《多聚酶链式反应扩增DNA片段》教学课件.ppt

广东汕头华侨中学广东汕头华侨中学 钟霓钟霓 多聚酶链式反应多聚酶链式反应(PCR(PCR技术技术)，是一种在体外快速扩增特定基因或是一种在体外快速扩增特定基因或DNADNA序序列的方法，故又称为列的方法，故又称为DNADNA体外扩增技术体外扩增技术。课题背景课题背景PCRPCR技术能迅速扩增技术能迅速扩增DNADNA片段，原因是：片段，原因是：DNADNA分子具有分子具有结构。结构。DNADNA复制时遵循复制时遵循原则。原则。规则的双螺旋规则的双螺旋碱基互补配对碱基互补配对分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一其本质是在体外模拟细胞内其本质是在体外模拟细胞内其本质是在体外模拟细胞内其本质是在体外模拟细胞内DNADNADNADNA分子复制的过程分子复制的过程分子复制的过程分子复制的过程美美美美国国国国科科科科学学学学家家家家穆穆穆穆利利利利斯斯斯斯(K K K K.B B B B.M M M Mu u u ul l l ll l l li i i is s s s)发发发发明明明明了了了了P P P PC C C CR R R R技技技技术术术术1 1 1 19 9 9 99 9 9 93 3 3 3年年年年诺诺诺诺贝贝贝贝尔尔尔尔奖奖奖奖 DNA DNA分子的基本组成单位是分子的基本组成单位是 。每个基本单位是由一分子的每个基本单位是由一分子的 、一分子、一分子的的 和一分子的和一分子的 构成。构成。脱氧核苷酸脱氧核苷酸磷酸磷酸含氮碱基含氮碱基脱氧核糖脱氧核糖脱氧脱氧核糖核糖含氮碱基含氮碱基磷酸磷酸A G C T腺嘌呤腺嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶 脱氧核苷酸脱氧核苷酸（共4种）复习一复习一 DNADNA的基本单位的基本单位 DNADNADNADNA分子是由分子是由分子是由分子是由 的脱氧核苷酸长链的脱氧核苷酸长链的脱氧核苷酸长链的脱氧核苷酸长链盘旋成的双螺旋结构。盘旋成的双螺旋结构。盘旋成的双螺旋结构。盘旋成的双螺旋结构。两两两两条反向条反向条反向条反向平行平行平行平行复习二复习二 DNADNA的结构的结构P PP PP PP PP PP PP PP P55331 12 25 543羟基末端称羟基末端称3端端磷酸基团末端称磷酸基团末端称5端端条条件件参与的组分参与的组分在在DNA分子复制中的作用分子复制中的作用模模板板原原料料酶酶能能量量【学生活动学生活动1】课堂练习，课堂练习，填写下表填写下表复习三复习三 生物体内生物体内DNADNA的复制的复制DNA的两条母链的两条母链 提供复制的模板提供复制的模板四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸合成合成DNA子链的原料子链的原料解旋酶解旋酶DNA聚合酶聚合酶打开打开DNA双螺旋双螺旋催化合成催化合成DNA子链子链ATP 为解螺旋和合成子链提供能量为解螺旋和合成子链提供能量复制特点：复制特点：边解旋边复制边解旋边复制半保留复制半保留复制DNADNA复制的方向复制的方向引物引物DNA母链母链总是从子链的总是从子链的5 5端向端向3 3端延伸端延伸新知一新知一（与（与模板链模板链3 3端互补结合端互补结合）从中选出适合的引物进行从中选出适合的引物进行PCR:PCR:(1)CCTAGA (1)CCTAGA (2)GTTCGC(2)GTTCGC(3)AAAGT (3)AAAGT (4)TTTCA(4)TTTCA 3 5 5 3 1 1、复制是从头开始的吗？、复制是从头开始的吗？2 2、引物结合在母链的、引物结合在母链的 端。端。3 3、DNADNA聚合酶从引物聚合酶从引物 端开始结合上去端开始结合上去4 4、子链、子链DNADNA延伸的方向从延伸的方向从 到到 。335533不是不是33（1）CCTAGA（3）AAAGT【学生活动学生活动2】课堂练习，巩固新知课堂练习，巩固新知引物引物引物引物 PCRPCR原理原理DNADNA双链双链单链单链变性（加热变性（加热80-10080-100 ）复性（复性（缓慢缓慢冷却）冷却）变性的目的：变性的目的：复性的目的：复性的目的：解开双链解开双链有利于引物有利于引物和引物和引物与两条单与两条单链的结合链的结合新知二新知二 PCRPCR的反应过程的反应过程1变变性性：当当温温度度上上升升到到_0C以以上上时时，双链双链DNA解聚为单链。解聚为单链。2 复复 性性：温温 度度 下下 降降 到到 _0C左左 右右，_通通过过碱碱基基互互补补配配对对与与两两条条单单链链DNA结合。结合。3延延伸伸：温温度度上上升升到到_ 0C左左右右，溶溶液液中中的的四四种种脱脱氧氧核核苷苷酸酸在在_的的作作用用下下，根根据据碱碱基基互互补补配配对对原原则则合合成成新新的的DNA链。链。905072TaqTaqDNA聚合酶聚合酶两种引物两种引物PCR扩增仪扩增仪PCR扩增仪实际上就是一台能够扩增仪实际上就是一台能够自动调自动调控温度控温度的仪器，它可以根据的仪器，它可以根据DNA的热变的热变性原理性原理，通过自动改变温度，达到扩增，通过自动改变温度，达到扩增DNA片段的目的。片段的目的。体内体内DNADNA复制复制在在DNADNA复制中的作用复制中的作用高温使高温使DNADNA变性变性,双链全双链全部解开，不需解旋酶部解开，不需解旋酶DNADNA母链母链4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶引物引物打开打开DNADNA双链双链提供提供DNADNA复制的模板复制的模板合成子链的原料合成子链的原料催化合成催化合成DNADNA子链子链使使DNADNA聚合酶能够从引聚合酶能够从引物的物的3 3 端开始连接脱端开始连接脱氧核苷酸氧核苷酸请说说请说说PCRPCR技术与体内技术与体内DNADNA复制有什么不同？复制有什么不同？解旋酶解旋酶TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶PCRPCR的技术的技术【学生活动学生活动3】课堂练习，温故知新课堂练习，温故知新PCR反反应还应还需要一定的需要一定的缓缓冲溶液冲溶液模板DNA 3 3 5 5 PCRPCR的反应过程的反应过程新知三新知三 5 50引物引物1 1引物引物2 2 5 5 3 3 5 3 3 95 PCRPCR的反应过程的反应过程 5 引物引物1 1引物引物2 2 5 5 3 3 5 3 3 72Taq酶Taq酶子链子链子链子链第第1 1轮结束轮结束第第2 2轮开始轮开始 PCRPCR的反应过程的反应过程思考思考:你能画出第二轮复制的产物你能画出第二轮复制的产物DNADNA吗？