专题1基因工程 1-2基本操作程序 限制酶的选择和筛选方法.ppt

高中生物 选修三专题1 基因工程1.2 基因工程的基本操作程序限制酶的选择、筛选含目的基因的受体细胞限制酶的选择、筛选含目的基因的受体细胞授课教师：黄艺娜授课教师：黄艺娜授课时间：授课时间：15 15 十二月十二月 2022 2022厦门双十中学漳州分校 高中部1-、基因工程的基本工具基因工程的基本工具1.限制酶：限制酶：（1）来源：主要从来源：主要从 生物中分离纯化而来；生物中分离纯化而来；（2）作作用用：识识别别 并并切切开开特特定定部部位位的的两两个核苷酸之间的个核苷酸之间的 ；（3）结果：产生结果：产生 或平末端；或平末端；2.DNA连接酶：连接酶：（1）作用：将限制酶切割下来的作用：将限制酶切割下来的DNA片段片段 ；（2）类型：类型：和和T4 DNA连接酶；连接酶；原核原核特定序列特定序列磷酸二酯键磷酸二酯键粘性末端粘性末端拼接成拼接成DNA分子分子E coli coli DNADNA连接酶连接酶3.载体：载体：（1）常用载体是）常用载体是 ；（2）作为作为基因表达载体基因表达载体所需的元件：所需的元件：目的基因、目的基因、标记基因。、标记基因。质粒质粒启动子启动子终止子终止子思考思考1：表达载体为什么一定要有启动子？表达载体为什么一定要有启动子？生物之间进行基因交流，只有使用生物之间进行基因交流，只有使用受体生物受体生物自身基因的启动子自身基因的启动子才能有利于基因的表达；才能有利于基因的表达；思考思考2：终止子的作用是什么？：终止子的作用是什么？终止子是位于基因尾端的一段特殊的终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，片断，能终止能终止mRNA的转录的转录。思考思考3：标记基因有什么作用？标记基因有什么作用？是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将从而将有目的基因的细胞有目的基因的细胞筛选出来。筛选出来。二、基因工程的基本操作程序二、基因工程的基本操作程序（1 1）目的基因的获取）目的基因的获取（2 2）基因表达载体的构建基因表达载体的构建（核心）（核心）（3 3）将目的基因导入受体细胞）将目的基因导入受体细胞（4 4）目的基因的检测与鉴定）目的基因的检测与鉴定质粒质粒携带目的基因的携带目的基因的DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理形成线性质粒形成线性质粒两个末端两个末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同种同种（2 2）基因表达载体的构建（核心）基因表达载体的构建（核心）AmpR:青霉素抗性基因青霉素抗性基因Tetr:四环素抗性基因四环素抗性基因Ori:复制原点复制原点1.用用图图中中含含人人胰胰岛岛素素基基因因的的DNA分分子子构构建建重重组组质质粒粒时时，不选择不选择SmaSma切割，原因是切割，原因是_。2.与只使用与只使用EcoR相比较，使用相比较，使用BamH和和Hind两种限两种限制酶同时处理质粒、外源制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于：的优点在于：1._;_.使用使用SmaSma酶切会酶切会破坏人胰岛素基因破坏人胰岛素基因为了避免目的基因的为了避免目的基因的自身环化自身环化避免目的基因和质粒避免目的基因和质粒随意连接随意连接不选择限制酶不选择限制酶SmaSma、SacSac的原因是：的原因是：；不选择限制酶不选择限制酶Xho、Nco的原因是：的原因是：；SmaSma酶切会酶切会破坏启动子；破坏启动子；SacSac酶切会酶切会破坏终止子；破坏终止子；酶切位点不在启动子与终止子之间酶切位点不在启动子与终止子之间，目的基因嵌入后无，目的基因嵌入后无法表达法表达不选择限制酶不选择限制酶EcoEcoR R的原因是：的原因是：；因此应选择哪些限制酶进行酶切？因此应选择哪些限制酶进行酶切？；EcoEcoR R酶切会酶切会破坏所有抗性基因破坏所有抗性基因BamBamH H和和HinHind d两种限制酶两种限制酶NotNot和和PstPst 两种限两种限制酶切后目的基因会制酶切后目的基因会反向反向连入质粒中连入质粒中（4）如如果果选选择择BamBamH H和和HinHind d这这两两种种限限制制酶酶对对外外源源DNA和和质质粒粒进进行行酶酶切切后后，使使用用DNA连连接接酶酶进进行行连连接接，那那么么连连接接的的产产物物共共有有几几种？（仅考虑种？（仅考虑2个片段的连接个片段的连接）目的基因目的基因DNADNA分子分子BamBamH HHinHind d质粒质粒三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：常用的受体细胞：有有大肠杆菌大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。菌和动植物细胞等。转化：转化：目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受受体细胞内维持体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达转化转化方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞转转化化后后有有几几种种大大肠肠杆杆菌菌？