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基因的科技论文2500字生物基因枪法转化水稻的研究进展摘要：水稻(oryzaativa)是世界上最主要的粮食作物之一。近年来，dna重组技术、遗传操作技术、水稻基因图谱的研究取得了显著发展，美国monanto公司2000年4月、yngenta公司2001年2月先后宣告完成粳稻日本晴(nipponbare)基因组测序草图。我国也已宣布完成籼稻9311的序列框架图。目前以大规模分离、鉴定基因组序列功能为特征的水稻功能基因组研究正在迅速发展，而这一研究之后必然是依托于高效的水稻遗传转化体系，因此水稻遗传转化研究越来越成为人们关注的焦点。水稻遗传转化体系已比较完善，农杆菌介导法、基因枪法、peg法、花粉管通道法等方法均在水稻遗传转化中应用并获得转基因植株，但目前用的最多的方法是基因枪法和农杆菌介导法。禾谷类作物由于不是农杆菌的天然宿主，曾一度限制了农杆菌介导法转化水稻。基因枪法由于其没有宿主限制，对单子叶和双子叶植物都能进行有效地转化，因而得到了很大的发展。本文就基因枪法的基本原理及其优缺点、影响基因枪法转化水稻的几个关键因素、外源基因的遗传特性及存在的问题等方面作简要综述。1基因枪法的原理及优缺点1、1基因枪法的原理基因枪法(pariclegun)又称微弹轰击法(micro-projecticlebombardment，particlebombardment，orbiolitic)。其基本原理是将外源dna包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下，微粒被高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源dna进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化。1、2基因枪法的优、缺点1、2、1基因枪法的优点(1)无宿主限制。基因枪法本质上是一种物理过程，没有宿主限制，对单子叶和双子叶植物都能进行有效地转化。以原生质体为受体的peg转化法、电击法、脂质介导转化法和显微注射法等虽然可以用于单子叶植物的转化，然而，以原生质体作为受体材料要求受体系统具有良好的再生性能，这对于大多数禾谷类作物来说是较困难的，而且其再生的周期比较长，再生过程容易产生变异。(2)靶受体类型广泛，不受组织类型限制，几乎所有具有潜在分生能力的组织或细胞都可以用基因枪进行轰击转化。目前用于基因枪转化的受体材料十分广泛，其中包括原生质体、悬浮细胞、根或茎的切段、叶圆片、成熟胚、幼胚、分生组织、愈伤组织、胚芽鞘等几乎所有具有潜在分化能力的组织或细胞。(3)可控度高，采用高压放电或高压气体驱动的基因枪，可根据实验需要，将载有外源dna的金属颗粒射入特定层次的细胞(如再生区的细胞)，使转化细胞能再生植株，从而提高转化频率。(4)操作简便、快速。农杆菌介导法需要进行农杆菌感受态细胞的制备、共培养、抑菌等操作步骤，peg转化法、电击法等需要进行原生质体分离与培养的繁琐工作，而基因枪法是一种物理过程，只要在无菌的条件下将载有外源基因的金属颗粒轰击受体材料，就可以进行筛选培养，因此它操作简便、快速。1、2、2基因枪法的缺点由于基因枪轰击的随机性，外源基因进入宿主基因组的整合位点相对不固定，拷贝数往往较多，这样转基因后代容易出现突变、外源基因容易丢失，容易引起基因沉默等现象的发生，不利于外源基因在宿主植物的稳定表达。而且基因枪价格昂贵、运转费用高。2影响基因枪法转化水稻的几个关键因素2、1水稻的基因型栽培稻主要有籼稻和粳稻两个亚种，其中籼稻品种是热带和亚热带地区的主要粮食作物，由于籼稻的组织培养特性及再生能力都与粳稻存在较大差别，在转化过程中，籼稻的转化效率显著低于粳稻。李良材等用14个粳稻品种和23个籼稻品种进行了转化实验，其中所用的粳稻都得到转基因植株，平均转化率为10%左右，而籼稻只有14个得到转基因植株，7个只得到转基因愈伤组织，尚有2个未产生反应，转基因植株的转化频率只有2%3%，明显低于粳稻。2、2外植体类型用于基因枪转化的受体材料十分广泛，几乎所有具有潜在分裂分化能力的组织和细胞都可以作为受体材料，但要想获得理想的转化结果，根据水稻品种的不同，选择适当的转化受体材料是十分关键的。