酶工程 第三章 酶的分离纯化.ppt

第三章第三章 酶的分离纯化3.1 酶分离纯化的技术路线3.2 细胞破碎3.3 酶的分离方法3.4 酶的浓缩、干燥与结晶3.5 酶制剂的保存酶制剂的保存 3.1 3.1 酶分离纯化的技术路线酶分离纯化的技术路线细胞破碎细胞破碎酶酶分离纯化分离纯化酶酶浓缩浓缩酶酶贮存贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心，过滤，沉淀，层析，电离心，过滤，沉淀，层析，电泳，萃取，结晶等。泳，萃取，结晶等。(1)(1)粗粗蛋白质蛋白质 (crude(crude protein):protein):采样采样 均均质质打破打破细胞胞 抽出全蛋白，多用抽出全蛋白，多用 盐盐析析沉淀沉淀法法；粗略去除；粗略去除蛋白蛋白质以外的物以外的物质。(2)(2)部分部分纯化化 (partially(partially purified):purified):初步的初步的纯化，使用化，使用柱柱层层析法析法。(1)(1)(3)(3)均均质酶质酶 (homogeneous):(homogeneous):(2)(2)目标酶进目标酶进一步精制一步精制纯化，可用化，可用制备制备式式电泳电泳 或或 HPLCHPLC。酶分离纯化三个阶段3.2 细胞破碎细胞破碎1）机械破碎）机械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化学破碎）化学破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机胞粉碎机细胞胞破破碎碎珠珠高高压细胞胞破破碎碎机机DY89-I型型 电动玻璃匀玻璃匀浆机机机械破碎捣碎法研磨法匀浆法 通过机械运动产生的通过机械运动产生的剪切力，使组织、细剪切力，使组织、细胞破碎。胞破碎。细细胞破碎方法及其原理胞破碎方法及其原理JJ-2组织捣碎匀浆机 WSK卧式高效全能珠磨机破碎过程产生大量的热能，在设计操作时应考虑换热能力问题。(1)研磨法l适用于绝大多数微生物细胞l原理：珠磨机的破碎室内填充玻璃或氧化锆微球。在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。(2)捣碎法l动、植物材料 l高速捣碎器操作简便，破碎效果好，但易引起局部温度过高，必须考虑酶的特点谨慎使用。(3)匀浆法l适用于酵母和大多数细菌细胞l原理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出后撞击到碰撞环碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，在撞击力和剪切力等的综合作用下破碎。物理破碎渗透压法冻融法超声波法 通过各种物理因素的作通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外用，使组织、细胞的外层结构破坏。层结构破坏。超声波破碎仪(1)渗透压法l最温和的细胞破碎法l适于易于破碎的细胞，如动物细胞和G-菌。l将细胞置于高渗透压的介质中，达到平衡后，将介质突然稀释或将细胞转置于低渗透压的水或缓冲溶液中。在渗透压的作用下，水渗透通过细胞壁和膜进入细胞，使细胞壁和膜膨胀破裂。(2)冻融法l将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化(反复多次操作)(3)超声波破碎法l原理：在超声波作用下液体发生空穴作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，从而使细胞破碎。l很强烈，适用于多数微生物的破碎。l有机溶剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿l表面活性剂：Triton、Tween化学破碎有机溶剂表面活性剂各种化学试剂对细各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞胞膜的作用使细胞破碎破碎l条件温和、具有选择性。条件温和、具有选择性。l缺点：酶的价格昂贵缺点：酶的价格昂贵l自溶法：不好自溶法：不好 理理由由：自自溶溶液液中中成成份份十十分分复复杂杂；有有破破坏坏待待分离酶的危险。分离酶的危险。酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过细胞本身的酶通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的系或外加酶制剂的催化作用，使细胞催化作用，使细胞外层结构受到破坏外层结构受到破坏3.3 酶的分离方法酶的分离方法3.3.1沉淀分离3.3.2 离心分离3.3.3 过滤与膜分离3.3.4 层析分离3.3.5 电泳分离3.3.6 萃取分离3.3.1 3.3.1 沉淀分离沉淀分离通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶选择性变性沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来复合沉淀法（共沉淀）利用酶与杂质在有机溶剂中的溶解度不同有机溶有机溶剂剂沉沉淀法淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，不同的两性电解质有不同的等电点等等电电点沉淀点沉淀法法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同盐盐析沉淀法析沉淀法分离原理沉淀分离方法在一定的温度和pH值条件下（为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为KsKs分段盐析分段盐析；在一定的盐和离子强度的条件下（KsI为常数），通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为分段盐析分段盐析。