分子生物学--核酸的生物合成.ppt

第十章 核酸的生物合成第十章第十章 核酸的生物合成核酸的生物合成第一节第一节 DNADNA的生物合成的生物合成一、一、DNADNA的半保留复制的半保留复制复制复制：以亲代以亲代DNADNA分子为模板指导合成分子为模板指导合成相同的子代相同的子代DNADNA分子的过程分子的过程。MeselsonMeselson等用氮的同位素进行了试验证等用氮的同位素进行了试验证明了明了DNADNA复制为半保留复制机理复制为半保留复制机理半半保留复制保留复制：DNADNA复制时以亲代复制时以亲代DNADNA两两条链为模板指导合成与其互补的条链为模板指导合成与其互补的DNADNA链，链，这样在子代这样在子代DNADNA中，一条链来于亲代中，一条链来于亲代DNADNA，另一条链是新合成的。另一条链是新合成的。DNA DNA 的这的这种复制方式称为半保留复制种复制方式称为半保留复制第十章 核酸的生物合成15N/15N用含用含15N氯氯化铵连化铵连续培养续培养许多代许多代半半保保留留复复制制试试验验14N/15N用含用含14N培养培养基培养基培养1代代14N/14N14N/15N用含用含14N培养培养基培养基培养1代代第十章 核酸的生物合成1.DNA聚合酶聚合酶：催化反应的要点：催化反应的要点：底物：底物：四种四种dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）模板：模板：DNA链链 聚聚合合方方式式：按按照照碱碱基基配配对对原原则则，将将相相应应dNTP的的5磷磷酸酸与与上上一一个个核核苷苷酸酸的的3 羟羟基基形形成成3 5磷磷酸酸二二酯酯键键，即即合合成成方方向向为为5 3，与与模模板板链链反平行反平行。条件：条件：聚合反应必须聚合反应必须有引物有引物存在。存在。二、参与二、参与DNA复制的酶和辅助因子复制的酶和辅助因子dNTP+核苷酸链核苷酸链n PPi+核苷酸核苷酸链n+1 DNA聚合酶聚合酶PPi+H2O 2Pi焦磷酸酶焦磷酸酶第十章 核酸的生物合成DNA聚合酶催化机理第十章 核酸的生物合成（1）大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶：共有三种，：共有三种，为为DNA聚合酶聚合酶 I、II、IIIIIIIII亚基数亚基数1410M.W103 00088 000830 000聚合作用聚合作用连续聚合作用连续聚合作用小小较小较小很大很大聚合速度聚合速度(N/s)162040250100053 外切酶外切酶35 外切酶外切酶功能功能复制中去除引复制中去除引物填补缺口物填补缺口参与损伤修复参与损伤修复可能参与损可能参与损伤修复伤修复DNA复制的主要酶复制的主要酶第十章 核酸的生物合成2.引发酶引发酶 功能：可以从无到有地以功能：可以从无到有地以DNA为模板，催化合成为模板，催化合成一小段与一小段与DNA互互补的补的RNA即引物即引物（10个核苷酸左右）。个核苷酸左右）。引物酶本身无活性，只有与另外引物酶本身无活性，只有与另外6种蛋种蛋白质结合为白质结合为引发体引发体才可催化引物的合成。才可催化引物的合成。（2）真核生物真核生物DNA聚合酶聚合酶：共有四种，为：共有四种，为DNA聚合酶聚合酶a a、b b、g g、d da ab bg gd d功功 能能复制的主要复制的主要酶，与后随酶，与后随链合成有关链合成有关DNA损伤修损伤修复复线粒体线粒体DNA的复制的复制复制的主要复制的主要酶，与先导酶，与先导链合成有关链合成有关第十章 核酸的生物合成3.DNA连接酶连接酶 功能功能：将复制过程中形成的将复制过程中形成的DNA片段用片段用3 5磷酸二酯磷酸二酯键连接起来。