基因转染技术及其应用简介-课件.ppt
基因转染技术及其应用简介基因转染技术及其应用简介报告人报告人:陈陈 红红 平平2006年年11月月安德鲁法尔和克雷格梅洛 报告内容报告内容n一、基因转染简介一、基因转染简介n二、基因转染的基本方法二、基因转染的基本方法n三、基因转染技术的应用三、基因转染技术的应用1.基因转染:将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。2.基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治疗研究。一、基因转染简介一、基因转染简介二、基因转染的基本方法二、基因转染的基本方法(一一)重组子构建重组子构建(二二)基因转染真核细胞的基本方法基因转染真核细胞的基本方法(1)目的基因目的基因 是所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因或基因的一个片段(2)目的基因常用的制备方法目的基因常用的制备方法 1.目的基因的制备和获取目的基因的制备和获取A.限制酶切除限制酶切除 a.从原核基因组DNA制备视原核基因组物理图谱已知或未知，克隆方法不同。b.从真核基因组从真核基因组DNA制备制备 c.从已克隆的从已克隆的DNA片段制备片段制备B.B.PCRPCR或或RT/PCRRT/PCR方法制备目的基因方法制备目的基因a.获取已知基因获取已知基因 据据已已发发表表的的基基因因序序列列（或或基基因因两两侧侧序序列列已已知知）设设计计/合合成成一一对对引引物物 PCRPCR（基基因因组组DNADNA为为模模板板）/RT-PCR(mRNA/RT-PCR(mRNA为为模模板板)从组织或细胞制备目的基因从组织或细胞制备目的基因b.b.构建构建RT/PCRRT/PCR文库法获取未知基因文库法获取未知基因 据据mRNAmRNA末末端端如如polyApolyA尾尾设设计计共共同同引引物物 将将所所用用mRNAmRNA并并逆逆转转录录成成cDNAcDNA利利用用工工具具酶酶在在cDNAcDNA末末端端加加尾尾 采采用用一一对对共共用用引引物物扩扩增所有增所有cDNAcDNA，插入适当载体，插入适当载体 构成构成PCRcDNA文库筛选文库筛选2.哺乳动物细胞哺乳动物细胞表达载体的选择表达载体的选择哺乳动物细胞表达载体有哺乳动物细胞表达载体有2大类：质粒型载体和病毒型载体大类：质粒型载体和病毒型载体（1）质粒型载体）质粒型载体 哺哺乳乳动动物物细细胞胞质质粒粒型型载载体体大大多多数数是是通通过过细细菌菌质质粒粒而而获获得得的的，主主要要是是在在质质粒粒的的基基础础上上插插入入了了一一些些病病毒毒或或其其他他一一些些物物种种及人的基因表达调控序列。及人的基因表达调控序列。A.典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作用元件典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作用元件:a.启动子启动子 b.增强子增强子 c.多聚腺苷酸化信号多聚腺苷酸化信号 d.药物选择标记基药物选择标记基e.报告基因报告基因 f.表位标签表位标签B.B.常用的哺乳动物表达质粒载体常用的哺乳动物表达质粒载体a.pcDNA3.la.pcDNA3.lb.pSIb.pSIc.pCMV-HAc.pCMV-HAd.pBudCE4.1d.pBudCE4.1e.pTREe.pTREB.腺病毒载体腺病毒载体 易于培养、纯化，在感染过程中复制与转易于培养、纯化，在感染过程中复制与转录依赖于宿主细胞的聚合酶，可插入较大的外录依赖于宿主细胞的聚合酶，可插入较大的外源基因片段，且腺病毒基因不会发生整合，是源基因片段，且腺病毒基因不会发生整合，是研究真核基因的良好模型。研究真核基因的良好模型。4.DNA重组体的鉴定重组体的鉴定 外外源源DNA片片断断是是否否插插入入载载体体构构成成重重组组DNA分分子子，而而插插入入片片断断大大小小，是是否否突突变变及及插插入入位位置置，顺顺序序及及方方向向则则关关系系到到构构建建载载体体是是否否扩扩增增，我我们们所所需需要要的的基因或表达，表达相应的产品，所以需要进一步鉴定基因或表达，表达相应的产品，所以需要进一步鉴定DNA重组体重组体（1）酶切鉴定是必需的，基于下述酶切鉴定是必需的，基于下述:A.