pcr的温度设置(精品).ppt

温度与时间的设置温度与时间的设置设置变性设置变性-退火退火-延伸三个温度点延伸三个温度点n设置变性设置变性-退火退火-延伸三个温度点延伸三个温度点n标准反应中采用三温度点法，双链标准反应中采用三温度点法，双链DNA在在9095变性，再迅速冷却至变性，再迅速冷却至40 60，引物退火，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸伸n对于较短靶基因（长度为对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用时）可采用二温度点法，二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般将退火与延伸温度合二为一，一般采用采用94变性，变性，65左右退火与延伸左右退火与延伸 变性温度与时间变性温度与时间n变性温度低，解链不完全是导致变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主失败的最主要原因要原因n一般一般9394lmin足以使模板足以使模板DNA变性变性n若低于若低于93则需延长时间则需延长时间n但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。n此步若不能使靶基因模板或此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，产物完全变性，就会导致就会导致PCR失败失败 退火退火(复性复性)温度与时间温度与时间n退火温度是影响退火温度是影响PCR特异性的较重要因素特异性的较重要因素n变性后温度快速冷却至变性后温度快速冷却至4060，可使引物和，可使引物和模板发生结合。由于模板模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞补链之间的碰撞n退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度及其浓度，还有靶基序列的长度n对于对于20个核苷酸，个核苷酸，G+C含量约含量约50%的引物，的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想为选择最适退火温度的起点较为理想 退火退火(复性复性)温度与时间温度与时间n退火温度是影响退火温度是影响PCR特异性的较重要因素特异性的较重要因素n变性后温度快速冷却至变性后温度快速冷却至4060，可使引物和，可使引物和模板发生结合。由于模板模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞补链之间的碰撞n退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度及其浓度，还有靶基序列的长度n对于对于20个核苷酸，个核苷酸，G+C含量约含量约50%的引物，的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想为选择最适退火温度的起点较为理想引物的复性温度引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度通过以下公式帮助选择合适的温度nTm值（解链温度）值（解链温度）=4（G+C）2（A+T）n复性温度复性温度=Tm值值-（510）n在在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异反应的特异性性n复性时间一般为复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板足以使引物与模板之间完全结合之间完全结合 延伸温度与时间延伸温度与时间nTaq DNA聚合酶的生物学活性：聚合酶的生物学活性：7080 150核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 70 60核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 55 24核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 高于高于90时，时，DNA合成几乎不能进行合成几乎不能进行 延伸温度与时间：延伸温度与时间：n延伸温度：一般选择在延伸温度：一般选择在7075之间之间n常用温度为常用温度为72n过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。n延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定n1Kb以内的以内的DNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min（足够）足够）n34kb的靶序列需的靶序列需34minn扩增扩增10Kb需延伸至需延伸至15minn延伸进间过长会导致非特异性扩增延伸进间过长会导致非特异性扩增n对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些