键连接起来。酶酶（部分细菌）第十章 核酸的生物合成4.DNA解螺旋酶（解链酶）解螺旋酶（解链酶）利用利用ATP 供应供应能量，水解碱基间氢键，从而打开能量，水解碱基间氢键，从而打开DNA双双螺旋的双链螺旋的双链5.单链结合蛋白（单链结合蛋白（SSB）可与由解链酶解可与由解链酶解开的单链结合开的单链结合 功能功能：防止单链再次形成双链，防止核防止单链再次形成双链，防止核酸酶水解多核苷酸链，保护酸酶水解多核苷酸链，保护DNA。可以可以重复使用重复使用，即当所结合的单链进行，即当所结合的单链进行复制时，它就发生解离，而与新解开的单复制时，它就发生解离，而与新解开的单链结合。链结合。535353553第十章 核酸的生物合成6.DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 通过催化通过催化DNA拓扑结构的变化，拓扑结构的变化，减少由于解链形成减少由于解链形成的张力和合成的子代的张力和合成的子代DNA形成双螺旋。形成双螺旋。7.7.其它因子其它因子解链解链双螺旋存双螺旋存在张力在张力DNA拓扑拓扑异构酶异构酶 II张力解除张力解除第十章 核酸的生物合成复制起点1.起始起始 DNA分子上有特定的起始位点。在一些因子的作用下，分子上有特定的起始位点。在一些因子的作用下，DNA部分解链，形成了一个部分解链，形成了一个“复制眼复制眼”三、三、大肠杆菌大肠杆菌DNA的复制过程的复制过程第十章 核酸的生物合成复制叉模型DNA DNA 分子中正在分子中正在复制的部位，称复制的部位，称为复制叉。它是为复制叉。它是由两股解开的亲由两股解开的亲代链和在其上新代链和在其上新合成的子链、酶、合成的子链、酶、因子组成。因子组成。引物体引物酶因子解螺旋酶SSB(单链结合蛋白)5533复制叉移动方向DNA聚合酶第十章 核酸的生物合成DNA 5DNA 335A-T-G-G-C-A-A-A-TT-A-C-C-G-T-T-T-ARNA 5DNA 335A-T-G-C-C-A-G-A-TU-A-C-G-G-U-C-U-A553353553353553ATPGTPUTPCTPPPidATPdGTPdTTPdCTPPPiDNA聚合酶2.延长第十章 核酸的生物合成5355353553第十章 核酸的生物合成553335535533353第十章 核酸的生物合成535535335533355335第十章 核酸的生物合成53335535冈崎冈崎片段片段（Okazaki fragment）原核生物原核生物10002000个个核苷酸核苷酸复制机理：半不连续复制复制机理：半不连续复制第十章 核酸的生物合成ATTGCUGTAACGAC AAUUGCUGTAACGAC AUUGCUGTAACGAC ATUGCUGTAACGAC AdTTPUdTTPUAUUGCUGTAACGAC dATPdGTPGCUGdCTPdTTPdGTPDNA聚聚合酶合酶 I第十章 核酸的生物合成ATTGCTGTAACGAC AATTGCTGTAACGAC AATTGCTGTAACGAC AATP或或NADAMP或或NMN连接酶ATTGCTGTAACGAC A第十章 核酸的生物合成DDCCBBA53533535连续链连续链不连续链不连续链先导链先导链后随链后随链(滞后链滞后链)DNADNA复制机理复制机理第十章 核酸的生物合成3535DNA聚聚合酶合酶 I5335连接酶连接酶SSB引物体DNA聚聚合酶合酶 III解螺旋酶D DN NA A复复制制系系统统DNADNA拓扑拓扑异构酶异构酶I IDNA拓扑异构酶II第十章 核酸的生物合成3.