【课件】2023届高三生物一轮复习课件：基因工程.pptx

1.限制酶来源?在原核生物中的作用是什么？不破坏自身DNA的原因是什么？作用特点？结果？2.同尾酶概念？同尾酶切割后产生的黏性末端为何能够连接？同尾酶切割后产生的黏性末端通过DNA连接酶连接后，该序列还能再被原来的酶识别和切割吗？3.用同一种限制酶切割后，会出现哪些连接情况？用两种限制酶切割后，会出现哪些连接情况？用不同的限制酶切割的目的？4.基因表达载体的构建时基因表达载体的构建时选择选择限制限制酶的原则酶的原则1 1 1.DNA1.DNA连接酶的作用？类型及特点？连接酶的作用？类型及特点？2.2.载体的种类？各自的用途？作为载体必备的条件？质粒的概念？载体的种类？各自的用途？作为载体必备的条件？质粒的概念？3.3.DNADNA的粗提取与鉴定实验原理？过滤的方法？过滤后取上清液还是取沉淀的粗提取与鉴定实验原理？过滤的方法？过滤后取上清液还是取沉淀物？析出的操作步骤？物？析出的操作步骤？2 2 1.1.基因工程的基本操作程序？基因工程操作环境？基因工程的基本操作程序？基因工程操作环境？操作水平操作水平？原理原理？2.2.目的基因的筛选与获取方法？目的基因的筛选与获取方法？3.3.逆转录法的过程？逆转录法的过程？4.4.基因组文库与基因组文库与cDNAcDNA文库的区别文库的区别（3 3 1.1.PCRPCR原理？条件？原理？条件？缓冲溶液中添加缓冲溶液中添加Mg2+Mg2+的作用的作用？过程？过程？鉴定鉴定PCRPCR产物的方产物的方法？用法？用PCRPCR可以扩增可以扩增mRNAmRNA吗？吗？2.2.引物的引物的作用？作用？要求？为何需要为何需要2 2种引物？扩增种引物？扩增n n次需要多少个引物？次需要多少个引物？4 4 当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时：当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时：1.1.若无法获得该蛋白若无法获得该蛋白，原因可能是什么，原因可能是什么？2.2.以上情况如何解决？以上情况如何解决？3.3.若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？，原因可能是？4.4.以上情况如何解决？以上情况如何解决？5.5.若若原核生物原核生物由由mRNAmRNA逆转录形成的逆转录形成的cDNAcDNA与原基因的结构相比有哪些不同？与原基因的结构相比有哪些不同？6.6.若若真核生物真核生物由由mRNAmRNA逆转录形成的逆转录形成的cDNAcDNA与原基因的结构相比有哪些不同？与原基因的结构相比有哪些不同？5 5 1.基因表达载体的构建基因表达载体的构建目的？目的？2.2.基因表达载体基因表达载体组成？组成？3.3.基因表达载体基因表达载体各组成部分的作用？各组成部分的作用？4.4.转化的概念？转化的概念？5.5.将目的基因导入受体细胞的方法及适用范围？将目的基因导入受体细胞的方法及适用范围？6 6 1.1.在培养有些转基因植物时，常用农杆菌转化法，在培养有些转基因植物时，常用农杆菌转化法，农杆菌的作用农杆菌的作用是什么是什么？2.2.原理？原理？3.3.采用农杆菌转化法导入目的基因时，为什么目的基因可以整合到染色体的采用农杆菌转化法导入目的基因时，为什么目的基因可以整合到染色体的DNADNA上上?4.4.目的基因插入染色体目的基因插入染色体DNADNA上的目的上的目的是什么？是什么？5.5.两次拼接、两次导入两次拼接、两次导入6.6.转基因的植物细胞如何获得最终的新品种？转基因的植物细胞如何获得最终的新品种？7 7 1 1、检测与鉴定目的基因的目的：、检测与鉴定目的基因的目的：2 2、检测与鉴定的方法：、检测与鉴定的方法：3 3、PCRPCR技术检测基本原理？技术检测基本原理？4 4、核酸分子杂交技术原理？核酸分子杂交技术原理？8 8 1.1.乳腺生物反应器制备流程？乳腺生物反应器制备流程？2.2.为什么将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件为什么将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起？重组在一起？3 3.药用蛋白基因存在于转基因动物的哪些细胞中？药用蛋白基因存在于转基因动物的哪些细胞中？4 4.生物反应器除了用乳腺，还可以用什么器官？生物反应器除了用乳腺，还可以用什么器官？5 5.膀胱生物反应器哪些方面优于乳腺生物反应器？膀胱生物反应器哪些方面优于乳腺生物反应器？6 6.研制膀胱生物反应器时，应如何处理目的基因研制膀胱生物反应器时，应如何处理目的基因*？7 7.用生物反应器生产药物的优点？用生物反应器生产药物的优点？8.8.转基因技术中会形成新物种吗？转基因技术中会形成新物种吗？9 9.