实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质.ppt

葡聚糖凝胶柱层析法分离蛋白质葡聚糖凝胶柱层析法分离蛋白质生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室教学目标教学目标:v了解了解：1.层析技术的基本原理。层析技术的基本原理。2.有效分配系数有效分配系数Kav的计算。的计算。v理解：理解：葡聚糖凝胶的选择和准备。葡聚糖凝胶的选择和准备。v掌握：掌握：1.凝胶层析的原理和操作方法。凝胶层析的原理和操作方法。2.有效分配系数有效分配系数Kav的意义。的意义。教学重点：教学重点：教学重点：教学重点：凝胶层析的原理和实验步骤。凝胶层析的原理和实验步骤。凝胶层析的原理和实验步骤。凝胶层析的原理和实验步骤。教学难点：教学难点：教学难点：教学难点：掌握装柱、加样、洗脱、收集样品的操作步骤。掌握装柱、加样、洗脱、收集样品的操作步骤。掌握装柱、加样、洗脱、收集样品的操作步骤。掌握装柱、加样、洗脱、收集样品的操作步骤。教学对象：教学对象：教学对象：教学对象：临床医学五年制本科临床医学五年制本科临床医学五年制本科临床医学五年制本科使用教材：使用教材：生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验技术技术，杨安钢主杨安钢主编，高等教育出版社，编，高等教育出版社，2008年第年第1版版参考资料：参考资料：生物化学生物化学，贾弘褆主编，人卫出版社，贾弘褆主编，人卫出版社，2005年第年第1版版推荐网站：推荐网站：1.第三军医大学生物化学与分子生物学教研室第三军医大学生物化学与分子生物学教研室：http:/192.168.4.133:8002/2.美国国立生物技术信息中心美国国立生物技术信息中心：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov层析法又称色谱法或色层分析法，层析法又称色谱法或色层分析法，1903年茨维特年茨维特（M.S.Tsweet）利用活性碳酸钙与石油醚的共同作）利用活性碳酸钙与石油醚的共同作用把叶绿素分离呈现出不同颜色的色谱带用把叶绿素分离呈现出不同颜色的色谱带。茨维茨维特把上述分离方法叫做特把上述分离方法叫做色谱色谱(chromatography)茨维特实验茨维特实验 利用混合物中各组分的利用混合物中各组分的物理、化学性质物理、化学性质 的差别，的差别，使各组分使各组分以不同程度分布在以不同程度分布在两相两相(固固定相、流动相定相、流动相)中达到中达到分离分离。l溶解度溶解度l分子极性分子极性l分子大小分子大小l分子形状分子形状l吸附能力吸附能力l分子亲合力等分子亲合力等层析技术的基本原理层析技术的基本原理l固定相固定相l流动相流动相物理物理化学化学性质性质两相两相v固定相固定相(Stationary phase)：是色谱的基质是色谱的基质，可以是可以是固体物质固体物质（如吸附剂、凝胶、离子（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是交换剂等），也可以是液体物质液体物质（如固定（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些物质能在硅胶或纤维素上的溶液），这些物质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。交换等作用。v流动相流动相(Mobile phase)：在色谱分离过程中，：在色谱分离过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动移动的液体、气体等。的液体、气体等。层层 析析层析的分类层析的分类一、按两相所处的状态分类一、按两相所处的状态分类 层析层析气相层析气相层析液相层析液相层析气气-固层析固层析气气-液层析液层析液液-固层析固层析液液-液层析液层析层析的分类层析的分类 二、按操作方式分类二、按操作方式分类1柱层析柱层析薄层层析薄层层析423纸层析纸层析12柱层析柱层析层析的分类层析的分类v柱层析（柱层析（column chromatography）将固定相装在将固定相装在层析柱层析柱中，使样品中，使样品朝着一个方向移动，通过各组分随朝着一个方向移动，通过各组分随流动相流动而得到分离的方法。流动相流动而得到分离的方法。1.吸附层析吸附层析 2.分配层析分配层析 3.离子交换层析离子交换层析 4.亲和层析亲和层析 5.凝胶层析凝胶层析 层析的分类层析的分类三、按层析的分离机制分类三、按层析的分离机制分类凝胶层析凝胶层析(分子筛过滤、排阻层析分子筛过滤、排阻层析)混合物随流动相经混合物随流动相经固定相固定相(网状孔径网状孔径)的的层析柱时，混合物中各组份按其层析柱时，混合物中各组份按其分子大分子大小不同小不同而被分离的技术。