第六章---食物传播的病原微生物的检验.doc

第六章 食物传播的病原微生物的检验 动物源性食品在加工、运输、储藏过程中，动物携带的病原微生物会传染给人类，从而引发感染，称食物感染。又称为肉源性食品感染，其中，人畜共患病原微生物在食物感染中占重要比重。 人、畜共患病是指脊椎动物与人类之间传播的感染疾病，即由共同病原引起、在流行病学上相互关联的人和脊椎动物的疾病。如：鼠疫、炭疽、霍乱等，主要传染源是鼠类、禽畜及其肉、蛋、乳产品等。 内容提要炭疽杆菌及其检验 、布氏杆菌及其检验、禽流感病毒及其检验、朊病毒及其检验第一节 炭疽杆菌及其检验炭疽(Anthrax) ：由炭疽杆菌所引起的人畜共患的急性、热性、败血性传染病。临床表现: 皮肤坏死溃疡、焦痂、周围组织广泛水肿及毒血症症状，偶尔引致肺、肠和脑膜的急性感染，可伴发败血症。 一、生物学特性（一）形态特征 *两端平直的革兰阳性大杆菌。 *在体内细菌呈单个、成双或短链排列。有荚膜，不产生芽孢。 *在体外细菌呈竹节状长链排列。无荚膜，产生芽孢。无鞭毛。（二）培养特性 营养要求不高，在普通平板上生长良好，长成灰白色、表面粗糙的菌落，低倍镜下可见菌落边缘呈卷发状。在血琼脂平板上的形态为：灰白色、半透明、中等大小，常不规则，玻璃样，周围无溶血环。（三）抵抗力 *炭疽杆菌对外界理化因素的抵抗力不强，但芽孢抵抗力很强，在干燥状态下可存活2030年。*直接日光暴晒100h，煮沸40min，干热150 60 min灭活，鬃毛上芽孢12l高压需15 min。*现场消毒常用20漂白粉，24甲醛，0.5过氧乙酸。 （四）血清学特征 荚膜抗原：多肽，抑制调理作用，与其侵袭力有关，抗吞噬。 菌体抗原：无毒性，有种特异性。 保护性抗原：免疫原性。 芽孢抗原：免疫原性及血清学诊断价值。 （五）致病性 传染源：患病的牛、羊、骆驼等食草动物。 传染途径： 1、经皮肤粘膜：伤口直接接触病菌，若病菌毒力强可直接侵袭完整皮肤。 2、经呼吸道：吸入带炭疽芽孢的尘埃、飞沫等。 3、经消化道：摄入被污染的食物或饮用水等。进食染菌肉类。 致病物质荚膜：抗吞噬作用，利于细菌繁殖;炭疽毒素： 很强的外毒素，损伤微血管内皮细胞，感染性休克，死亡; 由因子：水肿因子（EF）、因子：保护性抗原(PA)、因子：致死因子(LF)组成的复合多聚体。 特点：单独注入均无毒性，保护性抗原+水肿因子或致死因子分别引起水肿、坏死或死亡。生物导弹技术：炭疽毒素+单克隆抗肿瘤抗体肿瘤 致病机制 各种途径 *炭疽杆菌芽孢 体内繁殖，产生外毒素 局部组织出血、坏死、水肿*荚膜抵抗吞噬细胞的吞噬作用 细菌扩散 邻近淋巴结炎、败血症 各组织器官炎症:血源性肺炎、脑膜炎等。 损伤微血管、内皮细胞*炭疽毒素 释放组织凝血活酶 弥漫性血管内凝血 （DIC） 微循环障碍、感染性休克 所致疾病皮肤炭疽(占90%): 皮肤出现红斑、丘疹、水疱，周围组织肿胀及浸润，继而中央坏死形成溃疡性黑色焦痂，焦痂周围皮肤发红，肿胀，疼痛不显著。该部位附近的淋巴结肿大且常化脓，伴有发热、头痛、关节痛等。肺炭疽(2%-3%） 高热，呼吸困难，可有胸痛及咳嗽，咳粘液血痰。肺部本症常只有散在的细湿罗音。X射线的主要表现为纵膈影增宽。常见胸腔积液。   肠炭疽(3%-6%) ： 急性起病，发热，腹胀，剧烈疼痛，腹泻，通常为血样便或血水样便。可有恶心、呕吐，呕吐物中含血丝及胆汁。可累及消化道以外系统。脑膜炎型炭疽： 可继发于各型，也可能直接发生。剧烈头痛，呕吐，继而出现谵妄、昏迷、呼吸衰竭，脑脊液多为血性。 炭疽败血症 严重的全身中毒症状，高热、寒战，感染性休克与弥漫性血管内凝血表现，皮肤出现出血点或大片淤斑，腔道中出现活动性出血，迅速出现呼吸与循环衰竭。在循环血液中可检出大量炭疽芽孢杆菌。 三、炭疽杆菌的检验 、采样 采集皮肤溃疡的渗出物、排泄物、血、胸腹水及脑脊液等标本。 采取标本时必须遵循的两条原则: 1)尽可能在抗生素治疗开始前采取标本。 2)除必要时并在具备操作病毒细菌条件的实验室内，不得用解剖的方式获取标本。所需的血液与组织标本，均应以穿刺方式取得。