乳腺生物反应器经过有性生殖产生的后代一定可以产生目标蛋白吗乳腺生物反应器经过有性生殖产生的后代一定可以产生目标蛋白吗？9 9 1.乳腺（房）生物反应器与基因工程菌生产药物2.为什么可以用猪的器官解决人类器官移植的来源问题？3.利用转基因技术对猪的器官进行改造，培育不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官，采用什么方法？4.相比从天然产物中提取的酶，构建基因工程菌，然后用发酵技术生产酶，优势？1010 1.1.工程菌工程菌概念概念2.2.用大肠杆菌生产人胰岛素的流程：用大肠杆菌生产人胰岛素的流程：3.3.目前除了可以利用大肠杆菌生产人胰岛素，还可以用酵母菌来生产目前除了可以利用大肠杆菌生产人胰岛素，还可以用酵母菌来生产人胰岛素，请从细胞的结构与功能相适应的角度考虑，二者生产的人人胰岛素，请从细胞的结构与功能相适应的角度考虑，二者生产的人胰岛素有何不同？胰岛素有何不同？4.4.蛋白质工程概念？地位？崛起的缘由蛋白质工程概念？地位？崛起的缘由/1111 基因工程是指按照人们的愿望，通过基因工程是指按照人们的愿望，通过转基转基因等技术因等技术，赋予生物，赋予生物新的遗传特性新的遗传特性，创造出，创造出更符合人们需要的更符合人们需要的新的生物类型和生物制品新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在从技术操作层面看，由于基因工程是在DNADNA分分子水平子水平上进行设计和施工的，因此又叫上进行设计和施工的，因此又叫重组重组DNADNA技术技术。一、限制性内切核酸酶一、限制性内切核酸酶“分子手术刀分子手术刀”1.1.简称：简称：限制酶限制酶2.2.来源：来源：主要是从主要是从原核生物原核生物中分离纯化出来的。中分离纯化出来的。3.3.作用：作用：识别双链识别双链DNADNA分子的分子的特定特定核苷酸序列核苷酸序列，并且，并且使每一条链中使每一条链中特定部位特定部位的的磷酸二磷酸二酯酯键键断开断开。4.4.作用部位：作用部位：特定部位的磷酸二酯键特定部位的磷酸二酯键ATCGTAGC5353磷磷酸酸二二酯酯键键5.5.识别序列：识别序列：大多数限制酶的大多数限制酶的识别序列识别序列由由6 6个核苷酸个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由组成，也有少数限制酶的识别序列由4 4个个、8 8个个或或其他数量其他数量的核苷酸组成。的核苷酸组成。EcoREcoR5 5G-A-A-T-T-CG-A-A-T-T-C3 33 3C-T-T-A-A-G5C-T-T-A-A-G5SmaSma5 5C-C-C-G-G-GC-C-C-G-G-G3 33 3G-G-G-C-C-C5G-G-G-C-C-C5具有专一性6.切割结果：切口有两种：黏性末端和平末端无论是无论是6 6个碱基还是个碱基还是4 4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链两侧的双链DNADNA上的碱基是上的碱基是反向对称重复排列的反向对称重复排列的 ，这就是回文序列。这就是回文序列。能能被限制酶特异性识别的切割部位基本都具有被限制酶特异性识别的切割部位基本都具有回文序列回文序列：在切割：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。当限制酶在它识别序列的当限制酶在它识别序列的_将将DNADNA分子的两条链分别切开分子的两条链分别切开时，产生的是时，产生的是_；当限制酶在它识别序列的当限制酶在它识别序列的_切开时，产生的是切开时，产生的是_；中轴线两侧中轴线两侧黏性末端黏性末端中轴线处中轴线处平末端平末端你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？原核生物容易受到自然界原核生物容易受到自然界外源外源DNADNA的入侵的入侵，所以它在，所以它在长期的进化长期的进化过程中形成了一套完善的过程中形成了一套完善的防御机制防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNADNA入侵时，它会利用限制酶来入侵时，它会利用限制酶来切割外源切割外源DNADNA，使之失效使之失效，以，以保证自身安全保证自身安全。所以，简单来说：限制酶在原核生物中起到的作用为：所以，简单来说：限制酶在原核生物中起到的作用为：切割外源切割外源DNADNA、使之失效，以保证自身安全、使之失效，以保证自身安全试推测限制酶为什么不会切割自身的试推测限制酶为什么不会切割自身的DNADNA？DNADNA分子中分子中不具备这种限制酶的识别切割序列不具备这种限制酶的识别切割序列或或DNADNA分子被分子被修饰修饰（甲基化甲基化），使限制酶不能将其切开），使限制酶不能将其切开限制酶切割目的基因片段时需要切割几次？