盐析沉淀蛋白质时.ppt

第三章第三章 蛋白质的通性、纯化与表征蛋白质的通性、纯化与表征1、蛋白质的理化性质：、蛋白质的理化性质：酸碱性质、胶体性质与沉淀、变性、颜酸碱性质、胶体性质与沉淀、变性、颜色反应色反应2、分离纯化的方法：、分离纯化的方法：盐析、电泳、等电聚焦、层析等盐析、电泳、等电聚焦、层析等3 3、表征：、表征：活力、比活力活力、比活力蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。也有等电点。在等电点时在等电点时，蛋白质的溶解蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。度最小，在电场中不移动。在不同的在不同的pHpH环境下，蛋白质的电学性质不环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在等电带正电荷，在电场中向负极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白这种现象称为蛋白质电泳质电泳1 1、酸碱性质、酸碱性质阳离子PHPI兼性离子PH=PI可可解离基团有末端和侧链解离基团有末端和侧链故故p pI I与酸性、碱性氨基酸的数目有关与酸性、碱性氨基酸的数目有关如胃蛋白酶酸性氨基酸多，等电点偏酸性如胃蛋白酶酸性氨基酸多，等电点偏酸性有些球蛋白的可解离基团只有变性后才能完全滴定有些球蛋白的可解离基团只有变性后才能完全滴定没有盐类没有盐类干扰时的干扰时的等电点叫等电点叫等离子点等离子点蛋蛋白白质质分分子子的的颗颗粒粒直直径径已已达达1-100nm1-100nm，处处于于胶胶体体颗颗粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。2 2、蛋白质的胶体性质：、蛋白质的胶体性质：蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力透膜，具有吸附能力蛋白质溶液稳定的原因：蛋白质溶液稳定的原因：1 1）表面形成水膜（水）表面形成水膜（水化层）；化层）；2 2）带相同电荷。）带相同电荷。3)3)大小为大小为1-100nm1-100nm的胶体颗粒的胶体颗粒+蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。出来。蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用1.1.加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。析出。2.2.分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH50%(NH4 4)2 2SOSO4 4饱和度），清蛋白（饱和饱和度），清蛋白（饱和(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4)。2.2.加有机溶剂加有机溶剂3.3.加重金属盐加重金属盐4.4.加生物碱试剂加生物碱试剂 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂。沉淀生物碱，称生物碱试剂。在温和条件下，通过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的pHpH或电荷状况，或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和等电点沉淀法、盐析法和条件条件有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等。等。可逆沉淀可逆沉淀在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、常温有机溶剂、如加热沉淀、强酸碱沉淀、常温有机溶剂、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。逆沉淀。不可逆沉淀不可逆沉淀一、蛋白质在某些理化因素的作用下，其空间一、蛋白质在某些理化因素的作用下，其空间结构受到破坏，从而改变其理化性质，并失去结构受到破坏，从而改变其理化性质，并失去其生物活性，称为蛋白质的变性。其生物活性，称为蛋白质的变性。二、变性的实质是破坏了蛋白质的空间结构，二、变性的实质是破坏了蛋白质的空间结构，并不引起一级结构的改变。并不引起一级结构的改变。蛋白质的变性蛋白质的变性三、蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀，三、蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都变性后的蛋白质。但沉淀的蛋白质不一定都变性后的蛋白质。四四、加加热热使使蛋蛋白白质质变变性性并并凝凝聚聚成成块块状状称称为为凝凝固固。