谱。第8页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法噬菌体分型分析 噬菌体裂解细菌细胞具有一定的特异性。一些噬菌体只能感染一个种或属的细菌，一些噬菌体可以裂解同一种细菌的不同株。因此，可以利用不同噬菌体的裂解细菌细胞的特异性，可以分离、筛选一组噬菌体，用于传染源的追踪和菌株的分析。第9页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法缺点是除了一些参比实验室外，很少实验室能拥有种类比较完全的噬菌体，在应用方面受到了很大的限制。其次，噬菌体分型技术的要求比较严格，需要经验丰富的工作人员。同时，噬菌体分型常常会遇到多样性结果，需要仔细推敲。还有，使用认可的噬菌体，许多菌株不能获得满意的结果，不得不考虑使用其它噬菌体，给结果的分析带来困难。第10页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法英国把噬菌体分析和PFGE方法结合使用，对E.coli O157：H7大肠杆菌进行分型。可以把E.coli O157：H7大肠杆菌至少分为66个噬菌体型。小肠结肠炎耶尔森菌亦可用噬菌体分型。第11页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法基因分型技术质粒图谱方法 最先应用于流行病学研究的以DNA为基础的技术就包括质粒的分析。分别提取分离菌株的质粒DNA，在琼脂糖凝胶上电泳分离，测定质粒的数目及大小。该方法简单经济，易于推广。临床分离的E.coli O157：H7大多数菌株都含有质粒，可以应用质粒图谱法来进行分型。第12页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法然而，细菌的质粒可以自发丢失（如小肠结肠炎耶尔森菌质粒的自然丢失率在10%左右，且这种丢失是不可逆的）、获得质粒。还可以在细菌之间进行接合转移，这就使得质粒图谱分析的结果有时候难以解释。另一个问题是质粒DNA构型可能发生改变。第13页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法此外，使用质粒图谱分析方法不能够区分那些分子量相同而DNA序列不同的质粒，或分子量不同而有较高同源性的质粒。针对这一情况，人们把质粒用限制性内切酶消化，再用电泳分析限制性片段的数目和大小，这样质粒分析的可重复性和分辨力都会得到很大的提高。第14页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法 基于PCR的分型系统随机引物PCR（AP-PCR），也就是随机扩增多态性DNA分析（RAPD）。使用那些不针对任何已知遗传位点的短引物（通常8-10bp），可以随机地与染色体DNA结合，并有足够的亲和力启动聚合酶反应。第15页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法然而，在实践中，用AP-PCR获得可重复的高分辨力的结果还存在一定的困难。第一，如果条带的强弱可以证明菌株之间的差异时，我们很难比较和解释图谱；第二，由于某些产物可能代表效率相对低的反应，技术因素的微小改变就可以导致不同的扩增反应中一个特定菌株产生的实际片段差别很大。第16页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法另外一个影响RAPD可重复性的因素或许是由质粒编码的片段的扩增，质粒是可以丢失或获得的，有文献报道质粒的影响很小。可重复性差是问题，导致了分辨力的降低，极大地妨碍了不同实验室之间结果的比较。一些报道提出使用固定浓度的纯化DNA可以提高可重复性，从而使此方法有了较好的应用，但操作起来很困难很烦琐。第17页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法扩增片段长度多态性分析（AFLP）技术。AFLP的原理：用特异性的酶将细菌染色体组消化之后，对其消化片段进行选择性扩增。第18页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法此技术包括三个步骤：（1）将DNA酶切，并在酶切片段两端连接上寡聚核苷酸接头，（2）对一组限制性片段进行选择性扩增，（3）对扩增片段进行凝胶分析。第19页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法其引物是根据接头和酶切位点的序列来确定的。由于其引物延伸至限制性片段内部，所以只有限制性位点两侧的核苷酸序列与引物延伸端匹配的片段才能被扩增，这样就实现了选择性扩增。