产生几个末端？断开几个磷酸二酯键？限制酶切割目的基因片段时需要切割几次？产生几个末端？断开几个磷酸二酯键？2 4 42 4 44.4.结果：结果：产生黏性末端或平末端产生黏性末端或平末端 6.6.单酶切：单酶切：容易出现反连和载体、目的基因的自连现象（即所谓环化）容易出现反连和载体、目的基因的自连现象（即所谓环化）双酶切：双酶切：不同的酶作用于不同的碱基序列，得到不同的黏性末端，避免自身环化和反向连接不同的酶作用于不同的碱基序列，得到不同的黏性末端，避免自身环化和反向连接同尾酶：同尾酶：识别的靶序列不同，但是酶切后形成的粘性末端相同，可通过识别的靶序列不同，但是酶切后形成的粘性末端相同，可通过DNADNA连接酶连接，但一般不能连接酶连接，但一般不能再被原来的酶识别和切割再被原来的酶识别和切割1和2为同尾酶，黏性末端均为GATC，1可以切割的位点，2都可以切割9.9.用同一种限制酶切割后，会出现哪些连接情况？用同一种限制酶切割后，会出现哪些连接情况？目的基因目的基因目的基因目的基因、目的基因自身环化、目的基因自身环化、质粒质粒质粒质粒、质粒质粒自身环化、自身环化、目的基因目的基因质粒质粒、目的基因目的基因质粒质粒反向连接反向连接1010.用两种限制酶切割后，会出现哪些连接情况？用两种限制酶切割后，会出现哪些连接情况？目的基因目的基因目的基因、质粒目的基因、质粒质粒、目的基因质粒、目的基因质粒质粒11.11.用不同的限制酶切割：可以用不同的限制酶切割：可以防止防止目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒反向连接目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒反向连接（或（或保证保证目的基因和质粒正确连接）目的基因和质粒正确连接）【思考】【思考】用限制酶切割时需注意的事项用限制酶切割时需注意的事项(1)(1)获取目的基因和切割载体时获取目的基因和切割载体时,通常使用同种限制酶通常使用同种限制酶,目的是目的是 。但是使用该法缺点是容易发生。但是使用该法缺点是容易发生 ，为了避免上，为了避免上述情况发生，可采取的措施是述情况发生，可采取的措施是 。(2)(2)获取一个目的基因需限制酶切割获取一个目的基因需限制酶切割 次次,共产生共产生 个游离的磷酸基团。个游离的磷酸基团。为了产生相同的黏性末端，便于连接两4分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接两种两种同尾酶同尾酶切割的切割的DNADNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在，不能再被原来的限制酶识别片段连接后，原来的酶切位点将不存在，不能再被原来的限制酶识别不同限制酶不同限制酶切割形成的黏性末端，切割形成的黏性末端，如果互补如果互补则可以相互重新配对连接则可以相互重新配对连接二、二、DNADNA连接酶连接酶1.1.作用：作用：将两个将两个DNADNA片段片段连接起来，连接起来，恢复恢复被限制酶切开的被限制酶切开的磷酸二酯键磷酸二酯键。2.2.分类：分类：三、载体三、载体 1.1.载体载体的种类的种类：质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒 2.2.载体的作用：载体的作用：将目的基因送入受体细胞将目的基因送入受体细胞3.3.质质粒粒：一一种种裸裸露露的的、结结构构简简单单、独独立立于于真真核核细细胞胞细细胞胞核核或或原原核核细细胞胞拟拟核核DNADNA之之外外，并并具具有有自自我我复复制制能能力力的的的的双链环状双链环状DNADNA分子分子4.4.作为载体作为载体必须具备的条件必须具备的条件：5.5.真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行人工改造人工改造的。的。能在受体细胞中自我复制，或整合到受体能在受体细胞中自我复制，或整合到受体DNADNA上，随受体上，随受体DNADNA同步复制同步复制具有一个至多个限制酶切割位点，供外源具有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNADNA片段（目的基因）插入。片段（目的基因）插入。具有标记基因，便于重组具有标记基因，便于重组DNADNA分子的筛选分子的筛选 对受体细胞无害。对受体细胞无害。