菌种鉴定流程精选课件.ppt

关于菌种鉴定流程关于菌种鉴定流程第一页，本课件共有124页1 120052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室2 2菌种分离鉴定流程菌种分离鉴定流程n n增菌增菌n n分纯分纯n n初步鉴别试验初步鉴别试验n n革兰染色革兰染色n n生化试验生化试验n n酶类试验酶类试验n n抗生素敏感性试验（用于菌种鉴抗生素敏感性试验（用于菌种鉴定）定）n n全面鉴定全面鉴定n n血清分型血清分型n n毒素分析毒素分析n n基因分型基因分型n n蛋白组分析蛋白组分析n n自动化仪器分析（生化，酶学，基因自动化仪器分析（生化，酶学，基因序列等）序列等）第二页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室3 32 2 供试品的制备供试品的制备n n参看药典微生物限度检查法n n有抑菌活性的检品应进行预处理有抑菌活性的检品应进行预处理n n稀释法稀释法n n离心沉淀集菌法离心沉淀集菌法 3000r/min3000r/min离心离心30min30min，有有不溶性沉渣先不溶性沉渣先500r/min500r/min离离心心5min5minn n薄膜过滤法薄膜过滤法 0.45um0.45um 0.02 100ml 0.02 100mln n中和法中和法 磺胺类磺胺类100ml100ml中中15ml1%15ml1%对氨基苯甲酸；砷汞，硫乙醇酸对氨基苯甲酸；砷汞，硫乙醇酸盐；洗必泰，聚山梨醇酯盐；洗必泰，聚山梨醇酯8080n n自然沉降法自然沉降法 难溶于水的抗菌制剂难溶于水的抗菌制剂n n同时做阳性和阴性对照同时做阳性和阴性对照n n了解常用的培养方法和常用培养基上各控制菌菌落特征，知道如何进行菌种分纯，以便于进行下面的试验第三页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室4 43 3 革兰染色、镜检革兰染色、镜检n n3.1 操作步骤n n3.1.1 制片-过火固定，避免水冲，破坏细胞结构使染料易透过n n3.1.2 结晶紫染色-1分n n3.1.3 碘液媒染-1分n n3.1.4 乙醇脱色-30秒n n3.1.5 沙黄复染-30秒第四页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室5 53.2 3.2 染色结果染色结果n n革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。可以分别用金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌作质控株第五页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室6 63.3 3.3 革兰染色注意事项革兰染色注意事项n n3.2.1 玻片必须洁净n n3.2.2 涂片菌量宜少，菌不可浓n n3.2.3 新鲜培养物n n3.2.4 脱色是关键第六页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室7 73.3 3.3 革兰染色意义革兰染色意义n n3.3.1 初步识别细菌，利于进一步鉴定n n3.3.2 初步选择治疗用药物n n3.3.3 与致病性相关，阳性以外毒素为主，阴性菌以内毒素为主第七页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室8 84 4 触酶试验触酶试验n n触酶试验不应当在含血的碟子上（用上面的菌落试验应小心）进行因为红细胞中含有触酶可能导致假阳性出现n n用于检测细菌是否生成过氧化氢酶，是否利于在有氧环境中生长n n细菌在有环境中代谢可以生成超氧离子和过氧化氢，细菌在有环境中代谢可以生成超氧离子和过氧化氢，具有杀菌作用，能生成触酶的菌种容易耐氧。但厌氧具有杀菌作用，能生成触酶的菌种容易耐氧。但厌氧菌有产生触酶者，某些非厌氧菌触酶也不产生（链球菌有产生触酶者，某些非厌氧菌触酶也不产生（链球菌，此试验可用于菌种鉴别）菌，此试验可用于菌种鉴别）第八页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室9 9第九页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室10105 5 氧化酶试验氧化酶试验n n5.1 试验方法：滤纸，无菌玻璃棒，1滴新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液n n5.2 结果判定：30s，培养物出现粉红色逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性反应。若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应第十页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室1111试验阳性图示试验阳性图示第十一页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室12125.3 5.3 氧化酶试验注意事项氧化酶试验注意事项n n5.3.1 5.3.1 试验菌落试验菌落(苔)必须新鲜，陈旧培养物反应不可靠n n5.3.2 5.3.2 试验避免与铁、镍等金属接触，否则易出现假阳试验避免与铁、镍等金属接触，否则易出现假阳性。