高中生物竞赛课件核酸的性质、研究方法和序列测定.pptx

核酸的性质和研究方法1.一般理化性质2.紫外吸收性质3.核酸结构的稳定性4.核酸的变性5.核酸的复性6.核酸分子杂交和DNA芯片7.DNA的化学合成1、一般理化性质一、酸碱性：核酸的酸碱解离性质与核苷酸相似，但由于核酸为多聚核苷酸，含有大量的磷酸基团，pI较低，DNA的pI为44.5，RNA的pI为22.5二、溶解性：DNA纯品为白色纤维状固体，RNA纯品为白色粉末。二者均微溶于水，不溶于一般有机溶剂，故常用乙醇从溶液中沉淀核酸三、黏度：DNA溶液的黏度极高，RNA溶液的黏度要小得多核酸的性质和研究方法大分子量的DNA很容易用棒挑起四、水解：核酸可被酸、碱或酶作用(糖苷键和磷酸酯键)，水解程度因水解条件而异酸水解首先生成无嘌呤酸（1）酸水解p糖苷键和磷酸二酯键对酸的敏感性不同：嘌呤糖苷键 嘧啶糖苷键 磷酸酯键ppH 1.6和室温下对水透析，或100、pH 2.8 1 h，多数嘌呤碱基可脱落p98%100%甲酸(U的回收率低)，在175 2 h，或三氟乙酸在155 6080 min，多数嘧啶碱基可脱落利用酸水解可以研究核酸的碱基组成1、一般理化性质核酸的性质和研究方法（2）碱水解pRNA比DNA更容易被碱水解p水解先生成2,3-环核苷酸，后生成2-和3-核苷酸混合物pNaOH、KOH,KOH最优，0.31mol/L，室温37 1824 h(RNA)1、一般理化性质核酸的性质和研究方法DNA对碱水解有一定的抗性，1mol/L NaOH，100，4 h,可得到寡聚脱氧核苷酸（2）碱水解pRNA比DNA更容易被碱水解p水解先生成2,3-环核苷酸，后生成2-和3-核苷酸混合物pNaOH、KOH,KOH最优，0.31mol/L，室温37 1824 h(RNA)1、一般理化性质核酸的性质和研究方法DNA对碱水解有一定的抗性，1mol/L NaOH，100，4 h,可得到寡聚脱氧核苷酸生理意义:DNA更稳定，遗传信息RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。1、一般理化性质核酸的性质和研究方法（3）酶水解p核糖核酸酶(RNase)、脱氧核糖核酸酶(DNase)、内切核酸酶、外切核酸酶（35;53)p常用RNase:牛胰核糖核酸酶(RNase I)，内切酶，水解产物为3-嘧啶核苷酸和以3-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸核糖核酸酶T1，水解产物为3-鸟嘌呤核苷酸和以3-鸟嘌呤核苷酸结尾的寡核苷酸核糖核酸酶T2，作用于Ap残基，将tRNA降解成以3-腺苷酸为末端的寡核苷酸限制性内切核酸酶 EcoRIEco(E.coli)、R(菌株)I(该类酶编号)1、一般理化性质核酸的性质和研究方法（3）酶水解p常用DNase:牛胰脱氧核糖核酸酶I(DNase I)，将单链或双链DNA水解为平均长度为4 nt，以5-磷酸为末端的寡聚核苷酸牛脾脱氧核糖核酸酶(DNase II)，将单链或双链DNA水解为平均长度为6 nt，以3-磷酸为末端的寡聚核苷酸p非特异性核酸酶，水解DNA和RNA蛇毒磷酸二酯酶，产物为5-单核苷酸牛脾磷酸二酯酶，产物为3-单核苷酸2、紫外吸收性质核酸的性质和研究方法核酸的嘌呤环和嘧啶环的共轭体系强烈吸收250290 nm波段的紫外光，最高吸收峰接近260 nm，RNA与DNA的吸收光谱差别不大1、核酸样品纯度鉴定：260 nm和280 nm处吸光度(A)p纯DNA：A260nm/A280nm=1.8p纯RNA：A260nm/A280nm=2.0pA260nm/A280nm比值降低(含蛋白质及苯酚)OD260的应用2、核酸定量：A260 nm=1相当于p50 g/mL 双链DNAp40 g/mL 单链DNA或RNAp寡核苷酸 20 g/mL3、判断DNA是否变性2、紫外吸收性质核酸的性质和研究方法DNA的紫外吸收光谱220 