E.coliDNAE.coliDNA连接酶连接酶：来源于大肠杆菌；：来源于大肠杆菌；只能连接具有互补只能连接具有互补黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端的的DNADNA片段片段T4DNAT4DNA连接酶连接酶：来源于来源于T4T4噬菌体；噬菌体；既既能连接双链能连接双链DNADNA片段互补的黏性末端，片段互补的黏性末端，又又能连接双链能连接双链 DNADNA片段的平末端片段的平末端（但连接平末端的效率较低）（但连接平末端的效率较低）实验实验DNADNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定一、实验原理：一、实验原理：1.DNA1.DNA不溶于酒精，蛋白质溶于酒精不溶于酒精，蛋白质溶于酒精2.DNA2.DNA在不同浓度的在不同浓度的NaClNaCl溶液中的溶解度不同，溶于溶液中的溶解度不同，溶于2mol/L2mol/L的的NaClNaCl溶液溶液3.3.鉴定原理：鉴定原理：DNADNA遇二苯胺试剂呈现蓝色遇二苯胺试剂呈现蓝色二、过程：二、过程：DNADNA含量相对含量相对较高较高的生物组的生物组织，如织，如新鲜洋新鲜洋葱葱、香蕉、菠、香蕉、菠菜、菜花和猪菜、菜花和猪肝等肝等动物细胞（鸡动物细胞（鸡血细胞）血细胞）/植植物细胞物细胞 哺乳哺乳动物成熟的红动物成熟的红细胞？细胞？加加体积相等体积相等、预冷预冷酒精酒精（体积分数体积分数95%95%）静置，得静置，得白色丝状物白色丝状物提取方案：提取方案：用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水的水离心将离心将沉淀物沉淀物晾干晾干方案：方案：4 4冰箱静置后取冰箱静置后取上清液上清液离心后取上清液离心后取上清液2mol/L2mol/L的的NaClNaCl溶液，溶液，2只试管二苯胺二苯胺沸水浴加热沸水浴加热蓝色蓝色动物细胞的破碎较动物细胞的破碎较易，以鸡血为例，易，以鸡血为例，在鸡血细胞液中加在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，同时用玻璃棒搅拌，吸水胀破后，过滤吸水胀破后，过滤收集滤液即可。收集滤液即可。不能选择不能选择哺乳动哺乳动物成熟的红细胞物成熟的红细胞，因为哺乳动物成因为哺乳动物成熟的红细胞中熟的红细胞中没没有细胞核和线粒有细胞核和线粒体体，几乎，几乎不含不含DNADNA破碎细胞，使核物破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨质容易溶解在研磨液中。液中。研磨不充分会使研磨不充分会使细细胞核内的胞核内的DNADNA释放释放不完全，提取的不完全，提取的DNADNA量变少量变少，影响，影响实验结果，导致看实验结果，导致看不到丝状沉淀物、不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显用二苯胺鉴定不显示蓝色等。示蓝色等。研磨液：洗涤剂是一些离子洗涤剂是一些离子去污剂，能去污剂，能溶解细溶解细胞膜，有利于胞膜，有利于DNADNA的释放；的释放；食盐的主要成分是食盐的主要成分是NaClNaCl，有利于有利于DNADNA的溶解。的溶解。上清液中除上清液中除DNADNA之外，之外，可能含有哪些杂质可能含有哪些杂质？低温放置几分钟的作用？低温放置几分钟的作用？搅拌时应搅拌时应轻缓、并沿一个方向的原因？轻缓、并沿一个方向的原因？抑制核酸水解酶的活性，进而抑制抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNADNA降解；抑制降解；抑制DNADNA分子运分子运动，使动，使DNADNA易形成沉淀析出；易形成沉淀析出；低温有利于增加低温有利于增加DNADNA分子柔韧性，分子柔韧性，减少断裂。减少断裂。减少减少DNADNA断裂，断裂，以便获得较完整的以便获得较完整的DNADNA分子分子1.1.基因工程的基本操作程序？基因工程的基本操作程序？P76P76四步四步2.2.基因工程操作环境：基因工程操作环境：体外体外；操作水平：操作水平：DNADNA分子水平分子水平；原理：原理：基因重组基因重组；5.Bt5.Bt基因（基因（BtBt抗虫蛋白基因）表达出的抗虫蛋白基因）表达出的BtBt抗虫蛋白：抗虫蛋白：P77P77右上角右上角杀杀杀杀死死死死害害害害虫虫虫虫的的的的原原原原理理理理？BtBt抗抗虫虫蛋蛋白白被被分分解解为为多多肽肽，多多肽肽与与害害虫虫肠肠上上皮皮细细胞胞的的特特异异性性受受体体结结合合，导导致致细细胞胞膜膜穿穿孔孔，造成害虫死亡造成害虫死亡。不不不不会会会会对对对对人人人人畜畜畜畜有有有有害害害害的的的的原原原原理理理理？BtBt抗抗虫虫蛋蛋白白只只在在某某类类昆昆虫虫肠肠道道的的碱碱性性环环境境中中才才能能表表现现出出毒毒性性，而而人人畜畜的的胃胃液液呈酸性呈酸性 人畜的肠道细胞没有特异性受体。人畜的肠道细胞没有特异性受体。一、目的基因的筛选与获取一、目的基因的筛选与获取1.1.何为目的基因？何为目的基因？P76P76用于改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因，主要指编码蛋白质的基因用于改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因，主要指编码蛋白质的基因2.2.