吗？（请标出引物（请标出引物1 1和引物和引物2 2及子链的方向）及子链的方向）【学生活动学生活动4】观看动画：观看动画：PCRPCR技术的操作过程技术的操作过程1 1、上一次循环的产物作为下一次循环、上一次循环的产物作为下一次循环 。2 2、由引物、由引物延伸而成的延伸而成的DNADNA单链会与单链会与 结结合，进行合，进行DNADNA的延伸。的延伸。3 3、子代子代DNADNA单链中，有单链中，有_条无引物存在，条无引物存在，其余单链均有引物。其余单链均有引物。模板模板引物引物两两PCRPCR的反应过程总结：的反应过程总结：思考思考:DNA:DNA复制复制n n次需要引物几个？次需要引物几个？其中含引物的其中含引物的DNADNA有几个？有几个？PCRPCR技术总结技术总结 利用利用DNA分子的热变性原理，通过控制分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外DNA分子的扩增。分子的扩增。四种脱氧核苷酸、耐热四种脱氧核苷酸、耐热的的DNADNA聚合酶、引聚合酶、引物、物、DNADNA模板模板、缓冲溶液和控制温度的温控缓冲溶液和控制温度的温控设备。设备。子链的子链的5端向端向 3端延伸端延伸练习利用利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似复制类似。图图中引物中为单链中引物中为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。从理论上片段，它是子链合成延伸的基础。从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物推测，第四轮循环产物中含有引物A的的DNA片段所占比例为片段所占比例为_。PCR反应体系中含有热稳定反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能反聚合酶，下面的表达式不能反映映DNA聚合酶的功能，这是因为聚合酶的功能，这是因为_。DNADNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链结合到双链DNADNA片段的引物链上片段的引物链上 15/1615/16二、二、PCR反应的实验操作反应的实验操作1 1 1 1、PCRPCRPCRPCR仪仪仪仪（一）设备及用具（一）设备及用具2 2 2 2、微量离心管、微量离心管、微量离心管、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为一种薄壁塑料管，总容积为一种薄壁塑料管，总容积为一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml3 3 3 3、微量移液器、微量移液器、微量移液器、微量移液器用于定量转移用于定量转移用于定量转移用于定量转移PCRPCRPCRPCR配方中的液体，其上的一次性配方中的液体，其上的一次性配方中的液体，其上的一次性配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。吸液枪头用一次更换一次。吸液枪头用一次更换一次。吸液枪头用一次更换一次。能够自动调控温度的仪器能够自动调控温度的仪器能够自动调控温度的仪器能够自动调控温度的仪器（二）（二）PCRPCR的操作步骤的操作步骤（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备准备）（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液移液）（3）盖严盖严离心管口的盖子，用手指离心管口的盖子，用手指轻轻弹击轻轻弹击管壁（管壁（混合混合）（4）将微量离心管放在离心机上）将微量离心管放在离心机上离心约离心约10s（离心离心）（5）将离心管放入）将离心管放入PCR仪上，设置好仪上，设置好PCR仪的循环程序（仪的循环程序（反应反应）循环数循环数循环数循环数变性变性变性变性复性复性复性复性延伸延伸延伸延伸第一次第一次第一次第一次94949494C,10minC,10minC,10minC,10min30303030次次次次4444，30s30s30s30s55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1min最后一次最后一次最后一次最后一次4444，1min1min1min1min55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1min（一）理论上（一）理论上DNADNA扩增数目的计算扩增数目的计算1.1.一条一条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为 。2.a2.a条条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为 。三、结果分析与评价三、结果分析与评价2 na x2 n（二）实验中（二）实验中DNADNA含量的测定含量的测定 可以通过测量可以通过测量DNADNA含量来评价扩增的效果，含量来评价扩增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外线波段有一强烈的吸收的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与峰，峰值的大小与DNADNA的含量有关的含量有关课堂小结课堂小结多多聚聚酶酶链链式式反反应应扩扩增增DNA片片段段PCR原理原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响的变性和复性受温度影响PCR过程过程变性变性复性复性延伸延伸操作步骤操作步骤配制配制PCR反应体系反应体系移入离心管移入离心管放入放入PCR仪仪仪仪设置工作参数设置工作参数DNA扩增扩增测定含量测定含量稀释稀释调零调零测定并读数测定并读数计算计算