240 260 2800.10.20.30.4波长（nm）光吸收123增 色 效 应(hyperchromic effect)：核酸水解为核苷酸，或者变性后紫外吸收值增加的现象(2、3)1、天然DNA2、变性DNA3、核苷酸总光吸收原因：双螺旋结构中，碱基有规律的紧密堆积降低了对紫外光的吸收减色效应：变性的核酸复性后紫外吸收减少氢 键3、核酸结构的稳定性核酸的性质和研究方法螺旋内部的氢键：碱基对之间的氢键(碱基对的几何构象和大小使其在螺旋内的距离适合形成氢键)，GC含量越多，越稳定螺旋外部的氢键：戊糖-磷酸骨架上的亲水基团与周围的水分子之间形成RNA三级结构中的突环间碱基对之间的氢键3、核酸结构的稳定性核酸的性质和研究方法碱基堆积力(主要)螺旋区：嘌呤环和嘧啶环上原子的范德华作用力环境中：水与双螺旋的磷酸-戊糖骨架相互作用，内部碱基对高度疏水，使环境中的水在螺旋外围形成水壳，有助于螺旋的稳定碱基平面间的范德华作用力和疏水作用力统称为碱基堆积力RNA单链区的碱基平面在距离合适时，也能形成堆积力p碱基间相互作用的强度与相邻碱基环之间重叠的面积成正比p总趋势：嘌呤之间 嘌呤与嘧啶之间 嘧啶之间p碱基的甲基化也能提高碱基堆积力3、核酸结构的稳定性核酸的性质和研究方法环境中的正离子螺旋区外侧带负电荷的磷酸基，在不与正离子结合的状态下有静电斥力，环境中带正电荷的Na+，K+，Mg2+，Mn2+等离子，原核生物细胞内带正电荷的多胺类，真核细胞中带正电荷的组蛋白等，均可与磷酸基团结合，消除静电斥力，对核酸结构的稳定有重要作用4、核酸的变性(denaturation)核酸的性质和研究方法变性只涉及次级键的变化，磷酸二酯键的断裂称核酸降解双链核酸的变性(denaturation of double-stranded nucleic acid)指双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规线团状态，从而引起核酸的物理化学性质和生物学功能的改变?的现象电镜下的DNA部分变性核酸的性质和研究方法导致核酸变性的因素常用：热变性和碱变性加热、碱性pH、低离子强度、有机试剂(甲醛、甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺)等，均可破坏双螺旋结构，引起核酸分子变性4、核酸的变性(denaturation)核酸的性质和研究方法变性引起的核酸理化性质的改变紫外吸收增加(检测核酸变性的指标之一)4、核酸的变性(denaturation)核酸的性质和研究方法变性引起的核酸理化性质的改变紫外吸收增加(检测核酸变性的指标之一)4、核酸的变性(denaturation)核酸的性质和研究方法变性引起的核酸理化性质的改变紫外吸收增加(检测核酸变性的指标之一)DNA的浮力密度增加(变性后的DNA会像单链的RNA一样，通过链内的互补碱基配对形成更加致密的结构)DNA溶液的黏度降低(双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性后代之以“柔软”而松散的无规则单股线性结构，DNA黏度因此而明显下降)离心时的沉降速度增加DNA分子的对称性及分子局部的构象改变DNA溶液的旋光性改变4、核酸的变性(denaturation)核酸是DNA：变性并不会使生物学功能丧失，反而利于生物学功能的发挥a)DNA的生物学功能是贮存、复制及转录遗传信息，而遗传信息是贮存在一级结构之中的，DNA在变性的时候，一级结构并没有发生任何破坏b)无论是DNA复制，还是转录，第一步都需要DNA发生解链，这实际上就是DNA的变性(PCR的第一步反应就是热变性)核酸的性质和研究方法变性引起的核酸理化性质的改变生物学功能？（vs.