宜用玻璃棒或木棒性。宜用玻璃棒或木棒n n5.3.3 试剂宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲基对苯二胺氧化变色不可用n n5.3.4 5.3.4 反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，以免浸泡培养物使之与空气隔绝，造成假阴性反应以免浸泡培养物使之与空气隔绝，造成假阴性反应n n5.3.5 5.3.5 含糖培养基上的菌落不适于做氧化酶试验，因为含糖培养基上的菌落不适于做氧化酶试验，因为糖分解产酸抑制氧化酶活性糖分解产酸抑制氧化酶活性第十二页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室13136 6 血浆凝固酶试验简介血浆凝固酶试验简介n n主要用于金黄色葡萄球菌的鉴定n n分为两大类，结合凝固酶和游离凝固酶n n检测以试管法为参考方法第十三页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室14146 6 凝固酶试验操作方法凝固酶试验操作方法n n无菌试管(10100mm)3支，加入血浆和0.9%无菌氯化钠溶液(1：1)各0.5ml，1支加入被检菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml，作为检品管；其余2支作对照管：1支加入金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作为阳性对照；另一支加入营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性对照n n三管同时置361水浴或恒温培养箱，3h后开始检查，以后每隔适当时间观察一次，直至24h第十四页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室15156 6 凝固酶试验的注意事项凝固酶试验的注意事项n n血浆凝固酶试验应用新鲜培养物及新鲜血浆。如用陈旧培养物及血浆(纤维蛋白常已析出)易导致假阴性反应n n用试管法检查时，轻轻将试管倾斜，(动作勿大，防止江凝块摇碎)仔细观察n n试验时间过长容易导致假阴性第十五页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室16166 6 凝固酶试验的结果判定凝固酶试验的结果判定n n阴性对照管血浆流动自如，阳性对照管液呈凝固状，试验管液呈凝固者为阳性反应；不凝固为阴性反应。阳性对照管和阴性对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验n n目前商品化的凝固酶试剂多家微生物相关制剂公司有售，试剂具有较好的稳定性、准确性第十六页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室17177 7 生化试验生化试验n n细菌鉴定的传统方法，参考方法n n因为针对不同菌种，选择有针对性的生化因为针对不同菌种，选择有针对性的生化试验进行，菌种不同所作的试验不同，药试验进行，菌种不同所作的试验不同，药品检验中常用的种类不再一一介绍，所以品检验中常用的种类不再一一介绍，所以在以后各菌种鉴定内容当中单独讨论在以后各菌种鉴定内容当中单独讨论n n所有试验都需要已知阳性和阴性的菌株作为质控菌株，定期对试剂、培养基（包括培养基的灵敏度试验）以及试验操作过程进行质控试验，保证结果解释的准确性第十七页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室18188 8 自动化仪器自动化仪器n n优点：n n包含的菌种的生物学特性测试试验种类更多，可以提高菌种鉴定的准确率n n缩短菌种鉴定所需要的时间，为检品的快速检验提供保证n n细菌鉴定的酶学技术以及近红外技术等其他鉴定方细菌鉴定的酶学技术以及近红外技术等其他鉴定方法应用的研究将为药品微生物鉴定提供更多的选择法应用的研究将为药品微生物鉴定提供更多的选择和便利和便利第十八页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室1919n nB-D公司的phenix系统、生物梅里埃公司的VITEK系统等第十九页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室2020生化鉴定生化鉴定第二十页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室2121一、大肠杆菌检查法一、大肠杆菌检查法 第二十一页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室22221 1 简述简述n n大肠杆菌即大肠埃希菌（大肠杆菌即大肠埃希菌（EscherichiaEscherichiacolicoli），为肠杆菌科埃），为肠杆菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，还有蟑螂埃希菌等希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，还有蟑螂埃希菌等四个种四个种n n大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠杆菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污在药品中检出大肠杆菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。