目的基因的获取方法：目的基因的获取方法：人工合成、从基因文库中获取、人工合成、从基因文库中获取、PCRPCR获取和扩增获取和扩增3.cDNA3.cDNA文库是由文库是由mRNAmRNA逆转录形成逆转录形成的，只包含真核细胞基因结构中的，只包含真核细胞基因结构中外显子外显子的序列，的序列，可在不同物种之间交流；可在不同物种之间交流；3.2 3.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.1.目的基因的获取目的基因的获取2.2.基因表达载体的构建基因表达载体的构建3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定植物细胞：植物细胞：农杆菌转化法农杆菌转化法(常用）、基因枪法、常用）、基因枪法、花粉管通道法花粉管通道法动物细胞（动物细胞（受精卵受精卵）：）：显微注射法显微注射法微生物细胞：感受态细胞法微生物细胞：感受态细胞法检测方法：检测方法：1 1.分子水平：分子水平：DNADNA分子杂交法分子杂交法、分子、分子杂交法、杂交法、抗原抗体杂交抗原抗体杂交法法2 2.个体水平：抗虫鉴定个体水平：抗虫鉴定 抗病鉴定、抗病鉴定、活性鉴定活性鉴定等等编码区编码区2.2.基因文库构建方法：直接分离法、反转录法基因文库构建方法：直接分离法、反转录法1.1.逆转录酶逆转录酶以以RNARNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNARNA互补的互补的DNADNA链链，形成，形成RNA-DNARNA-DNA杂交分子杂交分子；2.2.核酸酶核酸酶H H降解降解RNA-DNARNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNARNA链链，使之变成，使之变成单链单链DNADNA；3.3.以单链以单链DNADNA为模板，在为模板，在DNADNA聚合酶聚合酶的作的作用下合成另一条互补的用下合成另一条互补的DNADNA链，形成链，形成双双链链DNADNA分子分子，即，即cDNAcDNA1.1.反转录法反转录法5.PCR5.PCR：名称名称：聚合酶链式反应聚合酶链式反应 原理原理：DNADNA半保留复制半保留复制 仪器：仪器：PCRPCR扩增仪（扩增仪（PCR PCR 仪）仪）条件条件：缓冲溶液中添加缓冲溶液中添加Mg2+Mg2+的作用的作用？真核细胞和细菌的真核细胞和细菌的DNADNA聚合酶需要聚合酶需要Mg2Mg2+激活。激活。过程：过程：引物的引物的作用作用：与两条模板链结合，使与两条模板链结合，使DNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的33端开始端开始连接脱氧核苷酸连接脱氧核苷酸引物的种类引物的种类：需：需2 2种种引物。引物。为何需要为何需要2 2种引物？种引物？两种引物的要求变性变性：温度上升到温度上升到至至9090以上以上时时，双链，双链DNADNA解解聚聚为单链为单链复性复性：温度下降到温度下降到5050左右左右时时，两种两种引物引物通过碱基互补配对与通过碱基互补配对与两条单链两条单链DNADNA结合结合延伸延伸：温度上升到温度上升到7272左右左右时时，4 4种种脱氧核苷酸脱氧核苷酸在在耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶的作用下，的作用下，根据碱基互补根据碱基互补 配对原则配对原则加到引物的加到引物的3 3端，合成新的端，合成新的DNADNA链。链。模板：模板：DNADNA母链母链 原料：原料：4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸 酶：酶：耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqDNATaqDNA聚合酶）聚合酶）引物引物 缓冲溶液（含缓冲溶液（含Mg2+Mg2+）DNADNA的两条反向平行链都做模板，其碱基序列不同，且的两条反向平行链都做模板，其碱基序列不同，且DNADNA聚合酶只能从聚合酶只能从33端延伸端延伸子链，用两种引物才能确保子链，用两种引物才能确保DNADNA两条链同时被扩增两条链同时被扩增引物自身不能环化引物自身不能环化 两种引物之间不能互补配对两种引物之间不能互补配对引物长度不宜过短，防止引物随机结合引物长度不宜过短，防止引物随机结合(2)两种引物与模板链如何配对？。引物的引物的55端端与模板链与模板链33端端互补配对互补配对(3)目的基因能被准确扩增的原因是目的基因独特的目的基因独特的双螺旋结构双螺旋结构提供了精确的复制模板；提供了精确的复制模板；碱基互补配对原则碱基互补配对原则保证复制准确的进行保证复制准确的进行扩增扩增n n次需要多少个引物？