蛋白质）核酸的变性是双螺旋结构的破坏，与核酸的生物学功能是否丧失没有必然的联系4、核酸的变性(denaturation)核酸是RNA，生物学功能直接由高级结构决定的RNA(tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA和核酶)，一旦发生变性，就会像蛋白质一样，生物学功能立刻丧失；核酸的性质和研究方法变性引起的核酸理化性质的改变生物学功能？（vs.蛋白质）核酸的变性是双螺旋结构的破坏，与核酸的生物学功能是否丧失没有必然的联系4、核酸的变性(denaturation)核酸的性质和研究方法熔解温度(melting temperature,Tm)pDNA热变性是个突变过程，将紫外吸收的增加量达最大增量一半时的温度值称熔解温度(Tm)pDNA稀盐溶液加热到一定温度后，A260 nm骤然增加，两条链开始分开；吸光度增加约40%，变化趋于平坦，两条链完全分开Biochemistry.Concepts and Connections.Pearson.2nd(2019)4、核酸的变性(denaturation)核酸的性质和研究方法影响熔解温度(Tm)的因素1、DNA的均一性(两种不同的含义)：均一性越高，Tm值范围越窄序列的均一性：人工合成的polyd(A-T)或polyd(G-C)具有高度的均一性，Tm值范围窄(变性时的氢键断裂几乎同时进行)待测样品DNA的组成是否均一(否含有其他杂DNA的污染)：所测样品中只含有一种DNA，Tm值范围窄；混有其他来源的DNA，Tm值范围变宽4、核酸的变性(denaturation)核酸的性质和研究方法影响熔解温度(Tm)的因素Biochemistry.Jones&Bartlett Learning(2014)2、G-C含量越高，Tm越大Tm=69.3+0.41(G+C)%(G+C)%=(Tm-69.3)2.44 或或马默多蒂公式4、核酸的变性(denaturation)核酸的性质和研究方法影响熔解温度(Tm)的因素3、离子强度低的介质中，Tm低溶液中的阳离子能够中和或屏蔽DNA主链上磷酸基团的负电荷，减弱两条链之间的排斥而增强DNA双螺旋结构的稳定性4、核酸的变性(denaturation)DNA的Tm值不是固定的核酸的性质和研究方法影响熔解温度(Tm)的因素4、高pH，低Tmp碱基失去质子而丧失形成氢键的能力5、甲酰胺、尿素、甲醛等变性剂可破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降4、核酸的变性(denaturation)核酸的性质和研究方法RNA的变性u双链RNA比双链DNA稳定，同样序列的双链RNA比双链DNA的Tm高约20uRNA-DNA杂合双链的Tm介于双链RNA和双链DNA之间u单链RNA通过回折形成局部双螺旋，变性过程各区段逐渐解开双螺旋，Tm较低4、核酸的变性(denaturation)5、核酸的复性(renaturation)核酸的性质和研究方法u当各种变性因素不复存在的时候，变性时解开的互补单链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的 现 象 称 为 复 性(renaturation)5、核酸的复性(renaturation)核酸的性质和研究方法u热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealing)u当各种变性因素不复存在的时候，变性时解开的互补单链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象称为复性(renaturation)u复性后，核酸的紫外吸收降低，这种现象被称作减色效应(hypochromic