第八章蛋白质和氨基酸的测定.ppt

第八章第八章 蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定（一）测定方法概述（一）测定方法概述1、测定蛋白质含量的方法：、测定蛋白质含量的方法：凯氏定氮法凯氏定氮法快速测定法（双缩脲、紫外、水杨酸比色、快速测定法（双缩脲、紫外、水杨酸比色、染料结合法）染料结合法）2、测定氨基酸的方法：、测定氨基酸的方法：甲醛、电位滴定、茚三酮比色甲醛、电位滴定、茚三酮比色气相、液相、薄层、离子交换色谱、气相、液相、薄层、离子交换色谱、自动分析仪自动分析仪（二）凯氏定氮法（二）凯氏定氮法1 1、实验原理、实验原理以硫酸铜为催化剂，以硫酸铜为催化剂，用浓硫酸消化试样，用浓硫酸消化试样，使有机氮分解为氨，使有机氮分解为氨，与硫酸生成硫酸铵。与硫酸生成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨逸出，然后加碱蒸馏使氨逸出，用硼酸溶液吸收，再用用硼酸溶液吸收，再用盐酸标准溶液滴定。根盐酸标准溶液滴定。根据盐酸标准滴定溶液的据盐酸标准滴定溶液的消耗量计算蛋白质的含量。消耗量计算蛋白质的含量。2 2、实验步骤、实验步骤（1 1）试样的制备与称样（称）试样的制备与称样（称0.5-5g0.5-5g试样（含试样（含氮氮30-40mg30-40mg）放入凯氏烧瓶中）放入凯氏烧瓶中）（2 2）消化）消化 向凯氏烧瓶中依次加入硫酸铜向凯氏烧瓶中依次加入硫酸铜0.4g0.4g、硫酸、硫酸钾钾10g10g、硫酸、硫酸20mL20mL。将凯氏烧瓶放在电炉上，。将凯氏烧瓶放在电炉上，缓慢加热。待起泡停止，内容物均匀后，升高缓慢加热。待起泡停止，内容物均匀后，升高温度，保持液面微沸。当溶液呈蓝绿色透明时，温度，保持液面微沸。当溶液呈蓝绿色透明时，继续加热继续加热0.5-1h0.5-1h。取下凯氏烧瓶冷却至约。取下凯氏烧瓶冷却至约4040，缓慢加人适量水，摇匀，冷却至室温。，缓慢加人适量水，摇匀，冷却至室温。（3 3）蒸馏与吸收）蒸馏与吸收 将消化好并冷却至室温的消化溶液全部转移到将消化好并冷却至室温的消化溶液全部转移到100mL100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。向接收瓶内加入向接收瓶内加入30mL2%30mL2%硼酸溶液和硼酸溶液和1 1滴混合指示滴混合指示剂。将接收瓶置于蒸馏装置的冷凝管下口，使下口浸剂。将接收瓶置于蒸馏装置的冷凝管下口，使下口浸入硼酸溶液中。取入硼酸溶液中。取 100.05mL100.05mL稀释定容后的试液，稀释定容后的试液，沿小玻璃杯移入反应室。并用少量水冲洗小玻璃杯，沿小玻璃杯移入反应室。并用少量水冲洗小玻璃杯，一并移入反应室。塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加一并移入反应室。塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入约入约10mL40%10mL40%氢氧化钠溶液。提起玻璃塞，使氢氧化氢氧化钠溶液。提起玻璃塞，使氢氧化钠溶液缓慢流入反应室。立即塞紧玻璃塞，并在小玻钠溶液缓慢流入反应室。立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加水，使之密封。通入蒸汽，蒸馏璃杯中加水，使之密封。通入蒸汽，蒸馏5min5min。降低。降低接收瓶的位置，使冷凝管管口离开液面，继续蒸馏接收瓶的位置，使冷凝管管口离开液面，继续蒸馏1min1min。用少量蒸馏水冲洗冷凝管管口，洗液并入接收。用少量蒸馏水冲洗冷凝管管口，洗液并入接收瓶内。取下接收瓶。瓶内。取下接收瓶。(4)(4)滴定滴定 用用0.1mol/L0.1mol/L盐酸标准滴定溶液滴定收集液盐酸标准滴定溶液滴定收集液至刚刚出现紫红色为终点。至刚刚出现紫红色为终点。同一试样做两次平行实验，同时做空白实同一试样做两次平行实验，同时做空白实验。验。