为保证人体健康，口服药品必须检染，即可能污染肠道病原体。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠杆菌查大肠杆菌n n大肠埃希菌除普通大肠杆菌外尚有致病性大肠杆菌、产毒性大肠大肠埃希菌除普通大肠杆菌外尚有致病性大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、溶血性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌等，可引起婴幼儿、成杆菌、溶血性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌等，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻、结膜炎等病症人爆发性腹泻、结膜炎等病症第二十二页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室23232 2 对照用菌液对照用菌液n n菌种为大肠杆菌（）44102n n对照菌液加入量含菌50100cfu（一般用量为0.1ml）n n制作方法：营养琼脂斜面培养物少许，接种至制作方法：营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，营养肉汤培养基内，361361培养181824h24h后，用后，用0.9无菌氯化钠溶液稀释至1：106n n其用途：n n做阳性对照n n检查培养基灵敏度第二十三页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室24243 3 操作步骤操作步骤第二十四页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室25253.1 3.1 增菌培养增菌培养n n取胆盐乳糖（）培养基3瓶，每瓶各100mln n2瓶分别加入规定量的供试液，其中1瓶加入含对照菌50100个菌落形成单位的控制菌菌液作阳性对照，第3瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照n n37培养1824h（必要时可延至48h）。阴性对照应无菌生长。摇匀上述BL增菌培养液第二十五页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室26263.2 MUG3.2 MUG试验原理试验原理n n4-4-甲基伞形酮葡糖苷酸（甲基伞形酮葡糖苷酸（MUGMUG）试验的原理）试验的原理MUGMUG被被-葡糖苷葡糖苷酸酶（酸酶（GUDGUD）水解，产生荧光）水解，产生荧光n n实验证明实验证明9696的大肠杆菌含的大肠杆菌含GUDGUD，约，约1010的沙门菌属一些菌种也的沙门菌属一些菌种也含有此酶。单一的含有此酶。单一的MUGMUG鉴别大肠杆菌其漏检率达鉴别大肠杆菌其漏检率达6 6，鉴于，鉴于9898的大肠杆菌靛基质试验为阳性，故将的大肠杆菌靛基质试验为阳性，故将MUGMUG，靛基质试验结，靛基质试验结合，用合，用EMBEMB琼脂平板分离，辅以琼脂平板分离，辅以IMViCIMViC试验，在理论上可使试验，在理论上可使大肠杆菌的检出率达大肠杆菌的检出率达9999n n由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用有主观性，因而用MUGMUG鉴定大肠杆菌已被广泛应用于临床、鉴定大肠杆菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测食品、饮水、污水等的检测n nMUGMUG阳性（有荧光）、靛基质阳性（玫瑰红色）阳性（有荧光）、靛基质阳性（玫瑰红色）,MUG,MUG阴性（无荧阴性（无荧光）、靛基质阴性（无色）光）、靛基质阴性（无色）n n如如MUGMUG、I I试验为阳性或阴性即可报告结果，如试验为阳性或阴性即可报告结果，如MUGMUG与与I I试验不一试验不一致时，则需分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别致时，则需分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别第二十六页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室27273.2 MUG3.2 MUG试验操作试验操作n n以灭菌吸管取供试品胆盐乳糖增菌培养液、供试品阳性对照培养液、阴性对照培养液各0.2ml，分别加入MUG蛋白胨培养基（培养基5.7）管，37培养4、24h后，将各管置366nm紫外灯下观察有无蓝白色荧光，然后加欧波试液45滴于上述MUG管内，观察液面颜色第二十七页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室28283.2.1 MUG3.2.1 MUG法不必分离单个菌落法不必分离单个菌落n n除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属、沙门菌属的菌株；以及少数革兰阳性球菌、杆菌和芽孢菌，其MUG为阳性n n在MUG培养基成分中增加了去氧胆酸钠，可排除革兰阳性菌的干扰n n志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难生长，即使有生长，本法能检出。