终止终止 DNA复制无特定终止位点，复制链到达前面已复制成的片复制无特定终止位点，复制链到达前面已复制成的片段则自动终止四、四、原核与真核细胞原核与真核细胞DNA复制的特点复制的特点 1.原核细胞原核细胞DNA复制的特点复制的特点：单个起点，多数为双向复制，少数为单：单个起点，多数为双向复制，少数为单向复制向复制 2.真核细胞真核细胞DNA复制的特点复制的特点：真核细胞：真核细胞DNA复制与原核细胞复制与原核细胞DNA复制复制系统及过程基本相同，不同之处在于：系统及过程基本相同，不同之处在于：（1）多个起点多个起点 （2）均为双向复制均为双向复制第十章 核酸的生物合成（3）酶系统酶系统：DNA聚合酶不同聚合酶不同，原核细胞两条链是同一种聚合酶催，原核细胞两条链是同一种聚合酶催化，真核细胞中是不同聚合酶催化。化，真核细胞中是不同聚合酶催化。去除引物、填补缺口的酶不同去除引物、填补缺口的酶不同，原核细胞中是，原核细胞中是DNA聚合酶聚合酶 I，真真核细胞相应的酶还未找到。核细胞相应的酶还未找到。因子不同因子不同第十章 核酸的生物合成1.概念概念 以以RNA为为模板合成模板合成DNA的过程的过程2.反转录酶反转录酶 存在于真核生物的存在于真核生物的RNA肿瘤病毒中。肿瘤病毒中。催化特性：催化特性：以四种以四种dNTP为底物，需模板和引物。为底物，需模板和引物。以病毒以病毒RNA为模板，合成互补为模板，合成互补DNA。具有核糖核酸酶功能，水解具有核糖核酸酶功能，水解RNADNA杂合分子中的杂合分子中的RNA。以自己合成的以自己合成的DNA链为链为模板合成互补的模板合成互补的DNA，从而形成双从而形成双螺旋分子。螺旋分子。催化过程：催化过程：DNARNA五、五、反转录（逆转录）反转录（逆转录）第十章 核酸的生物合成六、基因扩增（人工体外合成DNA）加热加热降温降温引物、底物循环操作聚合酶链式反应（PCR）系统系统：模板（DNA片段）、酶、引物、底物（4种dNTP）过程过程：PCR过程过程第十章 核酸的生物合成第二节第二节 RNA的生物合成的生物合成一、一、概念概念 转录转录：以以DNA为模板合成为模板合成RNA的过程的过程 不对称转录不对称转录：以以DNA一条链为模板转录一条链为模板转录RNA的方的方式式533355DNARNA转录方向转录方向反意义链反意义链（模板链、（模板链、编码链、编码链、（）链）（）链）有意义链有意义链（非模板链、（非模板链、非编码链、非编码链、（+）链）链）转录单位转录单位：DNA中中指导转录一条指导转录一条RNA链的全部序列。链的全部序列。二、二、大肠杆菌大肠杆菌RNA的转录的转录1.E.coli RNA聚合酶聚合酶：以四种：以四种NTP（ATP、GTP、CTP、UTP）为为底物底物，以以DNA链为链为模板模板，按照，按照碱基配对原则碱基配对原则，将相应的，将相应的NTP的的5磷酸与上一个磷酸与上一个核苷酸的核苷酸的3 羟基形成羟基形成3 5磷酸二酯键，即磷酸二酯键，即合成方向为合成方向为5 3。聚合反。聚合反应应不需要引物不需要引物。第十章 核酸的生物合成RNA聚聚合合酶酶催催化化机机理理AAGAGTCTCUCUOHHOOHGGTPRNA模板DNA5335 OH OH OH OHAGAGTCTCAUCUOHHOG3355 OH OH OH OH第十章 核酸的生物合成结构：2 全酶（转录起始）+核心酶（转录延长）重复使用MW40000结合启动子结合启动子MW155000催化催化MW160000结合模板结合模板MW70000识别启动子、识别启动子、起始起始2.