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。反应名称反应名称试试 剂剂颜色颜色反应有关基团反应有关基团有有此此反反应应的的蛋蛋白白质质或或氨氨基酸基酸双缩脲反应NaOH、CuSO2紫色或粉红色二个以上肽键所有蛋白质米伦反应HgNO3、Hg(NO3)2及 HNO3混合物红色Tyr黄色反应浓HNO3及NH3黄色、橘色Tyr、Phe乙醛酸反应(Hopking-Cole反应)乙醛酸试剂及浓H2SO4紫色Trp坂口反应(Sakaguchi反 应)-萘酚、NaClO红色胍基Arg酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应)碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸蓝色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反应茚三酮蓝色自由氨基及羧基-氨基酸4 4、蛋白质的颜色反应：鉴定蛋白质的量、蛋白质的颜色反应：鉴定蛋白质的量OHN大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在这三种氨基酸的在280nm 280nm 附近有最大吸附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在收。因此，大多数蛋白质在280nm 280nm 附近附近显示强的吸收。显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。鉴定。初步定量，若精细定量用考马斯亮蓝染初步定量，若精细定量用考马斯亮蓝染色色5 5、蛋白质的紫外吸收、蛋白质的紫外吸收分离纯化之前保证蛋白质一定的纯度分离纯化之前保证蛋白质一定的纯度依据：大小、形状、溶解度、酸碱性、吸依据：大小、形状、溶解度、酸碱性、吸附性及对配体的亲和性附性及对配体的亲和性若要研究蛋白质的功能则要求高级结构完若要研究蛋白质的功能则要求高级结构完整整难度大，迄今几百个蛋白质的单晶（单晶难度大，迄今几百个蛋白质的单晶（单晶的天然结构都没有发生变化）的天然结构都没有发生变化）蛋白质的分离与纯化方法蛋白质的分离与纯化方法（一）盐析与有机溶剂沉淀：（一）盐析与有机溶剂沉淀：盐溶盐溶1.1.盐析：盐析：在在蛋蛋白白质质溶溶液液中中加加入入大大量量中中性性盐盐，以以破破坏坏蛋蛋白白质质的的胶胶体体性性质质，使使蛋蛋白白质从溶液中沉淀析出，称为质从溶液中沉淀析出，称为盐析盐析。常用的中性盐有：常用的中性盐有：硫酸铵硫酸铵、氯化钠、硫、氯化钠、硫酸钠等。酸钠等。盐析时，溶液的盐析时，溶液的pHpH在蛋白质的等电点处在蛋白质的等电点处效果最好。效果最好。盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。质的变性。分段盐析：分段盐析：半半饱饱和和硫硫酸酸铵铵溶溶液液可可沉沉淀淀血血浆浆球球蛋蛋白白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。2.2.有机溶剂沉淀蛋白质：有机溶剂沉淀蛋白质：凡凡能能与与水水以以任任意意比比例例混混合合的的有有机机溶溶剂剂，如如乙乙醇醇、甲甲醇醇、丙丙酮酮等等，均均可可用用于于沉沉淀淀蛋白质。蛋白质。沉沉淀淀原原理理是是：脱脱水水作作用用；使使水水的的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。介电常数降低，蛋白质溶解度降低。（二）电泳：（二）电泳：带电粒子在电场中移动的现象称为带电粒子在电场中移动的现象称为电泳电泳（electrophoresis)electrophoresis)蛋蛋白白质质分分子子在在溶溶液液中中可可带带净净的的负负电电荷荷或或带带净净的的正正电电荷荷，故故可可在在电电场场中中发发生生移移动动。不不同同的的蛋蛋白白质质分分子子所所带带电电荷荷量量不不同同，且且分分子子大大小小也也不不同同，故故在在电电场场中中的的移移动动速速度度也也不不同同，据据此此可互相分离。可互相分离。电泳电泳蛋白质在等蛋白质在等电点电点pHpH条件条件下，不发生下，不发生电泳现象。电泳现象。利用蛋白质利用蛋白质的电泳现象，的电泳现象，可以将蛋白可以将蛋白质进行分离质进行分离纯化。纯化。1.1.自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。行电泳。2.2.区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。状区域。（1 1）纸上电泳：用滤纸作支持物。）纸上电泳：用滤纸作支持物。（2 2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。聚丙烯酰胺）作支持物。（3 3）双向电泳）双向电泳4 4）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。