effect)“成核”作用二级反应慢拉链式作用一级反应快DNA复性的第一步是两个互补的单链分子间的接触以启动部分互补碱基的配对，称为“成核”作用成核的碱基对经历小范围重排以后，单链的其他区域像“拉链”一样迅速复性核酸的性质和研究方法影响复性速度的因素5、核酸的复性(renaturation)1、复性温度不宜过低(碰撞机会小)，Tm-25为较适合的复性温度2、单链片段浓度(越高，速度越快)3、单链片段长度(越短，速度越快)4、单链片段复杂度(越低，速度越快)5、溶液离子强度(维持溶液一定的离子强度，消除磷酸基负电荷造成的斥力，可加快复性速度)核酸的性质和研究方法影响复性速度的因素5、核酸的复性(renaturation)C0：单链的初始浓度t：复性的时间C0t1/2：复性达一半时对应的C0t值，越小，复性速度越快单链片段浓度、长度、复杂度核酸的性质和研究方法核酸分子杂交(molecular hybridization)6、核酸分子杂交和DNA芯片在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成双链，或DNA单链和RNA单链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程称分子杂交Lehninger Principles of Biochemistry.W.H.Freeman.6th(2013)核酸的性质和研究方法核酸分子杂交(molecular hybridization)6、核酸分子杂交和DNA芯片对天然或人工合成的DNA或RNA片段进行放射性同位素或荧光标记，或用特定的基团(生物素，地高辛)标记，做成探针，与待测物杂交后，检测放射性同位素或荧光物质的位置，寻找与探针有互补关系的DNA或RNA常规操作探针种类：基因组探针cDNA探针RNA探针寡核苷酸探针生物素标记的底物加入磷酸化底物降解底物生成荧光物质变性杂交生物素标记的底物抗生物素抗体(偶联有碱性磷酸酯酶)变性杂交生物素标记探针检测核酸过程示意图核酸的性质和研究方法核酸分子杂交(molecular hybridization)6、核酸分子杂交和DNA芯片p带有标记物而不影响其碱基配对特异性，便于分析杂交体p为单链核酸，双链核酸探针使用前需变性p具有高度特异性，只与待测核酸杂交p探针序列通常是基因编码序列(非编码序列特异性低)p灵敏度高而稳定，标记方法简便而安全核酸探针需具备以下基本条件核酸的性质和研究方法核酸分子杂交(molecular hybridization)6、核酸分子杂交和DNA芯片p原位杂交：直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，不改变核酸所在的位置p点杂交：将核酸直接点在膜上(点膜器、真空抽气装置)p狭缝印迹杂交：使用狭缝点样器点样p电泳分离后再杂交：lSouthern印迹杂交(检测DNA)lNorthern印迹杂交(检测RNA)杂交类型Southern印迹杂交(检测DNA)Southern印迹杂交(检测DNA)Northern印迹杂交(检测RNA)区别：电泳后常用碱溶液处理凝胶使DNA变性，RNA容易被碱水解，常用甲醛、羟甲基汞或戊二醛作为变性剂应用：pSouthern杂交常用于测定基因拷贝数，基因定位，研究基因变异，基因重排，DNA多态性分析和疾病诊断pNorthern杂交常用于检测组织或细胞的基因表达水平核酸的性质和研究方法DNA芯片(DNA chip)6、核酸分子杂交和DNA芯片p以核酸的分子杂交为基础p要点：预先将成千上万种相关基因(如多种与癌症相关的基因)的探针整齐地排列在特定的基片上，形成阵列，将待测样品的DNA切割成碎片，用荧光基团标记，与芯片进行分子杂交，激光扫描仪对基片上的每个点进行检测，若某个探针所对应的位置出现荧光，说明样品中存在相应的基因p一个芯片上可容纳成千上万个探针，可对样本进行高通量的检测p应用：测定基因的表达谱，测定基因型、基因突变和多态性Lehninger Principles of Biochemistry.W.H.Freeman.6th(2013)目标序列贴于硅玻片表面的反应基团最初无反应活性，经光处理，具有活性遮光板加入具有反应活性的核苷酸A(5-OH被封闭)光处理解除封闭的5-OHDNA芯片的制备Lehninger