猪人工授精-实验室关键技术.ppt

猪人工授精实验室关键技术猪人工授精实验室关键技术 中国农业大学动物科技学院中国农业大学动物科技学院朱士恩Tel:010-627317672007.04.26报告内容报告内容猪人工授精的历史及现状猪人工授精的历史及现状猪人工授精的实验室设备猪人工授精的实验室设备猪人工授精的意义猪人工授精的意义猪精液的人工采集猪精液的人工采集猪精液的品质检查猪精液的品质检查猪精液的保存处理猪精液的保存处理猪精液处理后输精猪精液处理后输精猪人工授精的历史及现状猪人工授精的历史及现状该技术始于该技术始于20世纪世纪30年代，已有年代，已有70多年的历史多年的历史我国始于上世纪我国始于上世纪50年代，未达到理想的推广程度年代，未达到理想的推广程度20世纪世纪90年代后，该技术得到迅速普及年代后，该技术得到迅速普及目前该技术已成为猪配种繁殖的主要手段之一目前该技术已成为猪配种繁殖的主要手段之一猪人工授精的意义猪人工授精的意义减少饲养头数，充分发挥优秀公猪的遗传潜力减少饲养头数，充分发挥优秀公猪的遗传潜力减少疾病传播，提高生产效率，获得更高的经济效益减少疾病传播，提高生产效率，获得更高的经济效益与繁殖控制技术结合，利于现代化养猪技术体系建立与繁殖控制技术结合，利于现代化养猪技术体系建立精液保存技术的发展，加快猪育种进程精液保存技术的发展，加快猪育种进程公畜使用不受其生理年限限制公畜使用不受其生理年限限制便于引入外源群体基因，加快遗传进展的扩散速度便于引入外源群体基因，加快遗传进展的扩散速度实现科学养猪，养猪生产规模化，现代化的重要手段实现科学养猪，养猪生产规模化，现代化的重要手段精液的冷冻保存，可降低活体保种成本，防止基因漂变精液的冷冻保存，可降低活体保种成本，防止基因漂变猪人工授精的实验室设备猪人工授精的实验室设备 仪仪 器器显微镜、精子密度测定仪、电子天平显微镜、精子密度测定仪、电子天平、恒温水浴、恒温水浴锅、恒温精液保存箱、锅、恒温精液保存箱、pH计（试纸）、计（试纸）、精子计数精子计数数器、移液器等数器、移液器等 器器 皿皿温度计、量筒、烧杯、保温瓶、温度计、量筒、烧杯、保温瓶、采精杯采精杯、玻璃棒等、玻璃棒等 消耗品消耗品纱布、输精瓶、输精管、乳胶手套、采精袋纱布、输精瓶、输精管、乳胶手套、采精袋、稀稀稀释粉等稀释粉等猪精液的采集猪精液的采集采采集集前前的的准准备备工工作作猪猪精精液液采采精精的的方方法法精液采集前的准备工作精液采集前的准备工作实实验验室室的的准准备备精精液液稀稀释释液液准准备备操操作作人人员员的的准准备备采采精精器器皿皿的的准准备备检检测测仪仪器器的的准准备备分分装装器器皿皿的的准准备备采采精精公公猪猪的的准准备备猪的人工采精方法猪的人工采精方法电电刺刺激激采采精精法法手手握握采采精精法法假假阴阴道道采采精精法法手握采精法手握采精法用温的生理盐水清洗猪腹部和包皮用温的生理盐水清洗猪腹部和包皮 一手带双层手套，另一手持集精杯一手带双层手套，另一手持集精杯公猪伸出阴茎时，脱去外层手套公猪伸出阴茎时，脱去外层手套 用手紧握伸出的公猪阴茎螺旋状龟头用手紧握伸出的公猪阴茎螺旋状龟头顺其向前冲力将阴茎的顺其向前冲力将阴茎的“S”状弯曲拉直状弯曲拉直 收集浓份精液于集精杯的一次性采精袋收集浓份精液于集精杯的一次性采精袋 采精流程采精流程采精流程采精流程 成年公猪：成年公猪：2次次/周周 采精频率采精频率采精频率采精频率青年公猪：青年公猪：1次次/周周 