使用这种方法，在不知道核苷酸序列的情况下，就可以应用PCR观察到一组限制性片段。第20页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法从理论上来讲，AFLP可以应用于所有的细菌且重复性和分辨力都好。有报道应用于E.coli O157：H7的分子分型。他们认为，AFLP技术可以作为E.coli O157：H7分子流行病学研究的一种方法。第21页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法核糖体分型（Ribotyping）Ribotyping指一种特殊的Southern Blot分析法。在此方法中，用与核糖体操纵单元有关的RFLP来对菌株进行分析。第22页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法总的来说，核糖体分型方法稳定、可重复。在一般情况下，来源于一个暴发的菌株有相同的核糖体型.。然而，流行病学上无相关性的菌株经常有相同的图谱，这就直接限制了该方法的应用.。第23页/共51页核糖体分型（Ribotyping）Ribotyping指一种特殊的Southern Blot分析法。在此方法中，用与核糖体操纵单元有关的RFLP来对菌株进行分析。在国际上已有完全自动化的仪器，如美国杜邦公司生产的RiboPrinter Microbial Characterization System，操作快速简便，完全排除了人为因素对实验结果的影响，重复性好结果稳定。第24页/共51页其操作过程可简述为：将纯化的细菌培养物用仪器自带的取样棒蘸取并加入样品缓冲液中，置于热处理器上灭活，然后加入细胞裂解液使细菌DNA释放。按照操作程序打开仪器，将样品和试剂放到固定的位置，该仪器便可进行如下的自动操作：酶切电泳转膜，电泳和转膜同时完成。转好的膜与结合了化学发光物质的探针结合（杂交），数码照相系统通过捕获化学发光物质，对所发出的光进行拍照，这样我们即可得到最后的结果。第25页/共51页我们利用这一系统提供的核糖体基因DNA指纹的相似度值和鉴定结果，便可进行分型。我们利用本系统对我国分离的部分O：3，O：9小肠结肠炎耶尔森菌进行了分型，这种分型基本上和血清型相符合（见图）。第26页/共51页第27页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法五、脉冲电场凝胶电泳（PFGE）这一方法在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大DNA分子便滞留在爬行管里，直至沿新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移动。DNA分子越大，这种重排所需要的时间就越长。若DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNA分子就可以按其大小分开。第28页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法第29页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所第30页/共51页第31页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法尽管PFGE在许多病原体的分子流行病学研究中表现出很好的分辨能力，但是具体到应用它本身就存在着明显的缺点，此种方法耗时、耗力而且对设备的要求也很严格。况且，当PFGE的图形匹配得不是很好的时候，其结果依然难以解释。况且，也不能够仅仅以PFGE的结果为依据。第32页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法尽管如此，PFGE分析技术在O157：H7大肠杆菌的分子流行病学分析中得到了广泛的应用，也是目前最推崇的方法。美国CDC已经建立一个O157：H7的PFGE图谱的网上数据库，为疾病的监测和调查提供有力的依据和帮助。但是，目前这个数据库的使用还有着严格的限制，并非所有的科学家都能够使用。第33页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法在实际应用过程中，任何单一的方法所得出的结论都具有片面性，所以，联合应用几种方法是目前较为理想的分子分型方法。第34页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法这其中又以PFGE与其它方法相结合的效果为最佳，先用分辨力较低的方法进行初筛，然后用分辨力较高的方法进行进一步的分型，这是目前大多数实验室所采取的策略。