+5 5）平板电泳：铺有凝胶的玻板上）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。进行的电泳。-+两种凝胶电泳两种凝胶电泳等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。分离同工酶在电场中不再移动。分离同工酶+5.06.07.0稳定pH梯度5.06.07.0稳定pH梯度通电+SDSPAGESDSPAGE中中SDSSDS的作用：的作用：阴离子去污剂，变性，蛋白质伸展态阴离子去污剂，变性，蛋白质伸展态屏蔽蛋白质的电荷，都带负电荷屏蔽蛋白质的电荷，都带负电荷使得蛋白质的形状趋于一致使得蛋白质的形状趋于一致所以在这种特殊的电泳中，迁移所以在这种特殊的电泳中，迁移率与蛋白质电荷无关，与蛋白质率与蛋白质电荷无关，与蛋白质的形状无关，处决于蛋白质的大的形状无关，处决于蛋白质的大小（分子量）小（分子量）（三）层析：（三）层析：层层析析（chromatography)chromatography)是是一一种种利利用用混混合合物物中中各各组组分分理理化化性性质质的的差差异异，在在相相互互接接触触的的两两相相（固固定定相相与与流流动动相相）之之间间的的分分布布不不同同而进行分离分析的技术方法。而进行分离分析的技术方法。主主要要的的层层析析技技术术有有离离子子交交换换层层析析，凝凝胶胶层层析，吸附层析及析，吸附层析及亲和层析、亲和层析、HPLCHPLC等。等。凝胶过滤分离蛋白质凝胶过滤分离蛋白质（四）超速离心：（四）超速离心：利利用用物物质质密密度度的的不不同同，经经超超速速离离心心后后，分布于不同的液层而分离。分布于不同的液层而分离。超超速速离离心心也也可可用用来来测测定定蛋蛋白白质质的的分分子子量量，蛋白质的分子量与其沉降系数蛋白质的分子量与其沉降系数S S成正比。成正比。蛋白质相对分子量在蛋白质相对分子量在10 000-1 000 10 000-1 000 000000之间。测之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法超离心法、凝、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。最准确可靠的方法是最准确可靠的方法是超离心法超离心法（SvedbergSvedberg于于19401940年设计）：蛋白质颗粒在年设计）：蛋白质颗粒在25-50*1025-50*104 4 g g离心力作用离心力作用下从溶液中沉降下来。下从溶液中沉降下来。沉降系数（沉降系数（s s）：）：单位（单位（cmcm）离心场里的沉降速度。离心场里的沉降速度。s=v2x v v=沉降速度（沉降速度（dx/dtdx/dt）=离心机转子角速度（弧度离心机转子角速度（弧度/s/s）x x=蛋白质界面中点与转子中心的距离（蛋白质界面中点与转子中心的距离（cmcm）沉降系数的单位常用沉降系数的单位常用S S，1S=1101S=110-13-13（s s）蛋白质分子量（蛋白质分子量（M M）与）与沉降系数（沉降系数（s s）的关系的关系M=RTsD（1V）R气体常数（气体常数（8.314107ergsmol-1 度度-1）T绝对温度绝对温度D扩散常数（蛋白质分子量很大，离心扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机转速很快，则忽略不计）机转速很快，则忽略不计）V蛋白质的微分比容（蛋白质的微分比容（m3g-1）溶剂密度（溶剂密度（20，gml-1）s沉降系数沉降系数酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。酶促反应速率酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。酶促反应速率酶（活力）单位酶（活力）单位：在一定条件下，一定时间内将一：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。（定量的底物转化为产物所需的酶量。（U/gU/g，U/mlU/ml）在最适的反应条件（在最适的反应条件（2525）下，每分钟内催化一微摩）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即 1IU=1mol/min1IU=1mol/min在在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为需的酶量定为1kat1kat单位，即单位，即 1kat=1mol/s1kat=1mol/s1kat=6107IU蛋白质的表征蛋白质的表征酶的纯度酶的纯度：比活力比活力=活力单位数活力单位数/毫克蛋白（氮）毫克蛋白（氮）纯化倍数纯化倍数 =每次比活力每次比活力第一次比活力第一次比活力产率产率%（回收率）（回收率）=100=100每次总活力每次总活力第一次总活力第一次总活力酶的纯化鉴定酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法