2、显微镜检查1）复合负染法 将标本或悬液滴在载玻片上，立即加等量的炭素墨水，混匀推片。待干燥后滴加95%乙醇数滴，干燥后再以1%结晶紫液染1min，用水冲洗，干后用油镜检查。如果发现在细菌与炭素颗粒之间存在明显的、连续的间隔带，即说明细菌的周围存在荚膜。 适用于液体标本（如血液、脑脊液）、悬液标本（如粪便或混有血液的土壤）。 2）荚膜染色法 将标本涂片或印片干燥，妥善包装后带入实验室，按常规方法固定：以美蓝染液染色3-5min，水洗、干后镜检。菌呈蓝色、荚膜呈红色。 组织印片标本，或制片后无法立即进行显微镜检查，或进行大面积普查时，推荐使用荚膜染色法。 3）显微镜检查结果判定来自病人、病畜或尸体的标本中如发现由较宽的荚膜环绕的、两端平齐的粗大杆菌，特别是镜下发现大量、纯一通常呈竹节状的该种细菌，而且没有明显的其他细菌污染时，炭疽的诊断便可确立。 3、细菌分离培养 炭疽芽孢杆菌的分离培养应同时用两种培养基进行：常规的血琼脂平板和选择性平板。1）标本处理 在正常情况下应当无菌的标本，如血液或脑脊液，直接涂布上述两种平板；组织标本应先以无菌剪刀剪开一断面，在培养基表面压印，然后以白金耳涂开。 污染、陈旧的标本，首先制成悬液。适当稀释，或经自然沉淀除去粗大沉淀物后，3000r/min离心30min，取富集的沉淀物。将所得的悬液67加热15min，冷却后涂布上述两种平板。2）挑选可疑菌落上述平板在37孵育过夜或24h后，检查是否长出可疑的炭疽芽孢杆菌菌落。炭疽芽孢杆菌在选择平板上菌落较血琼脂平板上的小，具有类似特征，菌落呈蓝绿色。遇菌落形态与以上描述完全一致但呈黄色的菌落，也应进行接下来的鉴定步骤。 4、炭疽芽孢杆菌鉴定将上述可疑菌落挑出，划线接种于普通营养琼脂平板上，在划线区内分别贴上浸有诊断用炭疽芽孢杆菌噬菌体和青霉素的纸片。37孵育过夜或24h后，在两种纸片的周围均出现明显的抑菌环，便可判定为炭疽芽孢杆菌。血清学检验方法环状沉淀反应（Ascoli氏沉淀试验）取病死动物组织数克，剪碎或捣烂，加5-10倍生理盐水，煮沸5-10min，冷却过滤或离心沉淀，用毛细管吸取上清液，缓慢加入装有炭疽素血清的小玻璃试管中，出现整齐的两层液面，在两层液面接触处出现白色的沉淀环为阳性（最好在10-15min内观察）。此法简便快速，检出率较高。四、治疗 青霉素首选、 四环素或氯霉素第二节 布氏杆菌及其检验一、概况 布氏杆菌又名布鲁菌，是多种动物和人布氏杆菌病的病原，主要侵害生殖器官和关节，主要特征是：生殖器官、胎膜以及多种器官组织发炎、坏死和肉芽肿的形成，引起流产、不孕、关节炎症等病症。 布氏杆菌属分为羊、牛、猪、鼠、绵羊及犬布氏杆菌6个种，20个生物型。中国流行的主要是羊（Br.melitensis）、牛(Br.Bovis)、猪(Br.suis)三种布氏杆菌，其中以羊布氏杆菌病最为多见。 二、生物学特性 1、形态学特征 本菌呈球杆状或短杆状细小的G-菌，新分离者趋向球形。多单生，很少成双、短链或小堆状，不形成芽孢和荚膜，无鞭毛。2、培养特性 专性需氧，牛布氏杆菌在初代分离培养时尚需5-10%CO2，最适生长温度37，最适pH6.6-7.4。 营养要求高，生长时需硫胺素、烟草酸和生物素等；普通琼脂上生长贫瘠，加上一些营养如马血清、血液、葡萄糖、甘油等，都可促进本菌生长。 实验室常用肝汤琼脂、马铃薯浸汁琼脂、胰蛋白胨琼脂培养该菌。 肝汤琼脂、胰蛋白胨琼脂菌落特征：细小、柔软、湿润、圆形隆起、透明闪光的露滴状菌落，菌落大小不等，小的0.05-0.1mm，大的0.5-1.0mm。 血琼脂：灰白、隆起细小圆形菌落，无溶血性。 布氏杆菌菌落易发生光滑型(S) 粗糙型(R)变异。3、抗原性1）A 抗原和M 抗原 是细胞壁表面的脂多糖蛋白复合物。 光滑型布氏杆菌具有两种表面抗原，分别能与相应的抗血清表现凝集反应。2）R抗原 细胞壁中的脂多糖复合物。 是大多数非光滑型布氏杆菌的共同抗原决定簇，其抗血清可与绵羊种和犬种布氏杆菌凝集。（绵羊种和犬种布氏杆菌是天然的R型种）。 