3 3、结果计算、结果计算 (V-V0)0.014cX(%)=-F100 m(10/100)方法二方法二 比色法比色法1 1、实验原理、实验原理食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在 pH 4.8pH 4.8的乙酸钠的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的酮和甲醛反应生成黄色的 3,5-3,5-二乙酰二乙酰-2,6-2,6-二甲基二甲基-1,4-1,4-二氢化吡啶化合物。在波二氢化吡啶化合物。在波长长 400 nm400 nm下测定吸光度值，与标准系列比下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。含量。2 2、实验步骤、实验步骤（1 1）试样的制备与称样（称）试样的制备与称样（称0.1-0.5g0.1-0.5g试样放入凯氏烧瓶试样放入凯氏烧瓶中）中）（2 2）消化、样品制备）消化、样品制备 向凯氏烧瓶中依次加入硫酸铜向凯氏烧瓶中依次加入硫酸铜0.1g0.1g、硫酸钾、硫酸钾1g1g、硫酸、硫酸5mL5mL。将凯氏烧瓶放在电炉上，缓慢加热。待起泡停止，。将凯氏烧瓶放在电炉上，缓慢加热。待起泡停止，内容物均匀后，升高温度，保持液面微沸。当溶液呈蓝绿内容物均匀后，升高温度，保持液面微沸。当溶液呈蓝绿色透明时，继续加热色透明时，继续加热0.5-1h0.5-1h。取下凯氏烧瓶冷却至约。取下凯氏烧瓶冷却至约4040，缓慢加人适量水，摇匀，冷却至室温。，缓慢加人适量水，摇匀，冷却至室温。将消化好并冷却至室温的消化溶液全部转移到将消化好并冷却至室温的消化溶液全部转移到100mL100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。吸取吸取2.00 mL2.00 mL5.00 mL5.00 mL试样或试剂空白消化液于试样或试剂空白消化液于50 50 mLmL或或100 mL100 mL容量瓶内，加容量瓶内，加1 1滴滴2 2滴对硝基苯酚指示剂溶液，滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色，再滴加乙酸溶液至摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色，再滴加乙酸溶液至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。(3)(3)标准曲线的绘制：标准曲线的绘制：吸取吸取0.00 mL0.00 mL、0.05 mL0.05 mL、0.10 mL0.10 mL、0.20 mL0.20 mL、0.40 mL0.40 mL、0.60 mL0.60 mL、0.80 mL 0.80 mL 和和1.00 mL1.00 mL氨氮标准氨氮标准使用溶液（相当于使用溶液（相当于0.00 g0.00 g、5.00 g5.00 g、10.0 g10.0 g、20.0 g20.0 g、40.0 g40.0 g、60.0 g60.0 g、80.0 g80.0 g和和100.0 100.0 gg氮）氮），分别置于，分别置于10 mL10 mL比色管中。加比色管中。加4.0 mL4.0 mL乙乙酸钠酸钠-乙酸缓冲溶液及乙酸缓冲溶液及4.0 mL4.0 mL显色剂，加水稀释至显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于刻度，混匀。置于100 100 水浴中加热水浴中加热15 min15 min。取。取出用水冷却至室温后，移入出用水冷却至室温后，移入1 cm1 cm比色杯内，以零比色杯内，以零管为参比，于波长管为参比，于波长400 nm400 nm处测量吸光度值，根据处测量吸光度值，根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。方程。(4)(4)试样测定试样测定 吸取吸取0.50 mL0.50 mL2.00 mL2.00 mL（约相当于氮（约相当于氮100 g100 g）试样溶液和同量的试剂空白溶）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于液，分别于10 mL10 mL比色管中。