并且既然药品中不得检出大肠杆菌，更不允许检出志贺菌、沙门菌第二十八页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室29293.2.2 3.2.2 试验耗材要求试验耗材要求n n配制MUG培养基时，务必校正pH值，灭菌后pH不得过7.4，否则pH值偏高，MUG分解，本身则显荧光n n分装MUG培养基的试管应挑选，试管、蛋白胨不得显荧光第二十九页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室30303.2.3 3.2.3 培养时间及干扰因素培养时间及干扰因素n n供试品培养液接种于MUG培养基中的培养时间，一般在4h、24h观察是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确判断时，可延长培养至48h再观察结果n n由于大肠埃希菌各菌株间的GUD的活性不完全相同，对底物和底物的浓度反应的差异；培养基中选择因子的影响；培养温度；pH的改变；大量竞争菌和样品本身物质成分的干扰等，对结果的判断亦有影响第三十页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室31313.2.4 3.2.4 结果观察结果观察n n取供试品的MUG试验管、阳性对照管、阴性对照管同时在366nm紫外灯下观察，阳性对照管应有较强蓝白色荧光，阴性对照管无荧光。供试品MUG管是否有荧光，应仔细观察比较，或将各管调换位置（阴性管居中），适当倾斜试管。如阳性对照管荧光强烈，影响供试品管与阴性对照管的观察时，亦可移去阳性对照管第三十一页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室32323.3 MUG3.3 MUG与靛基质试验结果判定与靛基质试验结果判定n n如MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时，将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取12环培养液划线于EMB或麦康凯琼脂平板上，培养1824h，观察EMB或麦康凯琼脂平板有无可疑大肠杆菌菌落生长。当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，供试品分离平板无菌落生长，或有菌落但不同于下表所列特征，可判为供试品1g或1ml未检出大肠杆菌第三十二页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室3333大肠杆菌在不同培养基上大肠杆菌在不同培养基上菌落形态特征菌落形态特征 n n当阳性菌对照平板未生长或生长菌落经检查不是大肠杆菌，当阳性菌对照平板未生长或生长菌落经检查不是大肠杆菌，应研究原因，重新试验或重新制备供试液，以消除供试品抑应研究原因，重新试验或重新制备供试液，以消除供试品抑菌成分的影响。有疑似菌落生长者，挑取可疑菌落做革兰染菌成分的影响。有疑似菌落生长者，挑取可疑菌落做革兰染色、镜检、色、镜检、IMViCIMViC试验试验培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂典型菌落呈紫黑色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，有金属光泽。非典型菌落呈浅紫色、粉红色，或菌落中心紫色或无明显暗色中心，无金属光泽。麦康凯琼脂典型菌落呈鲜桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。非典型菌落呈微红色，或菌落中心呈红色。第三十三页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室3434大肠埃希菌在大肠埃希菌在EMB、MAC上的特上的特征征第三十四页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室35353.4 3.4 疑似菌落的挑选疑似菌落的挑选n n如生长菌落与上表所列特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，沾取培养物，应挑选2 23 3个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养培养1824h24h，作检查，作检查n