次需要多少个引物？至少需经过至少需经过3 3次循环才能分离得到所需要的次循环才能分离得到所需要的DNADNA区段区段鉴定鉴定PCRPCR产物的方法产物的方法琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳用用PCRPCR可以扩增可以扩增mRNAmRNA吗？吗？不可以，需要逆转录成不可以，需要逆转录成cDNAcDNA再进行扩增再进行扩增1.1.子代子代DNADNA分子总数分子总数：_ _ 个个；2.2.第第n n代产生的代产生的DNADNA数：数：_个；个；3 3.子代子代DNADNA脱氧核苷酸脱氧核苷酸链总数链总数=_ _ 条条4.4.第第n n代产生的代产生的DNADNA链数：链数：_条条假设复制培养假设复制培养n n代，结果如下代，结果如下：2 2n n2 2n-1n-12 2n+1n+12 2n nn n代后，代后，DNADNA分子有分子有_个个n n代后，代后，DNADNA链有链有_条条第第_代出现完整的目的基因代出现完整的目的基因n n代后，含引物的代后，含引物的DNADNA分子有分子有_个个n n代后，共消耗代后，共消耗_个引物个引物第第n n代复制，消耗了代复制，消耗了_个引物个引物n n代后，完整的目的基因有代后，完整的目的基因有_个个2 2n n2 2n+1n+13 32 2n n2 2n+1n+1-2-22 2n n2 2n-n-2n2n1.1.如果引物中如果引物中GCGC含量较高，可适当提高退火温度含量较高，可适当提高退火温度2.2.退退火火温温度度过过高高，得得不不到到产产物物或或者者导导致致目目标标产产物物的的量量减减少少的的原原因因：引引物不能稳定的与模板结合（引物与模板结合的稳定性遭到破坏）物不能稳定的与模板结合（引物与模板结合的稳定性遭到破坏）例：例：进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中_的设定与引物有关，_的设定与扩增片段的长度有关。变性温度 复性温度 延伸温度 变性时间 退火时间 延伸时间答案：答案：（15）目前在PCR反应中使用TaqDNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_。答案：答案：TaqDNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活（16）为方便构建重组质粒，设计引物时需要增加适当的_位点。设计引物时需要避免引物之间形成_，而造成引物自连。(限制酶 碱基互补配对)（17）为便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的_端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是_。（5 使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连）思考：思考：当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时：当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时：1.1.若无法获得该蛋白若无法获得该蛋白，原因可能是什么，原因可能是什么？2.2.以上情况如何解决？以上情况如何解决？3.3.若可以获得该蛋白，但是蛋白质若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性无活性，原因可能是？，原因可能是？4.4.以上情况如何解决？以上情况如何解决？真核生物的基因有真核生物的基因有内含子内含子，原核生物，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNARNA序列的机制序列的机制，其，其初始转录产物初始转录产物中中与内含子对应的与内含子对应的RNARNA序列序列不能被切除不能被切除，因此无法表达出该蛋白，因此无法表达出该蛋白使用使用cDNAcDNA作为目的基因作为目的基因或使用或使用酵母菌酵母菌等真核生物作为等真核生物作为受体细胞受体细胞原核生物原核生物缺少高尔基体和内质网缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对等细胞器，无法对真核生物的蛋白质真核生物的蛋白质进行正确的进行正确的加工加工人工体外再加工人工体外再加工或使用或使用酵母菌酵母菌等真核生物作为等真核生物作为受体细胞受体细胞原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的和具有调控作用的_ _区组成的区组成的连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码若若原核生物原核生物由由mRNAmRNA逆转录形成的逆转录形成的cDNAcDNA与原基因的结构相比有哪些不同？