4、抵抗力 对外界的抵抗力较强，在污染的土壤和水中可存活1-4个月，皮毛2-4月，乳、肉中约2个月，粪便中120d，流产胎儿中至少75d。 对湿热的抵抗力不强，60 加热30min或70 加热5min杀死，煮沸立即死亡。 对消毒剂的抵抗力也不强 。5、致病性 传播途径：皮肤粘膜侵入、消化道食入，吸入污染的尘埃。 进入机体后，可被吞噬细胞吞噬成为胞内寄生菌，并在淋巴结生长繁殖。潜伏期2周-7个月，一旦侵入血流，则出现菌血症，由于内毒素的作用，致使机体发热、无力等中毒症状，之后细菌定位于网状内皮系统、乳腺等生殖器官，妊娠中期，在胎盘绒毛膜大量繁殖，导致坏死性胎盘炎，致使孕畜流产。 本菌多为细胞内寄生，治疗难于彻底，易转为慢性及反复发作。三、 布氏杆菌的检验布氏杆菌的检验主要依靠血清学检查及变态反应检查，细菌学检查仅用于发生流产的动物和其他特殊情况。（一）细菌学诊断直接涂片、柯氏与革兰氏染色、显微镜检 病料直接涂片、柯氏与革兰氏染色、显微镜检 分离培养 含菌量少的病料用肝汤或胰蛋白胨增菌肝汤或胰蛋白胨琼脂或血平板直接划线纯培养生化试验血清学试验 阳性者 鉴定种及生物型动物试验，豚鼠最易感，小鼠和家兔有抵抗力。（二）血清学检查 动物在感染布氏杆菌7-15d可出现抗体，检测血清中的抗体是布氏杆菌病诊断的主要手段。有多种检查方法，如：凝集试验、酶联免疫吸附检测(ELISA)，后者检测的特异性好、灵敏度高。 ELISA原理 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性； 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，其能保持其免疫学和酶学活性； 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 （三）PCR检测 此法敏感、特异、快速，实时荧光定量PCR已用于布氏杆菌特异性基因的检测，即在PCR反应体系中加荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个过程。通过标准曲线可进行定量。第三节 禽流感病毒及其检验禽流感： 禽流感是禽流行性感冒的简称，这是一种由禽流感病毒引起的家禽和野禽的一种从呼吸病到严重性败血症等多种症状的综合病症，被国际兽医局定为A类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。也可传染给人。禽流感的流行病学主要特点为：突然暴发，发病率高，病死率高，季节性不强，来源常不明。 一、生物学特性（一）形态与结构正粘病毒科的甲型（A）流感病毒，呈球形，直径80120nm，有囊膜。基因组为单股负链RNA，含8个基因片断。基因易发生变异。病毒表面含血凝素（红血球凝集素）(HA蛋白)和神经氨酸酶(N蛋白)，都为糖蛋白 。（二）分类依其H、N 蛋白抗原性的不同，目前可分为15个H亚型(H1H15)和9个N亚型 (NlN9)。感染人的主要是H5N1、H9N2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情重。原本低致病性的禽流感病毒株，经6-9个月禽间流行可编译为高致病性毒株。（三）培养特性能在鸡胚、鸡胚成纤维细胞中生长，大多不致死鸡胚，凝集多种动物的红细胞。 （四）抵抗力病毒对紫外线敏感，在阳光直射下4048h灭活；加热551h、6010min、1001min可被灭活；对大多数防腐消毒药敏感；病毒在干燥尘埃中可存活2周，在4可保存数周，在冷冻的禽肉和骨髓中可存活10个月之久。（五）致病性1、传染源：主要为鸡、鸭等家禽 ，特别是鸡 。2、传染途径： 消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等途径传播。 主要为接触传播，即通过密切接触H5N1感染的家禽或其粪便，以及直接接触H5N1而传染 。 扩散主要是通过粪便中大量的病毒粒子污染空气而传播。人员和车辆往来是传播本病的重要因素。