n无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽），应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养泽），应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液划线接种于液划线接种于EMB琼脂平板，培养181824h，再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下革兰染色、镜检以及生化试验第三十五页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室36364 4 生化试验生化试验第三十六页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室37374.1 4.1 乳糖发酵试验乳糖发酵试验n n操作：取营养琼脂斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养2448h，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色；指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小）n n假阴性的处理：为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接种5乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于24h出现阳性。或适当延长培养时间第三十七页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室38384.2 4.2 靛基质试验（靛基质试验（I I）n n操作：取营养琼脂斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养2448h，沿管壁加入欧波试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性n n说明：98的大肠杆菌靛基质试验为阳性。n n阴性培养物的进一步检查：一般24h即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1或2ml培养液进行检查，如靛基质是阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养24h，作试验第三十八页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室39394.3 4.3 甲基红试验（）甲基红试验（）n n操作：取营养琼脂斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养482h，于培养液中加入甲基红指示液23滴（约每ml培养液加指示液1滴），轻微摇动，立即观察n n结果观察：呈鲜红色或桔红色为阳性，呈黄色为阴性。第三十九页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室40404.44.4乙酰甲基甲醇生成试验（乙酰甲基甲醇生成试验（V-PV-P）n n操作：取营养琼脂斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养482h，于2ml培养液中加入-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40氢氧化钾试液0.4ml，充分振摇，在4h（通常在30min）内观察结果n n结果观察：出现红色应判为阳性，无红色反应为阴性第四十页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室41414.5 4.5 枸橼酸盐利用试验（枸橼酸盐利用试验（C C）n n操作：取营养琼脂斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养2 24天天n n结果观察：培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为结果观察：培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变、无菌苔生长为阴性蓝色时为阳性，培养基颜色无改变、无菌苔生长为阴性n n注意事项：枸橼酸盐利用试验培养时间，原订为注意事项：枸橼酸盐利用试验培养时间，原订为2 2天，天，根据试验资料，发现培养根据试验资料，发现培养3天后，枸橼酸盐利用试验产天后，枸橼酸盐利用试验产生阳性。仅培养生阳性。仅培养2 2天是不够的，故试验培养时间改为天是不够的，故试验培养时间改为2 24天第四十一页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室42425 5 结果判断结果判断n n5.1 当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验MUG呈呈阳性，供试品阳性，供试品MUG阳性、靛基质阳性，报告阳性、靛基质阳性，报告lg或或1ml1ml供试品检出大肠杆菌。