目前最常用的水稻基因枪转化受体材料包括成熟胚、幼胚、花药和幼穗。成熟胚的取材不受生长季节的限制。因而成为当前广泛采用的受体材料。但对于一些水稻品种以成熟胚盾片愈伤组织为材料其诱导率很低，而且其愈伤组织继代过程中往往出现褐化的情况，如培矮64其愈伤组织的诱导率没有超过50%。对于这样的品种有必要采用以幼穗和幼胚为受体材料。2、3组织培养条件组织培养条件影响水稻转化效率，对水稻的愈伤组织培养一般用mb培养基、nb培养基、n6培养基和m培养基，易自力等认为在培养基中添加2、55、0mg、l的aba可以有效地改善水稻愈伤组织的质量。郑宏红等在转化前将受体材料转移到含有一定浓度的甘露醇和山梨醇的高渗培养对受体材料进行处理，可明显提高gu基因的时表达效果，稳定转化的效果也有提高。田文忠等在诱导培养基或继代培养基中加入细胞分裂素(玉米素)和萘乙酸，以及愈伤组织的部分干燥处理，这些措施明显地提高籼稻愈伤组织的再生频率。叶松青等在幼胚接种前低温处理4d或7d可提高愈伤组织的再生频率，在分化培养基加入脯氨酸、dmo(0。12%二甲基亚砜)能降低愈伤组织的褐化率。2、4基因枪的轰击参数基因枪的轰击参数包括微弹的类型、微弹的速度、微弹的射程轰击压力、真空室的真空度、轰击次数、dna的纯度与浓度、dna沉淀剂等因素。钨粒子最先被用于基因枪转化技术，是将烟草花叶病毒(tmv)rna吸附到钨粒子表面，轰击洋葱表皮细胞，经检验发现病毒rna能够进行复制。后来，mccabe(1988)又采用金粉为dna微粒载体转化大豆成熟利子，获得了gu基因的稳定表达。金粉与钨粉相比较，金粉可能比钨粉对细胞的伤害与毒性更少，且颗粒大小一致。钨粉比较便宜，但对一些细胞可能有毒害作用。微弹运动速度是影响转化率的一个重要因素，速度不同对受体组织和细胞的穿透力和伤害程度不同。籼稻和粳稻对微弹的速度要求不尽一致，轰击时应根据转化的受体材料特点做相应的调整。微弹的射程是指样品室的靶材料与基因枪挡板之间的距离，它是影响转化率的一个重要因素。射程越大，穿透力越小;而射程越小，穿透力越大。刁现民等研究表明：以400m、以下的轰击速度，10cm样品室高度的转化结果显著地低于7cm的结果。轰击压力也是影响基因枪法转化频率的一个重要因素，易自力等在以6cm的轰击距离，每枪100g金粉和0。2g的dna用量的条件下，分别使用900pi，1100pi，1300pi这3种不同的压力膜对籼稻愈伤组织进行基因枪转化，结果表明900pi的压力膜的转化效果最好，每皿平均gu基因瞬时表达的蓝点数最多。转化频率与弹膛内的真空度呈正相关，但受体材料对真空度只有一定的耐受性，所以弹膛内的真空度有一定的限制。轰击的次数对转化频率有一定的影响，易自力等在以6cm的轰击距离，每枪100g金粉和o。2g的dna及900pi压力膜的情况下，对籼稻愈伤组织进行每皿轰击1枪、2枪和3枪的比较研究。结果表明以轰击2枪的效果最好。但薛锐等对16个水稻品种进行轰击1次和2次的对比试验，结果却发现供试的16个品种均没有发现明显的差异。dna纯度越高越容易获得成功的转化。这是因为高度纯化的dna射入受体细胞后整合到植物基因组的几率更高。dna的浓度对基因转化率也有影响，浓度太高容易使微弹粘连成大的凝结块而使转化频率减低。目前对粳稻品种普遍采用的是金粉和质粒dna的浓度为每枪500g和1g，但对籼稻品种两者的用量应该下降到1、4到1、8。氯化钙和亚精胺是常用的dna沉淀剂，使dna附着在金属颗粒的表面，沉淀剂的浓度对转化频率有影响。刁现民等在其它轰击参数不变的情况下，分别进行了不同浓度的cacl2和不同浓度的亚精胺对gu基因瞬时表达的影响，结果表明：0。51、5mol、l的cacl2，3050mmol、l的亚精胺的转化率最高。2、5筛选剂类型在植物基因转化中，外源基因稳定整合的频率低。如何选择适当的筛选标记以准确、有效地区分转化与非转化细胞，产生选择压力，使未转化细胞不能生长，且不干扰细胞的正常生长与植株再生是转化成功的重要环节之一。较早应用于水稻转化实验的选择标记基因是新霉素磷酸转移酶基因(npt)，对卡那霉素具有抗性。但由于水稻对卡那霉素具有天然抗性，没能广泛应用。g418是一种与卡那霉素饵近的氨基糖苷类抗生素，不能被新霉素磷酸转眵酶激活，用它作选择标记比卡那霉素更有效，而且再生绿苗频率更高。现在bar当作选择基因也已被用于水稻遗传转化研究。潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因是另一应用广泛且更有效的标记基因，它具有对潮霉素的抗性，用潮霉素可以明显区分已转化和未转化的组织。不同选择剂应用浓度和选择时间应根据不同材料的具体情况而定。马炳田等报道了通过调节潮霉素的使用浓度，在抗虫转基因水稻研究中提高筛选率，结果表明：筛选时潮霉素使用浓度为2030mg、l;分化时潮霉素使用1525mg、l，可得到较高的抗性愈伤组织筛选率和绿苗分化率。3基因枪法转化的外源基因的遗传特性基因枪法转化是利用物理方法将裸露的dna随机地导入植物受体细胞，其有序性和计量性都较差，整合机制乜不清楚。外源dna的整合位点较多，可以在一条染色体或不同染色体上进行多位点整合。整合的外源dna易发生结构变化和修饰，如丢失、环化甲基化等。整合外源dna的拷贝数也较多，多拷贝的比例相对较高。整合外源dna的遗传效应比较复杂，基因间的位置效应，共抑制现象等表现明显。整合外源基因的遗传特性多，转基因植株的表型丰富，f1代植株的分离比例复杂，有的符合经典的孟德尔规律，但出现31的分离比较少，其遗传急定性也表现较差。唐祚舜等用基因枪法将潮霉素磷酸转移酶基因导入粳稻品种77170，获得转基因植株，自交后代(t1和t2)潮霉素抗性表现为显性单基因位点的遗传方式，符合孟德尔分离规律。陶利珍等用基因枪法将含有hpt基因和gu基因的质粒piltab227导入bamati-1等籼稻品种，对hpt基因在bamati-1的各个世代的遗传及表达分析表明：hpt基因普遍呈31的分离，符合单基因控制的孟德尔遗传规律。同时也发现了一些株系表现11的分离，推测可能是由于基因沉默的结果。程在全等用质粒ptok233和pjpm44分别用农杆菌介导法和基因枪法转化水稻愈伤组织，获得一批转基因植株，总dna分别用质粒上的单切点酶酶切和双切点酶切后outhern杂交分析转基因拷贝数及转基因表达盒数目，结果表明：农杆菌介导转化法的转基因植株的转基因拷贝数相对少一些(平均为2、1和2、3)，而基因枪法转化产生的转基因植株的转基因拷贝数相对多一些(平均为4、2和5、6)，并且农杆菌介导转化法的转基因植株的基因表达盒dna重排概率低于由基因枪法转化产生的转基因植株的基因表达盒dna重排概率，农杆菌介导转化法的dna重排概率为0。07和0。106;由基因枪法转化的dna重排概率为0。57和0。66;华志华等通过对低拷贝数的转基因植株京引119的世代连续跟踪分析以及高世代材料的群体遗传分析表明，共转化基因bar和cecropinb在基因组中紧密连锁并能稳定的遗传和表达。4基因枪法的前景展望用基因枪辅助农杆菌转化可以提高转化频率。明小天等用携带普通双元载体的根癌土壤杆菌eha105菌株对粳稻中花8号不敏感，转化效率较低，低于5%。利用基因枪将根癌土壤杆菌细胞直接轰击到水稻愈伤组织中可以显著提高其转化效率，转化效率可达7%以上。赵燕等同样发现，基因枪法与农杆菌介导法相结合的gu基因瞬间表达蓝点数比单独用基因枪法和农杆菌介导法时分别提高了5、48%和12、07%。基因枪可将外源基因导入细胞器，并且在酵母线粒体、烟草的叶绿体中取得了成功。细胞器的遗传系统也具有重要作用，它与细胞核遗传系统互相调节，共同调控着细胞的生命活动。利用基因枪技术为外源基因导入特定组织提供了可能，因此可以用于研究植物的发育及调控。如果把外源的特定基因导人不同的细胞或不同发育时期，则可以研究其基因表达的特点。通过培养条件的改变可以研究基因表达的环竟因素。5存在的问题及需进一步研究的问题基因枪转化技术从诞生以来已取得了可喜的进展，但还是存在不少问题有待进一步研究。如转化频率低，籼稻的转化率一般不到1%，粳稻高一些。目前大多数只是报道转化后的瞬时表达，而稳定遗传的比例甚少，外源基因的整合机制等理论问题也不太清楚。为此今后有待进一步研究的问题有：(1)应进一步提高基因枪的可控性、准确性、精确性;(2)微弹的表面结构、大小、均一性、承载dna的量及dna微弹的制备技术;(3)不同物种，不同组织和细胞拘轰击条件;(4)建立高频率再生的基因转化受体系统。尽管目前植物组织培养的研究已有近80年的历史，但是建立一个高频率的基因转化受体系琉与一般的组织培养获得再生植株还有很大的差距;(5)轰击后进入受体细胞的dna生物学变化及其调控等理论问题。注：