与原基因的结构相比有哪些不同？缺少启动子和终止子缺少启动子和终止子若若真核生物真核生物由由mRNAmRNA逆转录形成的逆转录形成的cDNAcDNA与原基因的结构相比有哪些不同？与原基因的结构相比有哪些不同？缺少启动子、终止子、内含子缺少启动子、终止子、内含子相似名词比较比较项目比较项目位置位置功能功能启动子启动子（其上有一个重要的位点：（其上有一个重要的位点：RNARNA聚合酶结合位点）聚合酶结合位点）起始密码子起始密码子终止子终止子终止密码子终止密码子DNADNAmRNAmRNADNADNAmRNAmRNA终止翻译终止翻译驱动翻译驱动翻译终止转录终止转录驱动转录驱动转录1.1.启动子启动子起始密码；终止子起始密码；终止子终止密码，密码子是终止密码，密码子是mRNA上的，参与翻译过程上的，参与翻译过程2.生物体内所有细胞（除哺乳动物成熟红细胞外）均具有相同的基因，但是有的基因生物体内所有细胞（除哺乳动物成熟红细胞外）均具有相同的基因，但是有的基因在所有细胞中都表达（在所有细胞中都表达（如呼吸酶基因如呼吸酶基因），但是有的基因只在特定细胞中选择性表达），但是有的基因只在特定细胞中选择性表达（如胰岛素基因在所有体细胞中均存在，所以所有细胞中的如胰岛素基因在所有体细胞中均存在，所以所有细胞中的DNADNA均可与胰岛素基因探均可与胰岛素基因探针形成杂交带。但是其仅在胰岛针形成杂交带。但是其仅在胰岛B B细胞中表达，所以只在胰岛细胞中表达，所以只在胰岛B B细胞中能转录出相应细胞中能转录出相应的的mRNAmRNA，因此只有胰岛，因此只有胰岛B B细胞中的细胞中的mRNAmRNA与胰岛素基因探针形成杂交带。）与胰岛素基因探针形成杂交带。）第二步第二步基因表达载体的构建（核心）基因表达载体的构建（核心）80801.1.目的：目的：使目的基因在受体细胞中使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，并且可以，并且可以遗传遗传给给下一代下一代，同时能够，同时能够表达和发挥作用表达和发挥作用。2.2.组成：组成：目的基因目的基因 启动子启动子 终止子终止子 标记基因标记基因 +复制原点复制原点（1 1）：便于：便于重组重组DNADNA分子的分子的筛选筛选（2 2）：DNADNA片段片段，基因上游，基因上游，紧挨转录起始位点紧挨转录起始位点，是，是RNARNA聚合酶聚合酶识别和结合识别和结合的部位，能的部位，能驱动驱动基因基因转转录录出出mRNA mRNA （诱导型启动子诱导型启动子-激活或抑制激活或抑制基因的表达）基因的表达）（3 3）终止子：是一段有特殊结构的）终止子：是一段有特殊结构的DNADNA片段片段 ，位于基因的下游，位于基因的下游，转录终止转录终止的信号的信号（4 4）复制原点：）复制原点：DNADNA复制开始的地方复制开始的地方3.3.构建过程：构建过程：需要限制酶和需要限制酶和DNADNA连接酶的参与连接酶的参与载体载体与与基因表达载体基因表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNADNA片段。片段。基因表达载体在载体基础上增加了基因表达载体在载体基础上增加了启动子、目的基因、终止子启动子、目的基因、终止子 选择选择限制限制酶的原则：酶的原则：选目的基因选目的基因两端两端和载体都有限制酶的切割位点；和载体都有限制酶的切割位点；可用可用同种限制酶同种限制酶或者产生或者产生相同末端的相同末端的限制酶（限制酶（同尾酶同尾酶），），同时同时切割载切割载体和含有目的基因的体和含有目的基因的DNADNA片段，片段，所选酶切位点所选酶切位点不能破坏不能破坏目的基因目的基因、标记基因（至少有一个完整）标记基因（至少有一个完整）、复制原点复制原点、启动子启动子、终止子终止子为避免目的基因和质粒的自身环化及目的基因与质粒的反向连接，可使用为避免目的基因和质粒的自身环化及目的基因与质粒的反向连接，可使用两种两种切割后能产生切割后能产生不同黏性不同黏性末端末端的限制酶来的限制酶来切割目的基因和质粒，确保目的基因和质粒正向连接。切割目的基因和质粒，确保目的基因和质粒正向连接。目的基因应插入启动子和终止子之间。目的基因应插入启动子和终止子之间。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1.1.转化：转化：是是指指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定维持稳定和和表达表达的过程的过程2.2.农杆菌转化法：农杆菌转化法：受体细胞：受体细胞：受精卵受精卵CaCa2+2+的作用：增加细胞壁的通透性的作用：增加细胞壁的通透性这种细胞称为感受态细胞这种细胞称为感受态细胞思考：思考：1.1.