MUG阴性、靛基质阴性，报告lg或或1ml供试品未检出大肠杆菌供试品未检出大肠杆菌n n5.2 MUG5.2 MUG阳性、靛基质阴性、IMViCIMViC试验为-+-+-、革、革兰阴性杆菌，报告兰阴性杆菌，报告lglg或1ml1ml供试品检出大肠杆菌；供试品检出大肠杆菌；MUG阴性、靛基质阳性、IMViCIMViC试验为试验为+-、革兰阴性杆、革兰阴性杆菌，报告菌，报告lg或或1ml供试品检出大肠杆菌供试品检出大肠杆菌n n5.3 5.3 供试品培养物检查不符合上述二项中的任一项，报告lglg或或1ml1ml供试品未检出大肠杆菌第四十二页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室43435 5 结果判断结果判断-不能直接得出结论不能直接得出结论n n5.4 当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长菌落不是大肠杆菌，不能作出检验报告。第四十三页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室44446.6.注意事项注意事项n n试验操作应当严格按照相关要求进行第四十四页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室45456.1 IMViC6.1 IMViC试验的顺序试验的顺序n n以灭菌接种针沾取菌苔，首先接种于枸橼酸盐琼脂斜面上，然后接种于蛋白胨水培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基中。切勿将培养基带入枸橼酸盐琼脂斜面上，以免产生假阳性结果第四十五页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室46466.2 6.2 阳性对照试验的操作环境阳性对照试验的操作环境n n阳性对照试验是检查供试品是否有抑菌作用及培养条件是否适宜。阳性对照菌液的制备、计数及加入含供试品的培养基中等操作，不能在检测供试品的无菌室或净化台上进行，必须在单独的隔离间或净化台操作，以免污染供试品及操作环境第四十六页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室47476.3 6.3 关于复验关于复验n n在各类供试品中检测大肠杆菌及其他控制菌，按一次检出结果为准，不再抽样复验。检出的大肠杆菌及其他控制菌培养物须保留1个月，备查第四十七页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室4848大肠菌群的检查大肠菌群的检查n n大肠菌群的检查与大肠杆菌有相似之处，应当将分纯的菌种进行大量的生化试验来区分菌种。利用乳糖产酸产气者进行进一步鉴别第四十八页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室4949大肠菌群菌落形态特征大肠菌群菌落形态特征n n菌落疑似者再进行确证试验n n菌落接种到胆盐乳糖发酵管，产酸产气报告检出大肠菌群，否菌落接种到胆盐乳糖发酵管，产酸产气报告检出大肠菌群，否则判未检出则判未检出培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、紫红色、红色或者粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润。麦康凯琼脂呈鲜桃红色或者粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润。第四十九页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室5050大肠菌群数的推算大肠菌群数的推算各供试品量的检出结果可能的大肠菌群数N（cfu/g(ml)0.1g(0.1ml)0.01g(0.01ml)0.001g(0.001ml)+103+-102N103+-10N102-10第五十页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室5151二、沙门菌检查法二、沙门菌检查法 第五十一页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室52521 1 简述简述n n肠杆菌科的重要致病菌肠杆菌科的重要致病菌n n20032003年出版的第八版的临床微生物手册将沙门菌属分成两个菌年出版的第八版的临床微生物手册将沙门菌属分成两个菌种。迄今已发现种。迄今已发现25012501个血清型个血清型,O,O抗原抗血清的抗原抗血清的A-FA-F群包含了分离群包含了分离株的株的9595以上，所以用沙门菌以上，所以用沙门菌A-F A-F O O多价血清进行初筛试验多价血清进行初筛试验n n药品中的沙门菌，是以鉴定沙门菌属为准，即对每药品中的沙门菌，是以鉴定沙门菌属为准，即对每g(g(或或ml)ml)药品中是否检出沙门菌作出检验报告。由于沙门菌血清药品中是否检出沙门菌作出检验报告。由于沙门菌血清型繁多，各血清型的生化型繁多，各血清型的生化及血清学及血清学特性虽密切相关，却不尽特性虽密切相关，却不尽相同，采用一种增菌培养基和两种分离培养基，不可能涵盖所相同，采用一种增菌培养基和两种分离培养基，不可能涵盖所有沙门菌的最适增菌及分离条件有沙门菌的最适增菌及分离条件第五十二页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室53531.1 1.1 药物对沙门菌的影响药物对沙门菌的影响n n此外，由于药品在生产过程中，常受到加热、干燥等加工步骤的影响，药品中污染的沙门菌可受到损伤或呈休眠状态，故须在增菌培养前先进行预增菌。