猪精液的品质检查猪精液的品质检查品品质质检检查查的的目目的的精精液液显显微微镜镜检检查查精精液液外外观观检检查查精液的外观检查精液的外观检查 颜颜颜颜 色色色色 乳白色或浅灰色乳白色或浅灰色呈云雾状呈云雾状 绿色、黄色绿色、黄色 浅红色、红褐色浅红色、红褐色 气气气气 味味味味略带腥味略带腥味 恶臭等异常气味恶臭等异常气味 pH pH 值值值值正常精液正常精液pH值为值为 7.07.8pH值越低值越低,精子密度越大精子密度越大 采精量采精量采精量采精量 电子天平称量法电子天平称量法按按1g=1 ml计计 射精量为射精量为200500 ml 正常正常正常正常异常异常异常异常精液的显微镜检查精液的显微镜检查 精精子子活活率率检检查查精精子子畸畸形形率率检检查查精精子子密密度度检检查查精子活率检查精子活率检查玻片升温至玻片升温至37 取精液取精液10l制片制片 于于37恒温台上恒温台上 相差显微镜下相差显微镜下 400倍观察精子倍观察精子 与受精能力相关与受精能力相关 精子活率精子活率精液品质的指标精液品质的指标 按按0.11.0的十级评分法进行评估的十级评分法进行评估 目测估测法目测估测法活率要求活率要求 鲜精活率鲜精活率0.7才可进行稀释配制才可进行稀释配制 保存精液活率保存精液活率0.6才可以使用才可以使用 精子密度检查精子密度检查估测法估测法估测法估测法 精子密度仪法精子密度仪法精子密度仪法精子密度仪法 血细胞计数法血细胞计数法血细胞计数法血细胞计数法 主观性强，误差大主观性强，误差大主观性强，误差大主观性强，误差大一个精子为一个精子为“密密”一个精子为一个精子为“中中”一个精子为一个精子为“稀稀”最准确，但速度慢最准确，但速度慢最准确，但速度慢最准确，但速度慢滴上滴上1滴稀释精液滴稀释精液原精液原精液200L3%NaCl稀释稀释10倍倍计数板上放盖玻片计数板上放盖玻片计数计数5个中方格精子个中方格精子将该数乘以将该数乘以50万万 方便、时间短、方便、时间短、方便、时间短、方便、时间短、重复性好重复性好重复性好重复性好猪精子密度一般为猪精子密度一般为猪精子密度一般为猪精子密度一般为2323亿亿亿亿/ml/ml生产上主要以精子密度仪法检测生产上主要以精子密度仪法检测生产上主要以精子密度仪法检测生产上主要以精子密度仪法检测 精子计数注意：让稀释后的精液通过毛细作用自行吸入！用吸管稀释后精液用吸管稀释后精液注入计数室注入计数室共有两个对称的计数室精子计数精子计数室及一个中方格精子计数室及一个中方格精子计数方法精子计数方法以图示次序计数，精子以图示次序计数，精子的头部为准，依数上不的头部为准，依数上不数下，数左不数右的原数下，数左不数右的原则进行计数格线上的精则进行计数格线上的精子。白色精子不计数子。白色精子不计数计算公式计算公式 1ml原精液内的精子数原精液内的精子数5个中方个数的个中方个数的精子数精子数5 10 1000 稀释倍数稀释倍数 （如为原精液不（如为原精液不 稀释倍数）稀释倍数）精子畸形率检查精子畸形率检查取中层精液抹片 固定液固定20minGiemsa染色90min水洗并风干置1000倍油镜下观察精子 300个畸形率检查方法畸形率检查方法 相差显微镜直接观察伊红或姬姆萨等染色后普通显微镜观察畸形率要求畸形率要求 一般要求不超过18%为宜染色后显微镜观查染色后显微镜观查 仪器观察精子活力及膜的完整性A.