Principles of Biochemistry.W.H.Freeman.6th(2013)青蛙发育的两个不同阶段的细胞中收集mRNA样本逆转录制备cDNA探针，每个样本的cDNA探针带有不同颜色的荧光标记混合的cDNA探针与微阵列杂交绿点表示在单细胞阶段mRNA表达(更多)；红点在发育后期表达(更多)；黄点表示在发育过程中变化不大的mRNA核酸的性质和研究方法固相磷酰亚胺法7、DNA的化学合成p固相载体：可控孔径玻璃微球(CPG)p基团保护剂:l苯甲酰基(bz)：腺嘌呤和胞嘧啶碱基上的氨基l异丁酰基(Ib)：鸟嘌呤碱基的氨基l二甲氧三苯甲基(DMT)：5-羟基p活化剂和缩合剂：二异丙基亚磷酰胺衍生物基团保护第一个核苷酸5-OH用 二 甲 氧 三 苯 甲 基(DMT)保 护，通 过 3-OH固定于可控孔径玻璃微球脱保护基：用二氯乙酸或三氯乙酸水解脱去5-OH上 的 保 护 基(DMT)偶联：二异丙基亚磷酰胺衍生物作为活化剂(活化下一核苷酸的3-OH)和缩合剂，在弱碱性化合物四唑催化下与前一核苷酸5-OH偶联形成亚磷酸三酯(连有氰乙基)注意：下一个核苷酸事先进行基团保护(氨基，羟基)终止反应：加入乙酸酐使未参与偶联反应的5-OH均被乙酰化，以免与以后加入的核苷酸反应，出现错误序列DNA链允许中途终止，但不能有序列错误氰乙基氧化作用：合成的亚磷酸三酯用碘溶液氧化，使之成为较稳定的磷酸三酯重复按事先设计的程序合成DNA链，待合成结束后硫酚和三乙胺脱掉保护基，氰乙基，并用氨水将合成的全长寡核苷酸水解下来，高效液相色谱(HPLC)和凝胶电泳纯化并鉴定方向：35核酸的序列测定1.链终止法测序技术2.新一代高通量测序技术核酸的序列测定1、链终止法测序技术Sanger测序技术基础：(电泳技术)凝胶电泳分离DNA片段时，小片段移动快，大片段移动慢，用适当的方法可分离大小仅差1个核苷酸的DNA片段核酸的序列测定1、链终止法测序技术Sanger测序技术基础：(电泳技术)凝胶电泳分离DNA片段时，小片段移动快，大片段移动慢，用适当的方法可分离大小仅差1个核苷酸的DNA片段技术基础：(扩增)合适的聚合酶在试管内合成单链DNA模板的互补链，反应体系包括：聚合酶、单链模板、引物、4种dNTP、若干种适量的无机离子核酸的序列测定1、链终止法测序技术Sanger测序4个试管中分别进行合成反应，各个试管的反应体系中分别加入一种类型的少量ddNTP，能在该种核苷酸处随机中断链的合成，可得到4套分子大小不等的片段双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)核酸的序列测定1、链终止法测序技术Sanger测序4个试管中的反应产物分别进行凝胶电泳，得到不同的电泳条带，检测这4套片段的位置，可直接读出核苷酸的序列一般对ddNTP进行放射性同位素或荧光标记注意：读出的序列为模版的互补链！DNA酶法序列分析的原理酶酶反反应应电电泳泳方方向向模板模板CCGGTAGCAACT35GG53引物引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCddAGGCCATCGTTGddAGGddCGGCddCGGCCATddCGGCCATCGTTddGGGCCATCddGGGCCAddTGGCCATCGddTGGCCATCGTddTA C G TAGTTGCTACC35TCAACGATGG53读出模板读出模板互补序列互补序列读出模板读出模板序列序列Lehninger Principles of Biochemistry.W.H.Freeman.6th(2013)自动化DNA测序4种发射波长不同的荧光物质分别标记4种ddNTP，终止反应后，4管反应物在同一泳道电泳(毛细管电泳)，用激光扫描收集电泳信号，计算机处理，可将序列直接打印出来一次可测定700个左右核苷酸序列