限限制制性性图图谱谱个个体体特特异异性性，不不同同的的载载体体或或DNA分分子子物物理理图图谱谱不不同同，酶酶切切后片段大小不一样，电泳图谱不一样。后片段大小不一样，电泳图谱不一样。B.同同一一载载体体连连接接不不同同的的DNA片片断断，不不同同的的载载体体连连接接同同一一片片段段(片片段段上上也也有位点）酶切图谱是不同的有位点）酶切图谱是不同的。C.插插入入法法(单单酶酶单单切切点点)或或替替代代法法(双双酶酶双双位位点点)酶酶切切，一一般般来来说说用用3种种限限制酶切：制酶切：可可鉴鉴定定载载体体及及 插插入入片片段段的的大大小小,方方向向,切切后后并并电电泳泳分分析析,以以确确定定是是否否得得到预期的到预期的rDNArDNA。（2）若若构构建建DNA重重组组体体是是为为了了克克隆隆某某个个基基因因，可可进进行行在在序列测定。序列测定。（3）若构建表达载体，可进行表达产物鉴定。）若构建表达载体，可进行表达产物鉴定。1.1.化学转染法化学转染法 化化学学转转染染法法包包括括DEAEDEAE一一葡葡聚聚糖糖法法、磷磷酸酸钙钙法法和和人人工脂质体法等。工脂质体法等。目前应用最广泛的是人工质体法。目前应用最广泛的是人工质体法。1.DEAE-1.DEAE-葡聚糖葡聚糖 是是最最早早应应用用哺哺乳乳动动物物细细胞胞转转染染的的试试剂剂之之一一。DEAE-DEAE-葡葡聚聚糖糖是是阳阳离离子子多多聚聚体体,它它与与带带负负电电的的核核酸酸结结合合后后接接近近细细胞胞膜膜而而被被摄摄取取。DEAEDEAE一一葡葡聚聚糖糖转转染染已已成成功地应用于瞬时开始，但用于稳定转染却不可靠。功地应用于瞬时开始，但用于稳定转染却不可靠。2.2.磷酸钙共沉淀转染法磷酸钙共沉淀转染法 由由于于试试剂剂易易得得、价价格格便便宜宜而而被被广广泛泛用用于于瞬瞬时时转转染染和和稳稳定定染染的的研研究究。方方法法是是，先先将将DNADNA和和氯氯化化钙钙混混合合，然然后后加加人人到到PBSPBS中中慢慢慢慢形形成成DNADNA磷磷酸酸钙钙沉沉淀淀，后后把把含含有有沉沉淀淀的的混混悬悬液液加加到到培培养养的的细胞上，通过胞膜的内吞作用摄人细胞上，通过胞膜的内吞作用摄人DNADNA。3.3.人工脂质体法人工脂质体法 脂脂质质体体还还可可以以介介导导DNADNA和和RNARNA转转动动物物和和人人的的体体内内，用用于于基基因因治治疗疗。人人工工合合成成的的阳阳离离子子脂脂质质体体与与带带负负电电荷荷的的核核酸酸结结合合后后形形成成合合物物，当当复复合合物物接接近近细细胞胞膜膜时时被被内内吞吞成成为为内内体体进进入入细细胞胞质质，随后随后DNADNA复合物被释放进入细胞核内。复合物被释放进入细胞核内。2.2.物理方法物理方法 包括电穿孔、显微注射及基因枪等方法。包括电穿孔、显微注射及基因枪等方法。（1 1）电穿孔法）电穿孔法 利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转利于核酸进人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便地用于悬浮细胞，重现性染和稳定转染，可方便地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染效率的主要因好，但需要较多的细胞。影响转染效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核酸素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。（2 2）显微注射法）显微注射法 该该法法虽虽然然费费力力，但但却却是是非非常常有有效效的的将将核核酸酸导导人人细细胞胞或或细细胞胞核核的的方方法法。这这种种方方法法常常用用来来制制备备转转基基因因动动物物，但但不不适适用用于于需要大量转染细胞的研究。需要大量转染细胞的研究。