转录过程转录过程 （1）起始起始：起始区在转录单位的启动子部位。：起始区在转录单位的启动子部位。启动子启动子转录起始过程中，转录起始过程中，RNA聚合酶识别、结合并开始转录聚合酶识别、结合并开始转录DNA序列序列。由由三三部部分分组组成成，RNA聚聚合合酶酶识识别别序序列列、RNA聚聚合合酶酶结结合合序序列列和和解解链链并并开开始始转录位点转录位点。识别序列结合序列起始位点启动子第十章 核酸的生物合成识识别别识别序列识别序列结合序列结合序列起始位点起始位点启动子启动子RNA聚合酶（全酶）结结合合转转录录开开始始转录起始转录起始第十章 核酸的生物合成（2）延伸延伸：在：在RNA聚合酶催化下，以模板链为聚合酶催化下，以模板链为模板按模板按5 3方向方向合成互补的合成互补的RNA链链553353RNA聚合酶DNARNA转录延长转录延长第十章 核酸的生物合成RNARNA聚合酶终止的方式终止的方式：（1）强终止强终止只依靠终止子就可使只依靠终止子就可使RNA转录终止，转录终止，并释放合成的并释放合成的RNA链和链和RNA聚合酶。又叫不依赖于聚合酶。又叫不依赖于 因子的终止。因子的终止。（3）终止终止：RNA聚合酶到达转录终止区，则停止转录。聚合酶到达转录终止区，则停止转录。终止子终止子能够使能够使RNA转录停止转录停止DNA序列序列。强强终止机理终止机理第十章 核酸的生物合成（2）弱终止弱终止不仅需要终止子，而且需要不仅需要终止子，而且需要 因子才能停止转录并释放因子才能停止转录并释放RNA和和RNA聚合酶的终止方式。又叫依赖于聚合酶的终止方式。又叫依赖于 因子的终止因子的终止转录停止因子RNARNA聚合酶因子弱弱终止终止机理机理第十章 核酸的生物合成RNA转录过程转录过程RNA聚合酶（全酶）启动子DNA终止子5533RNARNA聚合酶（核心酶）再与RNA聚合酶结合起始终止延长第十章 核酸的生物合成真核细胞真核细胞RNA的转录机理与原核的转录机理与原核RNA转录机理基本相同。主要不同之处为：转录机理基本相同。主要不同之处为：1.启动子复杂启动子复杂2.需要多种因子参与需要多种因子参与3.RNA聚合酶不同聚合酶不同。真核。真核RNA聚合酶有三种，即聚合酶有三种，即RNA聚合酶聚合酶I、II、III，它们的性质与功能如下：它们的性质与功能如下：类型类型IIIIII核内分布核内分布亚基亚基产物产物a a-鹅膏蕈碱鹅膏蕈碱效应效应核仁核仁rRNA前体前体不敏感不敏感核质核质12个个hnRNA(mRNA前体前体)高度敏感高度敏感核质核质tRNA和和5SrRNA中度敏感中度敏感另外，线粒体、叶绿体也有各自的转录系统，转录各自的另外，线粒体、叶绿体也有各自的转录系统，转录各自的RNA。三、三、真核细胞真核细胞RNA的转录的转录第十章 核酸的生物合成四、四、RNA转录后的加工转录后的加工1.rRNA加工加工 （1）剪接剪接：如原核细胞：如原核细胞 rRNA前体的加工前体的加工（2）修饰修饰：主要是甲基化：主要是甲基化M16:16S rRNA成熟酶 M23:23S rRNA成熟酶 M5:5S rRNA成熟酶M16M16M23M23M516S rRNAtRNA23S rRNA5S rRNAtRNA16S rRNA23S rRNA5S rRNAtRNAtRNAIIIIIIIIIIIIEEIII:RNaseIII E:RNaseE第十章 核酸的生物合成2.tRNA的的加工加工 （1 1）剪切剪切RNasePRNaseFRNaseD第十章 核酸的生物合成(2)修饰修饰：3加加CCA。