原因：盐在溶液中离解为正离子和负离子。原因：盐在溶液中离解为正离子和负离子。由于反离子作用改变了杂蛋白和酶分子表面的电荷，同时离子由于反离子作用改变了杂蛋白和酶分子表面的电荷，同时离子的存在改变了溶液中水的活度，使分子表面的水化膜改变。的存在改变了溶液中水的活度，使分子表面的水化膜改变。最常用最常用的中性盐：硫酸铵硫酸铵。在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度饱和度表示。盐析沉淀法盐析沉淀法盐溶？盐析？原因：有机溶剂使溶液的介电常数降低，使溶质分子间的静电，使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，引力增大，互相吸引而易于凝集，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，使其溶解度降低而沉淀。使其溶解度降低而沉淀。常用的有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等常用的有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法3.3.2 3.3.2 离心分离离心分离离心分离：借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术。根据欲分离物质及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。常速离心机常速离心机(低速离心机低速离心机):最大转速8000 r/min，相对离心力（RCF）1104 g，用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。酶的结晶等较大颗粒的分离。高速离心机高速离心机:最大转速为（12.5）104 r/min，相对离心力 11041105 g，用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。高速冷冻离心机：高速离心机装设有冷冻装置。高速冷冻离心机：高速离心机装设有冷冻装置。超速离心机超速离心机:最大转速(2.512)104 r/min，相对离心力 5105 g。用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。蛋白质蛋白质分子在分子在离心离心時，其時，其 分子量、分子密度分子量、分子密度、组成、组成、形形状状 等，均等，均会影响会影响其沉降速率，其沉降速率，沉降沉降系数系数 即用來描述此沉即用來描述此沉降降性质性质；其其单位为单位为 S。每一每一种种的沉降的沉降系数与系数与其分子密度或分子量成正比。其分子密度或分子量成正比。不同沉降不同沉降系数系数的的蛋白质蛋白质，可利用超高速，可利用超高速离心离心法，在密度法，在密度梯度中作分梯度中作分离离。3.3.3 过滤与膜分离过滤与膜分离 过滤：在压力(或真空)的情况下将悬浮液通过过滤介质使达到固液分离的目的。（1）滤浆（料浆）悬浮液（2）过滤介质 多孔物质（3）滤饼（滤渣）被截留的固体物质（4）滤液（母液）通过过滤介质的液体常用的过滤介质：滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等。过滤非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质 过滤过滤的分的分类类及其特性及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同)类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗粗滤滤 2m酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微微滤滤0.22m细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超超滤滤200.2m病毒、生物大分子等超滤膜反渗透反渗透50%方能结晶。l*不同的酶对结晶时的纯度要求不同。酶纯度达到50%可能结晶 纯度 50%可能无法析出结晶。l酶的结晶并非达到绝对纯化，只是达到相当的纯度。1盐析结晶法l盐：硫酸铵，硫酸钠。2有机溶剂结晶法l常用的溶剂：乙醇、丙酮、丁醇、甲醇、异丙醇、甲基戊二醇等。l特点：含盐少，结晶时间较短，但需低温（0）。3透析平衡结晶法l常用的结晶方法之一。4等电点结晶法3.5 酶制剂的保存酶制剂的保存（一）液体酶制剂（二）固体粗酶制剂（三）纯酶制剂（四）固定化酶制剂（一）液体酶制剂l包括稀酶液和浓缩酶液。l在除去菌体等杂质后，不再纯化而直接制成或加以浓缩。l比较经济，但不稳定，需要添加稳定剂后才能出厂，而且成份复杂，只适于就近的某些工业部门直接应用。（二）固体粗酶制剂l发酵液杀菌后直接浓缩干燥制成；发酵液滤去菌体后喷雾干燥制成；加有淀粉等填充料；初步纯化后制成，如用于洗涤剂用酶。l便于运输和短期保存，成本不高。（三）纯酶制剂l用作分析试剂或用作医疗药物，要求有较高的纯度。l分析工具酶：要求没有干扰作用的杂酶，单位重量的酶制剂中酶活性达到一定单位数l基因工程的工具酶：要求不含非专一性的核酸酶，或完全不含核酸酶。l注射用的医用酶：除去热源类物质。（四）固定化酶制剂l将酶制剂固定化，以提高酶的稳定性，延长酶的保存时间。