而被分离的技术。固定相（凝胶）固定相（凝胶）v凝胶是一种凝胶是一种不带电不带电的具有三维空间的的具有三维空间的多孔多孔网状结构网状结构的高分子聚合物，每个颗粒的细的高分子聚合物，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致。微结构及筛孔的直径均匀一致。G型（型（G-X:X数字数字代表代表 交联度交联度与与吸水量）吸水量）LH型型葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（Sephadex）聚丙稀酰胺凝胶（聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（Sepharose）型号型号(G-X)(G-X)分离范围分离范围(分子量分子量DaDa)应用应用G10700脱盐、短肽、小分子的分离脱盐、短肽、小分子的分离G151,500G251,000 5,000G-501,50030,000低分子量蛋白、多肽的分离低分子量蛋白、多肽的分离G-753,00070,000中低分子量蛋白、多肽的分离中低分子量蛋白、多肽的分离G1004,000 150,000中高分子量蛋白的分离中高分子量蛋白的分离G1505,000 400,000高分子量蛋白的分离高分子量蛋白的分离G2005,000 800,000SephadexSephadex的常见规格（分级范围）的常见规格（分级范围）凝胶层凝胶层析析的原理的原理v比比孔径大的分子孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，不能扩散到孔穴内部，完全完全被排阻在孔外被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，首先流出流程短，流动速度快，首先流出。v较小的分子较小的分子则可以则可以渗透进入凝胶颗粒内渗透进入凝胶颗粒内部部，然后再扩散出来，经历的，然后再扩散出来，经历的流程长，流程长，流动速度慢，后流出流动速度慢，后流出。分子筛效应分子筛效应重点重点1 1凝胶层析的数理关系凝胶层析的数理关系 凝胶体积凝胶体积Vg外水体积外水体积Vo内水体积内水体积Vi柱床体积柱床体积Vt=r2h=Vg+Vo+Vi洗脱体积（洗脱体积（Ve）：）：自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的洗脱液体积（流出的洗脱液体积（Ve）。VeVoViKd =某个组分在固定相和流动相的浓度关系。某个组分在固定相和流动相的浓度关系。分配系数（分配系数（Kd):):数理关系数理关系 有效分配系数（有效分配系数（Kav）:VeVoKav =VtVo(1)Ve=Vo Kd=0大分子完全大分子完全被排阻于凝胶被排阻于凝胶颗粒之外颗粒之外,故故最先流出最先流出Text in here(2)0 Kd 1 Ve=Vo+ViKd中等大小的中等大小的分子部分进入分子部分进入凝胶内部，流凝胶内部，流出速度居中。出速度居中。(3)Ve=Vo+Vi Kd=1小分子不被小分子不被排阻，全进入排阻，全进入凝胶颗粒内部凝胶颗粒内部,故最后流出。故最后流出。KKd d=0 0=0 0KKd d1 1 KKd d=1=1洗脱体积洗脱体积洗脱体积洗脱体积分配系数与被分离物分子量之间的关系分配系数与被分离物分子量之间的关系重点重点2 2本实验中用本实验中用Sephadex G 50（分离分子量范（分离分子量范围围150030000），以蒸馏水为洗脱剂（流），以蒸馏水为洗脱剂（流动相）。动相）。分离分离蛋白蛋白A（黄色，分子量在黄色，分子量在G 50的分离范的分离范围内围内）与）与蛋白蛋白B（蓝色，分子量大于蓝色，分子量大于G 50的的分离范围内分离范围内）的混合物。）的混合物。实验步骤实验步骤 实验步骤实验步骤 一、凝胶的准备一、凝胶的准备1.称取称取Sephadex G 50 2g，置于，置于锥形瓶中锥形瓶中，加加蒸馏水蒸馏水约约30ml，在沸水浴中，在沸水浴中加热加热1h或或浸泡浸泡24h溶胀溶胀凝胶，冷却到室温后再装柱。，冷却到室温后再装柱。2.溶胀处理后，对凝胶进行溶胀处理后，对凝胶进行反复漂洗反复漂洗，倾斜，倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，反复法除去表面悬浮的小颗粒，反复23次。次。二、装柱二、装柱1.取层析柱，将层析柱固定在取层析柱，将层析柱固定在支架上，支架上，调整层析柱与水平调整层析柱与水平面垂直面垂直。2.