在培养有些转基因植物时，常用农杆菌转化法，在培养有些转基因植物时，常用农杆菌转化法，农杆菌的作用农杆菌的作用是什么是什么？2.2.原理？原理？3.3.采用农杆菌转化法导入目的基因时，采用农杆菌转化法导入目的基因时，为什么目的基因可以整合到染色体的为什么目的基因可以整合到染色体的DNADNA上上?4.4.目的基因插入染色体目的基因插入染色体DNADNA上的目的上的目的是什么？是什么？5.5.两次拼接、两次导入两次拼接、两次导入6.6.转基因的植物细胞如何获得最终的新品种？转基因的植物细胞如何获得最终的新品种？植物组织培养农杆菌能侵染双子叶植物和裸子植物，将目的基因转入到受体细胞中原理:农杆菌农杆菌TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可转移至受体细胞，可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体并整合到受体细胞的染色体DNADNA上上，因此只要将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。P81由于Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入到了 T-DNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上转化的目的：使目的基因的遗传特性得以使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达稳定维持和表达植物组织培养1.1.分子水平检测分子水平检测2.2.个体生物学水平鉴定个体生物学水平鉴定一、检测与鉴定的目的：一、检测与鉴定的目的：二、检测与鉴定的方法：二、检测与鉴定的方法：检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上上是否插入了目的基因是否插入了目的基因检测目的基因检测目的基因是否转录出了是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因检测目的基因是否翻译成蛋白质是否翻译成蛋白质方法：方法：PCRPCR技术技术 核酸分子杂交核酸分子杂交方法：方法：PCRPCR技术技术 核酸分子杂交核酸分子杂交目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检测和鉴定目的基因进入受体细胞后，是否检测和鉴定目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达稳定维持和表达其遗传特性。其遗传特性。抗虫棉：采摘抗虫棉叶片抗虫棉：采摘抗虫棉叶片饲喂饲喂棉铃虫棉铃虫耐盐水稻：用一定浓度的盐水耐盐水稻：用一定浓度的盐水浇灌浇灌水稻水稻抗除草剂植物：抗除草剂植物：喷洒喷洒除草剂除草剂抗病毒（菌）植物：病毒（菌）抗病毒（菌）植物：病毒（菌）接种接种实验实验转基因产品：提取转基因产品与天然产品的功能进行转基因产品：提取转基因产品与天然产品的功能进行活性比较活性比较原理：原理：抗原抗体特异性结合抗原抗体特异性结合具体操作：具体操作：从转基因生物中从转基因生物中提取蛋白质提取蛋白质，用，用相应的抗体相应的抗体进行进行抗原抗原抗体杂交抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已翻译若有杂交带出现，表明目的基因已翻译是否具有抗性是否具有抗性及及抗性抗性程度程度抗原抗原-抗体杂交抗体杂交注意注意对照原则对照原则：对照组对照组为非转基因植物为非转基因植物;实验组实验组为转基因植物，其他条件一致为转基因植物，其他条件一致PCRPCR技术检测技术检测基本原理：基本原理：根据目的基因特点设计特定引物根据目的基因特点设计特定引物，然后进行，然后进行PCRPCR，看是否扩增出目的基因。，看是否扩增出目的基因。若有扩增产物若有扩增产物,表明转入目的基因表明转入目的基因 若没有若没有,表明没有成功转入目的基因表明没有成功转入目的基因特别说明：特别说明：mRNAmRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNAcDNA在进行扩增在进行扩增核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术用放射性同位素标记（或荧光标记）的用放射性同位素标记（或荧光标记）的目的基因作探针与受体细胞的目的基因作探针与受体细胞的染色体染色体DNADNA进行杂交进行杂交，如果显示出杂交带，表明目的如果显示出杂交带，表明目的基因已插入染色体基因已插入染色体DNADNA中中用放射性同位素标记（或荧光标记）的用放射性同位素标记（或荧