加比色管中。加4.0 mL4.0 mL乙酸乙酸钠钠-乙酸缓冲溶液及乙酸缓冲溶液及4.0 mL4.0 mL显色剂，加水稀显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于释至刻度，混匀。置于100 100 水浴中加热水浴中加热15 min15 min。取出用水冷却至室温后，移入。取出用水冷却至室温后，移入1 1 cmcm比色杯内，以零管为参比，于波长比色杯内，以零管为参比，于波长400 400 nmnm处测量吸光度值，试样吸光度值与标准处测量吸光度值，试样吸光度值与标准曲线比较定量或代入线性回归方程求出含曲线比较定量或代入线性回归方程求出含量。量。四、结果计算四、结果计算试样中蛋白质的含量按下式计算：试样中蛋白质的含量按下式计算：X=式中：式中：XX试样中蛋白质的含量，单位为克每百克（试样中蛋白质的含量，单位为克每百克（g/100gg/100g）；）；cc试样测定液中氮的含量，单位为微克（试样测定液中氮的含量，单位为微克（gg）；）；c c0 0试剂空白测定液中氮的含量，单位为微克（试剂空白测定液中氮的含量，单位为微克（gg）；）；V V1 1试样消化液定容体积，单位为毫升（试样消化液定容体积，单位为毫升（mLmL）；）；V V2 2制备试样溶液的消化液体积，单位为毫升（制备试样溶液的消化液体积，单位为毫升（mLmL）；）；V V3 3试样溶液总体积，单位为毫升（试样溶液总体积，单位为毫升（mLmL）；）；V V4 4测定用试样溶液体积，单位为毫升（测定用试样溶液体积，单位为毫升（mLmL）；）；mm试样质量，单位为克（试样质量，单位为克（g g）；）；(三三)快速测定法快速测定法 为满足生产过程的快速控制分析，减少环境污染、简便操为满足生产过程的快速控制分析，减少环境污染、简便操作省时，建立了快速测定方法作省时，建立了快速测定方法如：双缩脲法、紫外分光光度法、水杨酸比色法、染料结合法如：双缩脲法、紫外分光光度法、水杨酸比色法、染料结合法1 1、双缩脲法、双缩脲法（1 1）原理：双缩脲在碱性条件下，能与硫酸）原理：双缩脲在碱性条件下，能与硫酸铜铜结合生成红紫色结合生成红紫色络合物。蛋白质中含有肽键，与双缩脲结构相似，也呈此反应。络合物。蛋白质中含有肽键，与双缩脲结构相似，也呈此反应。在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比；在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比；maxmax=560nm=560nm可可用吸收光度法进行比色测定。用吸收光度法进行比色测定。（2 2）测定）测定标准曲线绘制标准曲线绘制 以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样，按蛋白质含量样，按蛋白质含量4040、5050、6060、7070、8080、9090、100100、110mg110mg称取称取样品样品8 8份于钠氏比色管中，各加入份于钠氏比色管中，各加入1mlCCl1mlCCl4 4（阻滞淀粉、还原糖、（阻滞淀粉、还原糖、色素、类脂物溶解，消除干扰）加入双缩脲试剂（酒石酸钾色素、类脂物溶解，消除干扰）加入双缩脲试剂（酒石酸钾钠，钠，KOH KOH，CuSO4CuSO4）50.00ml50.00ml振摇均匀（振摇均匀（10min10min）静置）静置1h1h，取上层，取上层清液离心清液离心5min5min，再测，再测maxmax=560nm=560nm时的时的A A（水作参比）（水作参比）样品测定样品测定 准确称取适量样品，同样方法测样品的准确称取适量样品，同样方法测样品的A A（3 3）计算）计算 x x蛋白质（）蛋白质（）=-100=-100 w wxx从标准曲线中查得蛋白质含量，从标准曲线中查得蛋白质含量，mgmgww测定样液相当样品质量，测定样液相当样品质量，mgmg（4 4）说明）说明高脂肪样品，先用醚抽出弃之高脂肪样品，先用醚抽出弃之若有不溶物可抽出蛋白质后再测若有不溶物可抽出蛋白质后再测2 