烧结板下端的死区用蒸馏水烧结板下端的死区用蒸馏水充满（充满（注意：不得留有气泡，注意：不得留有气泡，可多加约可多加约1cm高水层，使柱高水层，使柱内凝胶通过沉积作用更加均内凝胶通过沉积作用更加均匀匀），然后关闭层析柱的出），然后关闭层析柱的出口。口。1cm 砂芯砂芯3.将凝胶悬液沿玻璃棒小心地徐徐灌将凝胶悬液沿玻璃棒小心地徐徐灌入柱中，待底部入柱中，待底部凝胶沉积凝胶沉积1-2cm时，时，再打开出口，继续加入凝胶悬液至再打开出口，继续加入凝胶悬液至凝胶沉积约凝胶沉积约15cm高度即可（高度即可（注意：注意：凝胶悬液尽量一次加完，以免出现凝胶悬液尽量一次加完，以免出现分层的凝胶带分层的凝胶带）。）。4.新柱装好后，加新柱装好后，加3-5倍体积蒸馏水流倍体积蒸馏水流过柱床，然后平衡过柱床，然后平衡10min。（。（注意：注意：始终层析柱与水平面垂直）始终层析柱与水平面垂直）三、加样与洗脱三、加样与洗脱1.加样时先将柱的出口打开，让蒸馏水逐渐流出，加样时先将柱的出口打开，让蒸馏水逐渐流出，待凝胶床面只留下极薄的一层蒸馏水时，关闭出待凝胶床面只留下极薄的一层蒸馏水时，关闭出口（口（注意：不可使凝胶柱表面干涸注意：不可使凝胶柱表面干涸）。）。2.用用移液器移液器将将200l样品小心加到凝胶床表面（样品小心加到凝胶床表面（注意：注意：加样时滴管垂直伸入柱内，接近液面处集中滴加，加样时滴管垂直伸入柱内，接近液面处集中滴加，动作要轻柔，不要将床面冲起，亦不要沿柱壁加动作要轻柔，不要将床面冲起，亦不要沿柱壁加入入）。）。3.然后打开出口，使样品进入柱床面，滴加然后打开出口，使样品进入柱床面，滴加12倍样倍样品体积的蒸馏水（品体积的蒸馏水（沿管壁轻柔滴加沿管壁轻柔滴加），待完全流），待完全流入柱床内后，再加蒸馏水进行扩展洗脱，直到两入柱床内后，再加蒸馏水进行扩展洗脱，直到两条区带分开为止。条区带分开为止。移液器正确使用移液器正确使用v选择适当量程选择适当量程v正确安装枪头正确安装枪头v吸液第一档，放液第二档吸液第一档，放液第二档v垂直吸液，慢吸慢放垂直吸液，慢吸慢放v吸液后不可将枪平放吸液后不可将枪平放四、样品收集四、样品收集 1.样品一旦加入柱床面后马上用样品一旦加入柱床面后马上用烧杯收集流出液，（烧杯收集流出液，（注意柱床上注意柱床上要不断加水，保持要不断加水，保持1cm高水层高水层）直到两种蛋白全部洗脱。直到两种蛋白全部洗脱。2.倒出凝胶，清洗层析柱。倒出凝胶，清洗层析柱。实验注意事项实验注意事项X装柱时需保持柱体垂直于水平面，不可随意装柱时需保持柱体垂直于水平面，不可随意晃动层析柱，以保持凝胶柱表面平整。晃动层析柱，以保持凝胶柱表面平整。X加样时移液器垂直伸入柱内，接近液面处集加样时移液器垂直伸入柱内，接近液面处集中滴加，动作要轻柔，不要将床面冲起。中滴加，动作要轻柔，不要将床面冲起。X实验过程中需密切注意保持层析柱中的凝胶实验过程中需密切注意保持层析柱中的凝胶始终处于蒸馏水中，防止蒸馏水排空。始终处于蒸馏水中，防止蒸馏水排空。利用吸附层析介质表面的活性分子或利用吸附层析介质表面的活性分子或活性基团，对流动相中不同溶质产生活性基团，对流动相中不同溶质产生吸附作用吸附作用，利用其对不同溶质，利用其对不同溶质吸附能吸附能力的强弱力的强弱而进行分离的一种方法，称而进行分离的一种方法，称之为之为吸附层析吸附层析。常用的吸附剂常用的吸附剂：硅胶、氧化铝、活性：硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、磷酸钙炭、聚酰胺、磷酸钙吸附层析吸附层析(absorption chromatography)分配层析分配层析(partition chromatography)被分离组分在固定相和流动相中不断发生被分离组分在固定相和流动相中不断发生吸附和解吸附吸附和解吸附的作用，在移动的过程中物质的作用，在移动的过程中物质在两相之间进行在两相之间进行分配分配。利用被分离物质在两。利用被分离物质在两相中相中分配系数的差异分配系数的差异而进行分离的方法。而进行分离的方法。分配系数分配系数：在一定的条件下，某种组分在：在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中浓度的比值，常用固定相和流动相中浓度的比值，常用K值值表示。表示。溶质在溶质在固定相固定相中的浓度中的浓度（Cs）溶质在溶质在流动相流动相中的浓度中的浓度（Cm）K=K值大：被固定相吸附的牢固，随流动相的移值大：被固定相吸附的牢固，随流动相的移 动速度较慢。动速度较慢。若混合物中各组分若混合物中各组分K值相差较大值相差较大,则能较易地分则能较易地分离，反之，离，反之，K值相差较小，分离效果差。值相差较小，分离效果差。离子交换层析离子交换层析(ion exchange chromatography)用用离子交换剂离子交换剂（在惰性载体上引入带有电荷的活（在惰性载体上引入带有电荷的活性基团）作性基团）作固定相固定相，与与流动相中离子流动相中离子发生发生可逆性离可逆性离子交换子交换反应而进行分离的方法。