3、病禽症状 病鸡死亡之前常表现出无毛处皮肤发绀、极度消瘦、下痢、身体蜷缩、共济失调、惊厥等中枢神经系统和全身中毒症状。病鸡精神沉郁，肿头，眼睑周围浮肿，肉冠和肉垂肿胀、出血甚至坏死，鸡冠发紫，病鸡腿部肌肉出血，有出血点或出血斑。4、人临床症状： 潜伏期1-7天，主要表现为发热、流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛、头痛、全身不适，部分患者可有消化道症状。 体温持续在39以上。 少数患者发展为肺出血、胸腔积液、肾衰竭、败血症休克等多种并发症而死亡。二、禽流感病毒的检验 1、样品来源：泄殖腔和器官拭子是通常的样品来源。2、直接检测病毒抗原1）抗原捕捉ELISA： 由于IgM抗体出现在感染早期，故检测出IgM，作为某疾病的早期诊断。 用抗IgM抗体包被固相载体，吸附待检血清中的IgM，洗涤除去血清中的IgG及其他成分，再特异性抗原与IgM结合，再加入酶标记抗体和底物显色进行测定，特异性好。2）荧光抗体法：以荧光物标记抗体进行抗原定位的技术。特点：速度快、操作简单、敏感性高。3、直接检测病毒基因RT-PCR(逆转录PCR)：先以病毒RNA为模板，逆转录出DNA，再进行扩增。第四节 朊病毒及其检验 朊病毒(prion) 朊病毒/传染性蛋白粒子/朊粒/朊毒体：是一种不同于细菌、病毒或类病毒的在分类上尚示定论的病原因子，其本质为由正常宿主细胞基因编码的、构象异常的蛋白质，称为朊蛋白(prion protein, PrP)，目前尚未检出任何核酸成分，是人和动物的传染性海绵状脑病（TSEs)的病原体。一、生物学特性 （一）形态与结构prion 是一种不含核酸和脂类的疏水性糖蛋白，分子量为2730×103，因此又称为PrP2730。大小30-50nm，电镜下看不到病毒粒子，负染后看到聚集而成的棒状体，大小10-250nm ×100-200nm。其能在宿主细胞内复制，无免疫性，不诱发抗体。两种不同的分子构型： 细胞朊病毒蛋白(cellular PrP, PrPC)：具有42%的-螺旋，3%的折叠。存在于正常组织及感染动物的组织中，是正常基因的产物，通常情况下是无害的。对蛋白酶K敏感。 羊痒疫朊病毒蛋白(scrapie prion protein , PrPSC)：-螺旋占30%，折叠高达43%，仅存在于感染动物的组织中，与致病和传染有关。对蛋白酶K有抗性。 （二）抵抗力朊病毒颗粒对一些理化因子 的抵抗力之强，大大高于已知各类微生物和寄生虫。（三）致病性1、传染源：感染朊毒体的人和动物。2、传染途径：消化道传播。医源性传播：脑外科手术、器官移植等。遗传。3、导致疾病疯牛病：牛海绵状脑病。病牛临床表现为步态不稳、共济失调、搔痒、烦躁不安等神经症状。绵羊痒病：它是羊的一种慢性致死性疾病，病羊具有中枢神经系统变性、剧痒、共济失调、高死亡率等特点。克-雅氏病：人的一种中枢神经系统变性疾病。其临床症状和病理组织学变化与疯牛病、绵羊痒病十分相似。共同特征：潜伏期长（可达数年至数十年），一旦发病即呈慢性进行性发展，最终死亡。4、发病机理 PrPC转变为PrPSC是疾病发生的基本条件，PrPSC在中枢神经系统细胞内聚集，导致神经元的破坏。 脑组织病理学特点：中枢神经细胞空泡化、弥漫性神经细胞缺失、胶质细胞增生、淀粉样斑块形成、脑组织海绵状改变；PrPSc聚集。二、朊病毒的检验 1、免疫组化技术 是目前确认TSEs的有效手段。取可疑患者的脑组织或非神经组织切片，经脱水性或水解性高压消毒、甲酸和硫氰酸胍处理，使其感染性消失并破坏PrPC后，再用单克隆抗体检测对上述处理有抗性的PrPSC。2、免疫印迹技术组织印迹法检测PrPSC是一种简单而敏感的诊断方法。首先将待测的样品印迹在固相载体硝酸纤维素膜上，用病毒的家兔特异性抗体（IgG）与吸附在固相载体上的病毒进行特异性反应，再与酶标记的羊抗兔第二抗体进行反应，最后用酶的反应底物进行显色反应，根据颜色的变化，确定病毒的感染程度。 3、基因分析 从病人外周血白细胞中提取DNA，对20号染色体prion基因进行分子遗传学分析。