死精子区域:PI,阳性;AnV-FITC,阴性。B.死精子区域:PI,阳性;AnV-FITC,阳性。C.活精子区域:PI,阴性;AnV-FITC,阴性。D.活精子区域:PI,阴性;AnV-FITC,阳性。A)A)A)H33342 标记所有精子细胞核呈现蓝色荧光；B)PI标记死精子的细胞核呈现红色荧光；C)发生顶体反应或顶体膜破损的精子被FITC-PNA 标记,呈现绿色顶体。l荧光显微镜下观察精子的活力和顶体状态荧光显微镜下观察精子的活力和顶体状态l流式细胞仪观察精子的活力和顶体状态流式细胞仪观察精子的活力和顶体状态B)B)C)C)猪精液的保存处理猪精液的保存处理精液的稀释精液的稀释精液的分装精液的分装精液的保存精液的保存精液的冷冻及解冻精液的冷冻及解冻精液的运输精液的运输精液的稀释精液的稀释器具须消毒，使用前，用少量稀释液冲洗一遍品质检查不合格(活率0.7)的精液不能稀释精液采集后尽快稀释,原精贮存时间不宜超过30min稀释时严禁太阳光直射精液,应于较暗处操作精液要求等温稀释,以精液为标准,调节稀释液温度稀释液沿杯壁加入到精液中,沿一个方向搅拌混匀高倍稀释时先进行低倍稀释,以防“稀释打击”稀释倍数:根据精液的品质,输精量,配种母猪头数以每个输精剂量40亿/80 100ml来确定稀释倍数稀释后要求静置片刻再作精子活率检查采精量采精量200 ml,活率活率0.8,密度密度2亿亿/ml,每每个输精剂量含个输精剂量含40亿亿/100 ml。总精子数总精子数=200 ml 2亿亿/ml=400亿亿稀释份数稀释份数=400亿亿 0.8/40亿亿=8份份需稀释液需稀释液=8100 ml-200 ml=600 ml精液的分装精液的分装精液的分装精液的分装 瓶装管装袋装分装简单方便用于冷冻保存输精方便，但需分装机分装后标注分装后标注 公猪品种公猪耳号生产日期稀释液名称稀释后分装的猪精液精液的保存精液的保存保存温度保存温度 常温（17等）低温（4等）冷冻（-196）生产上：常温17常温保存要求常温保存要求 精液需缓慢降温，室温12h或纱布包裹每12h将精液摇匀1次，要轻缓均匀注意冰箱内温度的变化防止温度升高或降低减少保存箱开关次数，以减少对精子的影响使用前检查活率，活率0.6精液应弃之用稀释液保存的精液，应尽快用完精液的冷冻及解冻方法精液的冷冻及解冻方法(Westendorf et al.设计，设计，Bwanga et al 改进改进)稀释流程稀释流程 冷冻流程冷冻流程解冻流程解冻流程 精液采集并进行质量检查 用BTS稀释，降温（15，3 h）离心（800g，10 min），弃除上清 用LEY稀释，降温（5，2 h）5条件下，用含甘油的LEY稀释 分装于5ml扁平袋（细管）或0.5 ml细管 置于冷冻支架并移入程序冷冻仪（5）3/min，5 -5，保持 1 min结晶 50/min，-5 -140，液氮储存 5ml扁平袋:50，13 s 5ml 细管:50 ，40 s 0.5ml 细管:50，12 s或37,20s精液的运输精液的运输精液运输关键精液运输关键 保温、防震、避光运输注意事项运输注意事项 运输前应检查活率，低于0.7的精液严禁调出包装瓶（袋）应排尽空气，以减少运输震荡运输过程中，放入保温箱中保温（1618）到达目的地，检查精子活率，合格方可接收运输过程中，应严格避光输精输精输精的时间输精的时间输精的方法输精的方法填写输精记录填写输精记录人工授精人工授精（Artifical insemination：AI）借助于专门的器械，用人工的方法采取借助于专门的器械，用人工的方法采取公畜精液，经体外检查与处理后，再输公畜精液，经体外检查与处理后，再输入发情母畜的生殖道内，使其受胎的一入发情母畜的生殖道内，使其受胎的一种繁殖技术。