；4 4种种接接种种到到甲甲培培养养基基上上的的目的是：目的是：筛选筛选_的大肠杆菌的大肠杆菌接接种种到到乙乙培培养养基基上上的的目的是：目的是：筛选筛选_的大肠杆菌的大肠杆菌含含目目的的基基因因的的菌菌落落位位于于哪哪个个培培养养基基上上？在在图图中相应位置上圈出来？中相应位置上圈出来？含含AmpR含目的基因含目的基因丙培养基丙培养基总结：总结：1.1.限制酶的选择原则：限制酶的选择原则：（1 1）应选择切点位于目的基因）应选择切点位于目的基因 的限的限制酶，以便将目的基因制酶，以便将目的基因“切出切出”；（2 2）不能选择切点位于目的基因）不能选择切点位于目的基因 的限的限制酶，以防破坏目的基因；制酶，以防破坏目的基因；（3 3）为避免目的基因和质粒的）为避免目的基因和质粒的 和和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，即为基因和质粒，即为“双酶切双酶切”法。法。两端两端内部内部自身环化自身环化2.2.根据质粒的特点确定限制酶的种类：根据质粒的特点确定限制酶的种类：（1 1）所选限制酶要与切割目的基因的限制酶）所选限制酶要与切割目的基因的限制酶 ，以确保具有相同的黏性末端；，以确保具有相同的黏性末端；（2 2）质粒作为载体必须具备标记基因，所以选）质粒作为载体必须具备标记基因，所以选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有有 个完好的标记基因用于筛选；个完好的标记基因用于筛选；（3 3）所选限制酶切点不应位于）所选限制酶切点不应位于 处以防破处以防破坏质粒的自我复制能力；坏质粒的自我复制能力；（4 4）所选限制酶，其切点应位于）所选限制酶，其切点应位于 与与 之间，之间，以确保目的基因可以借载体在受体细胞内表达。以确保目的基因可以借载体在受体细胞内表达。相同相同1 1复制原点复制原点启动子启动子 终止子终止子3.3.若质粒为若质粒为TiTi质粒，那么限制酶切点应位质粒，那么限制酶切点应位于于 片段中，因为片段中，因为TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA最易转移最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNADNA上。上。T-DNAT-DNA1 1、转转基基因因抗抗病病香香蕉蕉的的培培育育过过程程如如图图1所所示示，图图2表表示示Pst、Sma、EcoR和和Apa四四种种限限制制酶酶的的识识别别序序列列及及酶酶切切位位点点。请请据据图图回回答答下列问题下列问题：（1）图图 中中 限限 制制 酶酶 切切 割割 DNA时时 破破 坏坏 的的 是是 两两 个个_之间的化学键。之间的化学键。（2）在在构构建建图图1中中的的重重组组质质粒粒时时要要保保证证目目的的基基因因被被连连接接在在质质粒粒上上特特定定的的_ 和和终终止止子子之之间间才才能能保保证证目目的的基基因因在受体细胞中被成功在受体细胞中被成功_。脱氧核苷酸脱氧核苷酸启动子启动子表达表达（3）将将抗抗病病基基因因从从含含抗抗病病基基因因的的DNA中中切切割割下下来来，使使用用的的限限制制酶酶是是_，同同时时也也应应该该用用相相同同的的酶酶对对质质粒粒进进行行切切割割，这这样处理的原因是样处理的原因是_。PstPst和和EcoREcoR用相同的酶切割质粒才能产生与目的用相同的酶切割质粒才能产生与目的基因相同的末端，便于二者进行拼接基因相同的末端，便于二者进行拼接（4）转转基基因因抗抗病病香香蕉蕉的的培培育育是是否否发发生生了了可可遗遗传传变变异异？_。药药物物A会会抑抑制制香香蕉蕉愈愈伤伤组组织织细细胞胞的的生生长长，根根据据这这一一原原理理可可以以利利用用含含药药物物A的的培培养养基基筛筛选选已已导导入入重重组组质质粒粒的的香香蕉蕉细细胞胞。由由此此推推断断，重重组组质质粒粒中中应应含含有有_基因作为标记基因。基因作为标记基因。是是抗药物抗药物A A2 2、大大肠肠杆杆菌菌pUC18质质粒粒是是基基因因工工程程中中常常用用的的运运载载体体。某某限限制制酶酶在在此此质质粒粒上上的的唯唯一一酶酶切切位位点点位位于于LacZ基基因因中中，如如果果没没有有插插入入外外源源基基因因，LacZ基基因因便便可可表表达达出出半半乳乳糖糖苷苷酶酶。当当培培养养基基中中含含有有IPTG和和Xgal时时，Xgal便便会会被被半半乳乳糖糖苷苷酶酶水水解解成成蓝蓝色色，大大肠肠杆杆菌菌将将形形成成蓝蓝色色菌菌落落。反反之之，则则形形成成白白色色菌菌落落。下下图图表表示示利利用用此此质质粒粒实实施基因工程的主要流程。请分析并回答：施基因工程的主要流程。请分析并回答：（1）将将试试管管中中的的菌菌液液接接种种于于选选择择培培养养基基上上培培养养，培培养养基基中中应应含含有有大大肠肠杆杆菌菌必必需需的的营营养养物物质质碳碳源源、氮氮源源、无无机机盐盐、水水和和生生长长因因子子，还还应应加加入入IPTG、Xgal以以及及 ，其其中中加加入入氨氨苄苄青青霉霉素素的的作作用用是筛选出是筛选出_。(2)若若观观察察到到培培养养基基上上出出现现_色色菌菌落落，则则说说明明大大肠肠杆杆菌菌中中已已成成功导入了重组质粒。功导入了重组质粒。氨苄青霉素氨苄青霉素含有氨苄青霉抗性基因的受体细胞含有氨苄青霉抗性基因的受体细胞白白