2、水杨酸比色法、水杨酸比色法（1 1）原理）原理:样品中蛋白质经硫酸消化后转变为铵盐，与水杨酸样品中蛋白质经硫酸消化后转变为铵盐，与水杨酸钠作用生成蓝色化合物，在钠作用生成蓝色化合物，在maxmax=660nm=660nm处比色测定，求出含氮处比色测定，求出含氮量，计算蛋白质量，计算蛋白质（2 2）测定）测定:标准曲线标准曲线 吸取含氮吸取含氮2.5g/ml2.5g/ml的硫酸铵的硫酸铵（NHNH4 4）2 2SOSO4 4标准溶液标准溶液0 0、1.01.0、2.02.0、3.03.0、4.04.0、5.0ml5.0ml置于置于25ml25ml容容量瓶中，分别加入：空白酸溶液量瓶中，分别加入：空白酸溶液2ml P76.32ml P76.3（2 2）、磷酸盐缓冲、磷酸盐缓冲液液5ml5ml、加水至、加水至15ml15ml、水杨酸钠、水杨酸钠5ml5ml、36363737恒温水浴恒温水浴15min15min，加入次氯酸钠加入次氯酸钠2.5ml2.5ml，再在，再在36363737恒温恒温15min15min，加水至刻度，加水至刻度,maxmax=660nm=660nm测测A A 样品处理：称取样品处理：称取0.20.21.0g1.0g置于凯氏烧瓶中，置于凯氏烧瓶中，加入加入15ml15ml浓浓H H2 2SOSO4 4，0.5gCuSO0.5gCuSO4 4，4.5g4.5g无水硫酸钠，小火加热沸腾无水硫酸钠，小火加热沸腾后，进行消化，待溶液澄清，呈暗绿色时，冷却，移至后，进行消化，待溶液澄清，呈暗绿色时，冷却，移至250ml250ml容容量瓶中，定容。量瓶中，定容。样品测定：吸取样液样品测定：吸取样液5ml5ml（必要时稀释）以下（必要时稀释）以下步骤同上步骤同上“标准曲线标准曲线”操作操作 （3 3）计算）计算 XkXk含氮量（）含氮量（）=-=-100 蛋（）蛋（）=总氮（）总氮（）FF（6.256.25）m m106X-X-含氮量含氮量gg，k-k-样品稀释倍数，样品稀释倍数，m-m-样品质量，样品质量，g g（4 4）说明：）说明：消化样品，当天测定，重现性好消化样品，当天测定，重现性好.严格控制反应严格控制反应温度（温度（36363737）影响显色影响显色（四）氨基酸总量测定（四）氨基酸总量测定1 1、双指示剂甲醛滴定法（测定游离氨基酸）、双指示剂甲醛滴定法（测定游离氨基酸）有单指示剂滴定法、双指示剂滴定法有单指示剂滴定法、双指示剂滴定法单指示剂有：百里酚酞单指示剂有：百里酚酞,酚酞酚酞;双指示剂有：中性红双指示剂有：中性红百里酚酞百里酚酞其原理均是用甲醛与其原理均是用甲醛与NHNH2 2作用，使碱性消失，再用强碱滴定作用，使碱性消失，再用强碱滴定COOHCOOHR-CH-COOH +2HCHO R-CH-COOH NH2 N(CH2OH)2测定：测定：样品（溶液）（样品（溶液）（2030mg2030mg氨基酸氨基酸+H+H2 2O+3O+3滴中性红，用滴中性红，用0.1N 0.1N NaOHNaOH滴定至黄橙色滴定至黄橙色 （V V1 1）样品样品+中性甲醛中性甲醛+3+3滴百里酚酞，滴百里酚酞，摇，静摇，静1min1min，用，用0.1N 0.1N NaOHNaOH滴定至淡蓝色滴定至淡蓝色 （V V2 2）计算：计算：（V V2 2V V1 1）C0.014C0.014氨基酸态氮（氨基酸态氮（%）=-100=-100 W W式中：式中：V V1 1用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠的体积用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠的体积,V,V2 2用百里酚酞作指示剂滴定时耗氢氧化钠的体积用百里酚酞作指示剂滴定时耗氢氧化钠的体积2 2、电位滴定法、电位滴定法（1 1）原理：加入甲醛，固定氨基碱性。用酸）原理：加入甲醛，固定氨基碱性。用酸度计指示滴定终点，据加入甲醛后耗用度计指示滴定终点，据加入甲醛后耗用NaOHNaOH量量计算蛋白质计算蛋白质适用于混浊及色深样品的直接滴定。适用于混浊及色深样品的直接滴定。