（3 3）基因枪法）基因枪法 该该法法依依靠靠携携带带了了核核酸酸的的高高速速粒粒子子而而将将核核酸酸导导人人细细胞胞内内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。3.病毒感染法病毒感染法 病病毒毒颗颗粒粒是是一一类类十十分分有有效效的的基基因因释释放放系系统统，因因此此，它它是是将将外外源源基基因因导导人人大大量量细细胞胞最最有有效效的的方方法法。病病毒毒感感染染具具有有高高效效率率、可可稳稳定定遗遗传传、适适用用于于各各种种不不同同来来源源的的细细胞胞及及操操作作简简单单等等优优点点。但但多多数数病病毒毒有有其其潜潜在在的的危危险险性性，操操作作者者需需要要有有一一定定的的病病毒操作经验和良好的设施。毒操作经验和良好的设施。（1 1）逆转录病毒）逆转录病毒 （2 2）腺病毒）腺病毒（一）转基因植物（一）转基因植物1.转基因植物的发展简史转基因植物的发展简史2.转基因植物类型转基因植物类型1.转基因植物的发展简史转基因植物的发展简史（1）1983年，世界第一例转基因植物 烟草问世（2）19962005年，全世界转基因植物在21个国家种植，面积从1996年的170万公顷增加到2005年的9 000万公顷（3）全世界转基因作物仅种子销售额到2005年已达52.5亿美元，是1995年的63倍2.转基因植物类型转基因植物类型（1）抗除草剂基因）抗除草剂基因（2）抗虫基因）抗虫基因（3）抗病基因）抗病基因（4）抗逆境基因）抗逆境基因（5）改良品质基因）改良品质基因转基因动物疾病模型转基因动物疾病模型1.转基因动物与心血管疾病转基因动物与心血管疾病 a.与动脉粥样硬化和脂质代谢有关的如LDL受体转基因动物可增强LDL的清除；b.apoE3基因转基因鼠可增强LDL的清除，而突变的apoE则诱发高脂血症，apoE4与apoE7转基因鼠还出现学习与记忆能力降低、诱发肿瘤以及脾脏、肾脏肿大等。2.转基因动物与高血压转基因动物与高血压 与血压调控有关的如reninangiotensinogen转基因鼠模型出现高血压，用于研究RAS(reninangiotensinogen system)中各成分致高血压的作用以及相互关系3.转基因动物与乙型肝炎转基因动物与乙型肝炎 乙型肝炎是目前流行广泛、危害严重的病毒性传染病。由于一般实验动物对HBV不易感，目前发现能够感染HBV的动物只有灵长类，因此使得对HBV致病机理的研究很难用动物实验的方法来进行。HBV转基因小鼠的建立，为探讨HBV的致病机理提供了有价值的动物模型4.转基因动物与肿瘤研究转基因动物与肿瘤研究 转基因鼠肿瘤模型能很好地模拟体内的生理、病理环境，与所要研究肿瘤的发生过程具有较好的一致性，而且可模拟部分癌前病变。动物乳腺反应器动物乳腺反应器 是指利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达，并能从转基因动物乳汁中获取重组蛋白的一种生物反应器。特点：1.对转基因动物的影响小 2.产量大，产品易提纯，质量高 3.表达产物生物活性稳定 4.易于扩群，进行规模化生产 5.缩短新药上市周期 6.可以获取巨额经济利润（四）基因治疗（四）基因治疗 1.基因治疗基因治疗(gene therapy)是指将外源功能性目的基因导入病人体内，通过调控目的基囚表达，抑制、替代或补偿缺陷基囚，从而恢复细胞、组织或器官的生理功能，达到疾病治疗目的的一种方法 2.治疗方式：治疗方式：（1）基因直接注射法）基因直接注射法(in vivo)：即经静脉或肌肉直接将带存外源DNA的病毒、脂质体或裸露的DNA注入患者有关组织，使其进入相应的细胞并表达。（2）体外基因转移再回输体内的方法）体外基因转移再回输体内的方法(ex vivo)：即将患者的体细胞(如T淋巴细胞)取出在体外培养并导入外源目的基因后重新输回患者体内。3.基因治疗的策略基因治疗的策略（1）基因置换（2）基因补偿（3）基因失活（4）免疫基因治疗（5）活化前体药物基因治疗（6）耐药基因治疗（五）（五）RNAi技术技术The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006RNAi一、一、RNAi早期研究和理论形成早期研究和理论形成二、参与二、参与RNAi的重要分子的重要分子三、三、RNAi作用机制作用机制一一、RNAiRNAi早期研究和理论形成早期研究和理论形成 (一一)、RNAiRNAi早期研究早期研究 1、牵牛花实验 1990年，Arizona大学的Rich教授在转基因实验室将紫色素基因导入至矮牵牛花植物，目的是想通过增加紫色素基因拷贝获得具有更多的紫红色的矮牵牛。