反应而进行分离的方法。常用的离子交换剂：离子交换常用的离子交换剂：离子交换树脂树脂、离子、离子交换纤交换纤维素维素、离子交换、离子交换凝胶凝胶带电荷量带电荷量少少，亲和力，亲和力小小的先被洗脱下来，带电的先被洗脱下来，带电荷量荷量多多，亲和力，亲和力大大的后的后被洗脱下来。被洗脱下来。亲和层析亲和层析(affinity chromatography)v亲和力亲和力 生物分子间存在很多特异性的相互作用，生物分子间存在很多特异性的相互作用，如抗原抗体、酶底物、激素受体等，如抗原抗体、酶底物、激素受体等，它们之间都能够专一而可逆的结合。它们之间都能够专一而可逆的结合。v分离原理分离原理 在固定相载体表面偶联具有在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的特殊亲和作用的配基配基，这些配基可以与，这些配基可以与流动相中溶质分子发流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合生可逆的特异性结合而进行分离纯化。而进行分离纯化。1.Incubate crude sample with the immobilized ligand 2.Wash away non bound sample components from solid support 3.Elute 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶v 聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶，商商品品名名Bio-gel-P，也也是是一一种种人人工工合合成成凝凝胶胶，为为颗颗粒粒状状干干粉粉，在在溶溶剂剂中中能能自自动动吸吸水水溶溶胀成凝胶。胀成凝胶。1.1.结构：结构：基本骨架基本骨架：单体丙烯酰胺：单体丙烯酰胺交联剂交联剂：甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺聚合而成。聚合而成。化学性质：化学性质：v在水溶液、有机溶液、盐溶液中都较稳定。在水溶液、有机溶液、盐溶液中都较稳定。v在强碱和高温下易发生分解。在强碱和高温下易发生分解。v聚丙烯酰胺凝胶不带电荷，吸附效应小。聚丙烯酰胺凝胶不带电荷，吸附效应小。2.2.特点特点商品出售的聚丙烯酰胺凝胶为干凝胶形式，商品出售的聚丙烯酰胺凝胶为干凝胶形式，使用前需溶胀。凝胶的型号见教材使用前需溶胀。凝胶的型号见教材P18琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖是从海藻琼脂中分离得到的琼脂糖是从海藻琼脂中分离得到的天然凝天然凝胶胶，由，由D-半乳糖和半乳糖和L-半乳糖经脱水构成半乳糖经脱水构成的的多糖链。糖链间以氢键方式互相连接，形多糖链。糖链间以氢键方式互相连接，形成网状结够。成网状结够。琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥，否琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥，否则不能再溶胀恢复原有形状，因此商品大则不能再溶胀恢复原有形状，因此商品大都以含水状态供应，并应在湿态保存。都以含水状态供应，并应在湿态保存。琼脂糖凝胶是商品名因生产厂家不同而异。琼脂糖凝胶是商品名因生产厂家不同而异。（具体名称和型号见教材具体名称和型号见教材P18）琼脂糖凝胶特点琼脂糖凝胶特点v室温下其稳定性胶葡聚糖凝胶和室温下其稳定性胶葡聚糖凝胶和聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶，对样品的吸附性很小。胺凝胶，对样品的吸附性很小。v洗脱速度较快洗脱速度较快v排阻极限大，分离范围广，适合分离大分排阻极限大，分离范围广，适合分离大分子物质。子物质。小小 结结v凝胶层析的原理：分子筛效应凝胶层析的原理：分子筛效应v凝胶层析有效分配系数（凝胶层析有效分配系数（KavKav）：被分）：被分离的化合物被凝胶排阻的程度。离的化合物被凝胶排阻的程度。v层析实验操作过程中的注意事项。层析实验操作过程中的注意事项。v实验结果：观察到蓝色蛋白洗脱快，黄实验结果：观察到蓝色蛋白洗脱快，黄色蛋白洗脱较慢。色蛋白洗脱较慢。思考题思考题v凝胶层析的原理是什么？凝胶层析的原理是什么？v什么是有效分配系数（什么是有效分配系数（KavKav）？其意义是）？其意义是什么？什么？v用凝胶柱层析分离不同蛋白质，怎样才能用凝胶柱层析分离不同蛋白质，怎样才能得到较好的分离效果？得到较好的分离效果？Thank You!