种繁殖技术。人工授精技术包括：人工授精技术包括：采精采精精液品质评定精液品质评定稀释稀释保存保存运运输输输精等环节。输精等环节。输精的时间输精的时间输精时间输精时间 第一次输精：出现静立反射后12h左右进行第二次输精：第一次输精后812h进行竖耳，阴部红肿，出现静立反射母猪接收公猪或其它母猪的爬跨有爬跨其它母猪的行为发情母猪表现发情母猪表现 猪发情症状与人工授精最佳时间l l受精率：受精率：受精率：受精率：静立前一天：静立前一天：静立前一天：静立前一天：10%10%；静立第一天：；静立第一天：；静立第一天：；静立第一天：70%70%；静立第二天：；静立第二天：；静立第二天：；静立第二天：98%98%；静立第三天：；静立第三天：；静立第三天：；静立第三天：15%15%l l最佳时间：最佳时间：最佳时间：最佳时间：静立后静立后静立后静立后1224h1224h输输 精精 方方 法法子宫颈输精法子宫颈输精法 intra-cervical insemination，intra-CAI子宫内输精法子宫内输精法 post-cervical insemination，post-CAI子宫角输精法子宫角输精法 deep uterine insemination，DUI 宫颈输精法宫颈输精法 消毒清洁双手，戴上消毒手套 清洁母猪外阴、尾根及臀部周围 取出灭菌后的输精管，在其前端涂上润滑剂 将输精管45向上插入母猪生殖道内直到子宫颈 取出精液轻轻摇匀，去除瓶嘴，接输精管，输精 输精完毕后抽出输精管输精流程输精流程输精流程输精流程 输精次数输精次数输精次数输精次数 一个情期内输精两次(间隔812 h)猪人工授精 精子在母畜生殖道运行中的损耗精子在母畜生殖道运行中的损耗 射精后的精子射精后的精子在母畜生殖道在母畜生殖道内要通过三道内要通过三道屏障：屏障：子宫颈子宫颈子宫子宫腺窝与宫管结腺窝与宫管结合部合部壶峡连壶峡连接部接部精子在受精前的准备精子在受精前的准备（精子获能与顶体反应）（精子获能与顶体反应）精子在母畜生殖道内存活时间精子在母畜生殖道内存活时间和维持受精能力的时间和维持受精能力的时间动动物品种物品种牛牛猪猪羊羊马马维维持存活持存活时间时间1556h50h48h6d维维持受精能力持受精能力1820h812h1216h420h各种家畜精液的稀释倍数和输精剂量各种家畜精液的稀释倍数和输精剂量家畜种家畜种类类稀释比稀释比例例输精计输精计量量（ml）有效精有效精子数子数（亿）（亿）猪猪1:1330501020牛牛1:104011.50.10.5马马1:1320302.55.0羊羊1:130.10.20.5冻精解冻和输精过程中应注意的事项冻精解冻和输精过程中应注意的事项解冻水浴温度应为解冻水浴温度应为39适宜适宜;三防三防(寒、热、光寒、热、光)，一快，一快(输精时间输精时间);保证有效精子数保证有效精子数(活率活率0.3);严格操作规程严格操作规程(卫生、消毒、禁止吸烟、解冻方式要卫生、消毒、禁止吸烟、解冻方式要规范规范);检查卵泡的发育程度（内窥镜输精法）。检查卵泡的发育程度（内窥镜输精法）。猪人工授精最佳部位猪腹腔内窥镜于子宫角输精