结果出乎意外，增加花瓣紫色的着色失败，一些转基因的花出现全白或部分白花，色素合成不是增加了，而是减少了，事实上，不仅导入的基因未被表达，反而植物本身的基因也失活或受到某种程度的限制。这种现象称为共共抑抑制制（cosuppression)现象。2.秀丽线虫实验秀丽线虫实验 1995年，Cornell大学Su Guo和Kemphues试图以反义RNA技术特异性地阻断秀丽线虫par-1基因的表达以研究其功能。发现，给线虫注射par-1的反义RNA时，如预期那样阻断了该基因的表达；但当给对照组注射正义RNA以期观察到该基因表达增强时，却发现par-1基因同样也被抑制了。3/29/202337山西医科大学生化教研室3.粗糙脉孢菌实验粗糙脉孢菌实验 1997年，意大利Cogoni等，将外源类胡萝卜素基因导入真菌粗糙脉孢菌（结果引起30%被转化的脉孢自身基因失活，转化细胞中内源性胡萝卜素基因也受到了抑制，这种基因失活形式 称 之 为抑抑 制制（quelling,基基 因因 压压 制制）。早期的三个实验，牵牛花实验和粗糙脉孢菌实验已经做出了有意义的结果，但都没有继续研究。其中以秀丽线虫实验有最有意义，因为在这个实验中给线虫注射了正义RNA和反义RNA，但就是没有注射二者结合起来的双连RNA。而RNAi理论形理论形成的形成正是基于后者。成的形成正是基于后者。（二）RNAi理论形成理论形成1.RNAi理论理论2.RNAi概念概念Discovery of RNAiDouble-stranded RNAinjectC.elegansNeg.control UninjectedAntisense RNA dsRNAsenseantisenseNature 1998,391:806-811Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridization 1.RNAi理论理论 1998年，Fire和Mello运用asRNA、sRNA及dsRNA进行研究，结果非常令人吃惊，在使相应的C.elegans基因沉默上，dsRNA 的抑制效能比单一的有义或反义均有效，诱导基因沉默的效率高10倍。少量的dsRNA处理线虫就能呈现基因沉默现象，该抑制现象还可传给第二代。2.RNAi概念 RNAi是指一些小的双链RNA序列导入机体或细胞中，机体或细胞中与之有同源序列的基因的表达将会受到高效特异的抑制或阻断（沉默），因为RNAi作用发生在转录后水平，所以又被称为转录后基因沉默转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)二二.参与参与RAN干扰的重要分子干扰的重要分子（一）Dicer酶（二）RISC（三）RdRP和mRNA（一）（一）Dicer酶酶 Dicer酶是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，促使dsRNA 裂解为小片段RNA 即短干扰RNA(short interference RNA，siRNA)的重要因子（二）（二）RISC 1.RISC：RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex,RISC）2.产生：在RNAi效应阶段，siRNA结合一个核酶复合物从而形成RISC。3.作用：激活的RISC在特定的位置切割mRNA。（三）（三）RdRP和和mRNARdRP：RNA 依赖性RNA 聚合酶(RNA dependent RNA polymerase），RNAi作用中的关键酶之一，它参与催化dsRNA 的生成与大量扩增。mRNA：被降解的mRNA 片段和未降解的完整mRNA 均可作为引物，在RdRP的作用下合成更多的dsRNA，新合成的dsRNA 进入下一轮的RNAi循环，从而对RNAi效应起放大作用三、三、RNAi作用机制作用机制