剪切加工后，全部的真核剪切加工后，全部的真核tRNA和原核细胞中一和原核细胞中一大类大类tRNA无无3端的端的CCA，需要在修饰加工中加上。需要在修饰加工中加上。2CTPATPACC 其它修饰其它修饰：如还原、糖苷键移位、甲基化等。：如还原、糖苷键移位、甲基化等。3.真核真核mRNA的加工的加工 （1）5 加帽子，加帽子，3 加尾巴加尾巴尾巴帽子GTP、甲基供体n ATPhnRNAmRNA第十章 核酸的生物合成（2）剪接剪接：真核细胞的蛋白质基因是：真核细胞的蛋白质基因是断裂基因断裂基因，即一个基因中有的片段，即一个基因中有的片段具有指导合成蛋白质的信息，而有的片段无此信息。这样指导合成出的具有指导合成蛋白质的信息，而有的片段无此信息。这样指导合成出的hnRNA 中中有的片段在有的片段在mRNA中存在，而有的片段在加工过程中剪切掉了。中存在，而有的片段在加工过程中剪切掉了。DNA和和hnRNA中在中在mRNA中出现的相应序列称为中出现的相应序列称为外显子外显子 DNA和和hnRNA中在中在mRNA中出现的相应序列称为中出现的相应序列称为内含子内含子断裂基因hnRNAmRNA内含子外显子转录剪接（3）其它修饰mRNA剪接机理剪接机理第十章 核酸的生物合成 （1）转录产物的种类转录产物的种类：简单转录产物简单转录产物：只产生一种成熟只产生一种成熟mRNA的的hnRNA。复杂转录产物复杂转录产物：可产生几种成熟可产生几种成熟mRNA的的hnRNA。（2）复杂转录产物的加工及其产物复杂转录产物的加工及其产物 加工方式加工方式：多个切割并加接多个切割并加接polyA位点位点 不同的剪接方式不同的剪接方式 例如例如：大鼠钙调素基因转录的：大鼠钙调素基因转录的hnRNA的加工的加工内含子hnRNAA-(A)n-AA-(A)n-AA-(A)n-AA-(A)n-A降钙素降钙素基因相关蛋白甲状腺组织大脑4.hnRNA的多种方式加工的多种方式加工第十章 核酸的生物合成RNA复制酶：催化性质：以复制酶：催化性质：以4种种NTP为为底物底物，以，以RNA为为模板模板，按照，按照碱基配碱基配对原则对原则进行聚合反应，进行聚合反应，合成方向为合成方向为5 3。聚合反应。聚合反应不需要引物不需要引物。RNA（正链）正链）RNA（负链）负链）多个多个RNA五、五、RNA复制复制 以以RNA为模板合成为模板合成RNA的过程。的过程。第十章 核酸的生物合成第三节第三节 基因工程简介基因工程简介一、一、目的基因的取得目的基因的取得 1.逆转录法逆转录法mRNADNA目的基因2.限制性内切酶法限制性内切酶法限制性内切酶目的基因DNA3.人工合成人工合成第十章 核酸的生物合成 基因载体基因载体：质粒、病毒等：质粒、病毒等 基因重组过程：基因重组过程：三、三、转化、克隆、筛选转化、克隆、筛选重组DNA载体DNA目的基因限制性内切酶转化克隆表达、筛选、利用二、二、基因重组基因重组第十章 核酸的生物合成五、五、基因工程的利用基因工程的利用 1.培育新的动植物品种培育新的动植物品种 2.利用微生物作为利用微生物作为“生物化工厂生物化工厂”3.治疗治疗四、四、基因扩增基因扩增 聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR）加热变性加热变性降温复制加热变性降温复制降温复制聚合酶、引物、底物等聚合酶、引物、底物等