随着科学技术的发展和进步，会有更好的方法问世。第35页/共51页细菌的分子分型方法的分子分型方法我国部分地区分离到的E.coli O157:H7菌株的PFGE图谱第36页/共51页E.coli O157：H7的分子分型方法的分子分型方法病人身上分离到的无毒株的E.coli O157：H7的PFGE图谱第37页/共51页E.coli O157：H7的分子分型方法的分子分型方法病人身上分离到的有毒株的E.coli O157：H7的PFGE图谱第38页/共51页E.coli O157：H7的分子分型方法的分子分型方法徐州地区E.coliO157:H7动物粪便分离株PFGE图谱第39页/共51页ICDC,China CDC第40页/共51页基因芯片的分子诊断研究基因芯片技术是90 年代兴起的一项前沿生物技术,它可以将生物学中许多不连续的分析过程,移植到固相的介质芯片上,并使其连续化和微型化。由于它横跨生命信息、生物物理等众多研究领域,涉及生命科学、化学、微电子技术、计算机科学、统计学和生物信息学等诸多自然学科,故已成为当今多学科交叉、综合的前沿研究热点。1 杂交模型的建立现有病原体的分子生物学检测方法通常需3648小时Real-time PCR可在1h内得到结果，但有其局限性基因芯片可同时检测多个病原体的许多参数选择的探针具有敏感、重复性好的杂交信号2 其它实验条件的探索和优化第41页/共51页 基因芯片的分子诊断研究 基本的技术路线 点样以及结果分析所用的仪器设备 1 点样仪 SDDC-2 arrayer（VIRTEK）-0,6 nl per spot(spacing=0,5 mm)-108 to 1013 oligonucleotides/l(105 to 1010 oligos/spot)2 扫描仪 ScanArray 4000XL（GSI Lumonics）第42页/共51页基因芯片的分子诊断研究探针和引物的设计与合成 引物在目的基因片段上的位置 第43页/共51页基因芯片的诊断开发工作探针的合成、修饰及固定 20 mers探针，5-端氨基修饰靶DNA的扩增与荧光标记 dUTP-Cy3PCR产物的纯化与测定第44页/共51页基因芯片的分子诊断研究杂交及检测 20 l 杂交混合液：6X SSPE，1%SBA，0.01%PVP，0.01%SDS，25%Formamide 13mm Hybri-well chamber芯片的清洗和干燥荧光扫描以及结果分析（ScanArray 4000XL，QuantArray software）第45页/共51页基因芯片的分子诊断研究 其它实验条件的探索和优化 1 简易芯片的制作 功能化的芯片比较昂贵（110$/片），Kumar et al(Nucleic Acids Res 28:e71,2000)等人报告了一种方法，可以把普通显微镜用载玻片经3-mercaptopropyl-trimethoxysilane活化后，与5-末端巯基(-SH)修饰的寡核苷酸直接结合，将捕获探针固定在载玻片上，此方法具有简单、快速、背景干扰小等优点。2 化学发光法检测的探索 通常，基因芯片的结果是通过数字化的激光扫描仪对荧光信号进行读取和分析的，如 Cy3,Cy5,Alexa594等。但荧光扫描仪价格昂贵而且我们的实验表明该技术在自动化方面有欠缺，为了适应临床实验室以及结合微流体（microfluidic）装置的应用，需要开展更简单的检测方法。-Western Blue 是 BCIP 和 NBT的混合物，便于应用并在室温下可保存12个月。-Vector Red 可产生红色沉淀物便于观察同时也可做荧光定量分析。第46页/共51页基因芯片的分子诊断研究3 珠子（microsphere）的标记用于扩大检测信号 珠子常用于诊断系统，可以在其表面包被一些基质，如核酸，蛋白质，染料等，或者通体（荧光）染色。珠子的直径可选0.1100m，我们实验了 0.49.3m等5种珠子。珠子可用于单个分子的检测，因而有望于杂交结果的检测而不用PCR扩增待检片段。第47页/共51页基因芯片的分子诊断研究表面带有COOH基团的珠子被 EDAC(1-ethyl-3-3-dimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride)活化后与蛋白质（streptavidin）的NH2共价结合，生物素化的基质从而可识别功能化的珠子。此方法敏感性极高，将会有很好的应用前途。第48页/共51页基因芯片的分子诊断研究 4 等温扩增(Isothermal amplification)根据我们的实验结果，不平衡PCR产物的杂交效率高于常规PCR。因此我们参考其它文献，试图建立一种单链DNA扩增方法。第49页/共51页第50页/共51页感谢您的观看！第51页/共51页