（2 2）测定：）测定：样液用样液用NaOHNaOH滴定至滴定至pH=7.5pH=7.58.28.2加入中性加入中性2020甲醛后，用甲醛后，用NaOHNaOH滴至滴至pH=9.2pH=9.2同时作空白试验同时作空白试验（3 3）计算：）计算：氨基酸（）氨基酸（）=3 3、茚三酮比色法、茚三酮比色法（1 1）原理）原理氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用生成蓝紫色化合氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用生成蓝紫色化合物，物，maxmax=570nm=570nm其颜色深浅与氨基酸含量成正比。其颜色深浅与氨基酸含量成正比。（2 2）测定）测定准确吸取准确吸取100g/ml100g/ml氨基酸标准溶液氨基酸标准溶液0.00.0、1.01.0、2.02.0、3.03.0、4.04.0、5.05.0、6.0ml6.0ml至比色管中，补加水至相同体至比色管中，补加水至相同体积。加入茚三酮、磷酸缓冲液各积。加入茚三酮、磷酸缓冲液各1ml1ml，水浴中加热，水浴中加热15min15min。加水至（或转入容量瓶中）。加水至（或转入容量瓶中）25ml25ml，静置，静置15min15min。在在570nm570nm下以空白液为参比液，测下以空白液为参比液，测A A，绘制标准曲线。，绘制标准曲线。样品测定样品测定吸取样液吸取样液1 15ml5ml，用同样条件下测，用同样条件下测A A，查出氨基酸，查出氨基酸gg（3 3）计算）计算 X X氨基酸总量氨基酸总量（mg）=-100 m1000（五）个别氨基酸的测定（五）个别氨基酸的测定 例：游离赖氨酸的测定例：游离赖氨酸的测定原理原理赖氨酸与茚三酮在赖氨酸与茚三酮在pHpH3 3的专一显色反应，在的专一显色反应，在=475nm=475nm处测处测A A，分析范围，分析范围=0.075=0.0750.2mg/ml0.2mg/ml测定测定a a 标准曲线标准曲线 在试管中分别加入赖氨酸标准溶液在试管中分别加入赖氨酸标准溶液（0.2mg/ml0.2mg/ml）0.750.75、1.01.0、1.251.25、1.51.5、1.751.75、2.0ml2.0ml各补足至各补足至2.0mL2.0mL，加入，加入4mL4mL茚三酮试剂茚三酮试剂,=475nm,=475nm处，处，测测A Ab b 待测液测定待测液测定 吸取待测液吸取待测液2ml2ml，加，加4mL4mL茚三酮试剂，茚三酮试剂，=475nm,=475nm,测测A A（茚三酮试剂（茚三酮试剂茚三酮茚三酮1.25g+94mL1.25g+94mL乙二醇甲醚；乙二醇甲醚；+CuCl+CuCl2 22H2H2 2O 1.7g+32mL0.1MO 1.7g+32mL0.1M柠檬酸）柠檬酸）（六）氨基酸的分离与测定（六）氨基酸的分离与测定1、薄层色谱法、薄层色谱法2、氨基酸自动分析仪、氨基酸自动分析仪（1）原理：采用阳离子交换树脂、利用氨基酸的）原理：采用阳离子交换树脂、利用氨基酸的酸碱性、极性、分子量大小不同在色谱柱上进行酸碱性、极性、分子量大小不同在色谱柱上进行分离，用茚三酮显色，再定量测定。分离，用茚三酮显色，再定量测定。（2）样品预处理：如何处理？（纯化、水解）样品预处理：如何处理？（纯化、水解）（3）测定：得图）测定：得图P157图图8-3（4）结果计算：？）结果计算：？3、气相色谱法、气相色谱法（1）原理：？）原理：？（2）测定：）测定：样品预处理样品预处理 色谱测定色谱测定 定性测定定性测定 定量测定定量测定4、高效液相色谱法、高效液相色谱法（1）原理：？）原理：？（2）测定：）测定：样品预处理？样品预处理？色谱测定？色谱测定？定性测定（定性测定（P160图图8-4）？）？定量测定？定量测定？（3）结果计算）结果计算思考题：思考题：1 1、一般用什么方法测定食品中的蛋白、一般用什么方法测定食品中的蛋白质含量？写出其实验原理，实验步骤、质含量？写出其实验原理，实验步骤、计算方法。计算方法。2 2、快速测定蛋白质的方法有哪些？、快速测定蛋白质的方法有哪些？（只要求写出测定方法名称（只要求写出测定方法名称）