项目四：香菇多糖的生产.(精品).ppt
项目四：香菇多糖的生产 任务1：香菇多糖制备方案的制定 目录香菇多糖的概述实训原理实训器材与试剂实训步骤香菇多糖的概述实训原理一、香菇多糖的概述1.香菇多糖（简称LNT），存在于香菇中，分子量为100万，是从香菇中分离纯化的一种葡聚糖，是以增强T细胞和巨噬细胞功能为主的免疫增强剂。与化疗或放疗联用可发挥增效减毒作用。2.性质：（1）外观：白色或棕黄色粉末状固体（2）稳定性：对光和热稳定（3）溶解性：能溶于水，水溶液为中性，水中最大溶解度为3mg/ml,溶解度随分子质量增大而降低：带有硫酸根或乙酰基团的香菇多糖，其水溶性大大提高，不溶于甲醇、丙酮、高浓度乙醇等（4）旋光性：在不同的NaOH溶液中有不同的旋光度（5）其他：香菇的主要成分是多糖类和不饱和脂肪酸，经热水提取的香菇多糖可调节人休内有免疫功能的T细胞活性，可降低甲基胆蒽诱发肿瘤的能力。3.药理作用：具有免疫增强作用，其机制在体内虽无直接杀伤肿瘤细胞作用，但可通过增强机体的免疫功能而发挥抗肿瘤活性。在体内能使脾脏和腹腔的NK细胞活性增强，诱生干扰素与本品剂量相关，其活性与白细胞介素类或干扰素诱导剂有协同作用。另有证明，在体外本品可增强脱氧胸腺嘧啶核苷的抗艾滋病毒的活性。香菇多糖通过激活巨噬细胞，增强抗体依赖性细胞诱导的细胞毒（ADDC），发挥抗肿瘤活性；此外，香菇多糖还能使肿瘤部位的血管扩张和出血，导致肿瘤出血坏死和完全退化。4.生物活性（1）香菇多糖的抗肿瘤活性（2）香菇多糖的免疫调节（3）香菇多糖的抗病毒活性（4）香菇多糖抗感染作用二、实训原理 1.在组织中，多糖多与蛋白质以共价相结合，所以在生化产品制备工艺中，往往第一步多用酶降解蛋白质部分或用碱使多糖蛋白质间的键裂开，以促进多糖在提取时的溶解。碱性提取可避免多糖中硫酸基团水解而破坏。现多采用碱性提取的同时用蛋白质水解酶处理组织。提取液中存在的蛋白质可用普通蛋白质沉淀剂使之沉淀，也可用其他方法使变性沉淀，如适当调pH和加热等。2.本实验中性多糖常用水作溶剂来提取，可以用水浸煮。3.香菇中色素较高，活性炭有脱色素、脱去异味等作用。4.蛋白质不溶于氯仿等有机溶剂，可对香菇多糖进行除去杂蛋白。而香菇多糖在氯仿中溶解度大于在热水中的溶解度，所以可以用氯仿对香菇多糖进行萃取 5.乙醇沉淀法提取多糖时，乙醇的浓度及提取方式对多糖的得率影响较大。最有效的方法是向多糖溶液中加入乙醇，使乙醇的最终浓度依次达到40%、60%、70%、80%，离心每次沉淀，乙醇沉淀得到的不一定是纯的多糖，还需用凝胶柱色谱进行分离纯化。6.用苯酚硫酸法显棕色，可以对多糖进行定性检测。7.香菇子实体有含量较多的脂类的物质，可以用石油醚、乙醚等低级性溶剂除去脂溶性杂质。8.因为香菇肉质太厚，萃取时氯仿很难渗透至其深处，则萃取物的产率低。热水提取法多糖在260nm和280nm波长处有较明显的吸收峰三、实训材料、仪器与试剂1.原料:香菇 2.器材：组织捣碎机、恒温水浴锅、循环水式真空泵、冷冻离心机、凝胶柱、脱脂棉、再字夹、紫外分光光度计、容量瓶、试管、烧杯、紫外检测仪、记录仪、流量泵 3.试剂：氯仿、无水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚-硫酸试剂：苯酚3g,浓硫酸5mL，溶于95mL无水乙醇中。四、实训步骤（一）多糖的提取1.热水浸提：称取香菇10g,于组织捣碎机内粉碎，倒入 烧杯中，加20倍量的水，将烧杯放入恒温水浴锅中90）加热30min,然后用布氏漏斗和真空泵进行抽滤，取滤液。2.脱色，除味：在滤液中加入活性炭（1mg/ml），搅 拌吸附1h，抽滤，取滤液。3.萃取、除杂蛋白：在滤液中加入氯仿溶液，充 分混合后，过滤，取滤液。重复萃取、除杂3次。4.乙醇沉淀：在萃取液中加入无水乙醇，使其乙醇浓度达80%，沉淀12h,于冷冻离心机（4000r/min）离心30min，取沉淀 5.脱脂：沉淀物分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤3次，即得香菇多糖提取物。（二）多糖纯化取上述香菇多糖提取物溶于蒸馏水中，离心除去不溶物。SephadexG100凝胶装好柱，用蒸馏水平衡48h,然后将上清液上柱分离，用蒸馏水洗脱，洗脱速度5ml/20min（可用恒流泵控制洗脱速度）,200nm波长紫外检测，收集主要峰部分（当记录仪上出现波峰时即用试管开始收集洗脱液），冷冻干燥得白色香菇多糖，并称重。（三）香菇多糖分析检测1.定性检测苯酚-硫酸法 将苯酚-硫酸试剂喷洒在冷冻干燥好的白 色香菇多糖上110，加热香菇多糖几分钟，显棕色即为多糖。2.定量检测-分光光度法 a.标准曲线的制备 精密称取(可用分析天平）60干燥至恒重的甘露糖标准品0.1g，置于100ml的容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度处。用移液管量取对照品溶液0、0.5、1.0、2.0、2.5、3.0ml.分别置50ml容量瓶中，加蒸馏水定容在各精密吸取1ml，置于带塞试管中，准确移取8%苯酚溶液1ml，快速加入浓硫酸5ml置于水浴锅中加热15min,取出冷却至室温，橘黄色由浓度从小到大而逐渐加深，将溶液于490nm波长的分光光度计处测定吸收度，绘制标准曲线。b.样品多糖的测定 精密称取香菇多糖10.0mg,加水溶解，定量转移入100ml容量瓶中，加水定容，均摇。准确吸取2.00ml,按上述试验方法显色，测定吸光值，计算香菇多糖含量。