然后再进行增菌及分离、三糖铁琼脂初步鉴别、生化试验、血清学试验等步骤。其他控制菌也可能存在相同状况第五十三页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室54542 2 对照用菌液对照用菌液n n乙型副伤寒沙门菌CMCC(B)50094的营养琼脂n n斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内。361培养1824h后，用0.9%无菌氯化钠溶液释至1：106，浓度相当于50-100个cfu/0.1ml第五十四页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室55553 3 操作方法操作方法第五十五页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室56563.1 3.1 增菌培养增菌培养n n3.1.1 3.1.1 预增菌预增菌 取营养肉汤培养基取营养肉汤培养基3 3瓶，每瓶各100ml100ml，2瓶加入瓶加入1 1：1010供试液各10ml，其中1瓶加入对照菌液0.1ml(含菌量为5050100100个个cfu/ml)作阳性对照，第3瓶加入稀释剂10ml10ml作阴性对照，培养181824h后后观察。摇动阴性对照瓶后应清亮透明，无菌生长，否则观察。摇动阴性对照瓶后应清亮透明，无菌生长，否则试验无效试验无效n n3.1.2 增菌培养 轻微摇动供试品增菌培养瓶及阳性对照培养瓶，分别吸取1ml各接种于各接种于1管四硫磺酸管四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养钠亮绿培养基中，培养1824h。阳性对照管应呈现混浊第五十六页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室57573.2 3.2 分离培养分离培养n n轻微摇动供试品增菌培养瓶和阳性对照增菌培养瓶，以接种环分别沾取12环培养液接种于胆盐硫乳琼脂(DHL)或沙门菌志贺菌琼脂(SS)平板及曙红亚甲蓝(EMB)琼脂或麦康凯琼脂平板各1个，倒置培养2448h。检查平板上有无疑似沙门菌菌落第五十七页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室58583.3 3.3 沙门菌在分离平板上的菌落形沙门菌在分离平板上的菌落形态特征见表态特征见表平板沙门菌属亚属沙门菌亚属胆盐硫乳琼脂(DHL)无色或微带橙色，透明或半透明，边缘整齐、光滑、中等大小或较小，产H2S的菌落中心或几乎全黑色发酵乳糖的菌株菌落为粉红色，中心带黑色，迟缓发酵乳糖或不发酵乳糖的菌株菌落与亚属同沙门菌属志贺菌 属 琼 脂(S.S)无色或微带粉色，透明或半透明，边缘整齐、光滑，中等大小或较小，产H2S的菌落，中心呈黑色。同一平板上常有多数菌落无黑色中心同胆盐硫乳琼脂平板。但发酵乳糖无黑色中心的菌落与大肠埃希菌不能区别曙红亚甲蓝琼脂(EMB)无色或微带橙色，透明或半透明，中等大小，边缘整齐光滑发酵乳糖的菌株菌落为紫色。迟缓发酵乳糖或不发酵乳糖的菌株与沙门菌亚属同麦 康 凯 琼 脂(MacC)同曙红亚甲蓝琼脂平板发酵乳糖的菌株菌落为粉红色，不发酵乳糖或迟缓发酵乳糖的菌株与沙门菌亚属同第五十八页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室59593.3.1 3.3.1 菌落特征补充菌落特征补充n n由于沙门菌不发酵乳糖和蔗糖，不产酸，菌落不着色，一般为无由于沙门菌不发酵乳糖和蔗糖，不产酸，菌落不着色，一般为无色半透明，多数沙门菌因产生色半透明，多数沙门菌因产生H H2 2S S，菌落中心呈现黑色甚至全黑，菌落中心呈现黑色甚至全黑色，在色，在DHLDHL琼脂平板上较为明显琼脂平板上较为明显n n在在SSSS琼脂平板上，琼脂平板上，H H2 2S S特征有时不明显，沙门菌属亚属特征有时不明显，沙门菌属亚属因多因多数菌株发酵乳糖，故在上述平板上的乳糖发酵菌落呈现粉红或紫数菌株发酵乳糖，故在上述平板上的乳糖发酵菌落呈现粉红或紫色，但由于产生色，但由于产生H H2 2S S，在有，在有H H2 2S S指示系统的平板上仍出现黑色中指示系统的平板上仍出现黑色中心心n n在上述培养基上，有些非沙门菌属细菌，也可呈现类似沙门在上述培养基上，有些非沙门菌属细菌，也可呈现类似沙门菌菌落形态，须进一步鉴别菌菌落形态，须进一步鉴别n n阳性对照平板上，应有沙门菌落形态特征的菌落生长，否阳性对照平板上，应有沙门菌落形态特征的菌落生长，否则，应查明原因。若为供试品抑菌成分所致，须重新制备则，应查明原因。若为供试品抑菌成分所致，须重新制备供试液，消除抑菌成分影响后再行检查供试液，消除抑菌成分影响后再行检查n n由于药物的影响或非典型菌株的存在，沙门菌菌落可呈现非典由于药物的影响或非典型菌株的存在，沙门菌菌落可呈现非典型形态，如色泽变深，菌落粗糙等，应注意辨别型形态，如色泽变深，菌落粗糙等，应注意辨别第五十九页，本课件共有124页20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室60603.3.2 3.3.2 菌落与结果报告菌落与结果报告n n如阳性对照平板有典型菌如阳性对照