微生物酶活性试验方法9653.pdf
-.z.微生物酶活性试验方法 脱氢酶活性 测定方法参考：【周春生,尹军.一脱氢酶活性检测方法的研究J.环境科学学报,1996,4:400-405.】以及【环境工程微生物检验手册M.中国环境科学,1990.】一试验方法：1 水样预处理：取污泥混合液 10ml，放入离心管中离心 5min 后去除上清液，用纯水反复清洗三次，最后向样品中参加纯水至 10ml 搅拌均匀。2加试剂：将处理后样品转移至 25ml 比色管中，依次参加 7.5mlTris-HCl 缓冲液 PH=8.4、2.5ml硫酸钠溶液 0.36%、2.5ml纯水以及2.5mlTTC 溶液 0.4%、混匀。3样品培养：将比色管置于 37条件下水浴恒温振荡器中培养，培养 5min后吸取 5ml 于离心管内，加 0.5ml 甲醛固定以作样品空白；4终止酶反响：继续培养 30min，然后向管中参加 2ml 甲醛终止酶反响；5样品萃取：将样品培养液以5.5ml为1份分装在四个离心管中，连同样品空白对照管一道离心5min,弃去上清液向各离心管内加6ml丙酮,研磨搅拌混合,于37条件下萃取TF10min后；6比色分析：将萃取液进展离心5min,用1cm的比色皿取上清液显色液,于波长485nm处进展比色,记录吸光值,根据样品显色液与样品空白的吸光值之差,查标准曲线,进而计算出TF的生成速度,即脱氢酶活性(mg/(L*h)二试剂：10.4三苯基四氮唑氯化物溶液氯化三苯基四氮唑，TTC:4g-2、3、5-氯化三苯基四氮唑，稀释至 1L 至容量瓶中，棕色瓶保存；-.z.2Tris-HCl 缓冲液：称取 6.057gTris三羟甲基氨基甲烷,分析纯,化学试剂厂，参加 20ml 1mol/LHCl 溶液,再定容至 1L；3硫酸钠溶液0.36%：3.6g硫酸钠Na2SO3稀释至1L容量瓶中；4TTC标准溶液：称取0.05gTTC定容与50ml茶色容量瓶中此溶液即为1mg/L的标准溶液。三标准曲线的绘制：1采用1mg/L的TTC标准溶液制备每含20、40、60、80、100、120、140gTTC系列溶液，即取1、2、3、4、5、6、7ml至50ml容量瓶中，稀释至50ml进展实验；2用8试管，分别参加2ml Tris-HCl缓冲液、2ml纯水、2ml不同浓度的TTC，第八只不参加TTC；3参加10g硫酸钠溶液，TTC被复原为红色的TF；4参加5ml丙酮振荡摇匀提取TF振荡床振荡10次；5离心5min后485nm下测吸光度；6吸光度为纵坐标，TTC浓度为横坐标绘制标准曲线。四计算：TF=A*B*C A：标准曲线上读数；B：计算时间矫正值：培养时间/60min；C 分光时的稀释倍数，当分光0,8 时，稀释分光 ATP 含量 测定方法参考：【环境工程微生物检验手册M.中国环境科学,1990.】ATP 消化后变为无机磷，制备 ATP 消化液，测无机磷吸光度以确定 ATP 含量-.z.一试验方法：1活性污泥稀释 1:20，曝气池稀释 1:10保证 ATP 量在之间；2用 50ml 烧杯参加 35ml 的pH=7.75 0.025M Tris 缓冲液加热至沸腾；然后参加待测活性污泥溶液 1ml，煮沸加热 30-60s 后摇动几分钟放入冰浴中，冷却后参加 pH7.75 0.025M 的 Tris 缓冲液至 50ml，摇匀过滤，所得过滤液供测ATP；3ATP制备液消化：去待测液1ml于比色管中，参加2.5ml10N硫酸，至于高压锅中加压128,15min，冷却后参加1-2滴过氧化氢，摇匀，纯水稀释，制成消化液；4取两支试管，参加消化液3ml，摇匀，另一只参加纯水3ml，各参加定磷试剂3ml，至于45水浴加热25min，冷却至室温，660nm下分光；5用上述曲线的吸光度在无机磷标准曲线上查出相应的无机磷含量，利用无机磷含量查Pi-ATP相关曲线，得出ATP值；ATP 含量高的污泥，微生物活性越高。二试剂：1无机磷溶液中间液：烘干后称取 0.2195g KH2PO4稀释至 500ml 容量品；2无机磷溶液使用液：上述溶液取 10ml 稀释至 100ml；3定磷试剂：6mol/L 硫酸：水：2.5%钼酸铵：10%抗坏血酸体积比=1：2:1:1，配置时按上述顺序参加试剂。溶液配制后当天使用，正常为浅黄绿色，假设颜色不正常，则不能使用 6mol/L 硫酸：取 17ml 浓硫酸参加 83ml 水中，得 6mol/L；2.5%钼酸铵：2.5g钼酸铵100ml 容量瓶；10%抗坏血酸：取 10g 抗坏血酸100ml 容量瓶棕色-.z.瓶冷藏。4ATP：10mgATP 5pH7.75 0.025M 的 Tris 缓冲液：3.02785g 稀释至 500ml+35ml 1mol/L 盐酸1000ml 容量瓶 610N 硫酸：271.7ml 浓硫酸参加 700ml 纯水中，冷却后，稀释至 1000ml容量瓶中；三标准曲线的绘制：1、无机磷标准曲线的绘制 1取KH2PO4置于烘箱中恒重后称取0.2195g，稀释至500ml容量瓶中，得无机磷浓度100ug/L；2取10ml上述溶液稀释至100ml容量瓶中定容，得无机磷浓度10ug/L，取6之试管；试管 无机磷 纯水 无机磷浓度 加定磷试剂 1 0 3 0 3 2 0.2 2.8 2 3 3 0.4 2.6 4 3 4 0.6 2.4 6 3 5 0.8 2.2 8 3 6 1.0 2.0 10 3 3将试管置于45中水浴，保温25min，冷却后660nm下比色；4以吸光度作为纵坐标，无机磷含量为横坐标，绘制标准曲线；2、ATP-无机磷曲线绘制；-.z.1称取10mgATP，取少量新配的pH7.75 0.025M的Tris缓冲液，充分摇匀溶解，定容至1L,最终浓度为10mg/L；取上清液，配置从系列标准液；2ATP标准液的消化：去待测液1ml于比色管中，参加2.5ml10N硫酸，至于高压锅中加压128,15min，冷却后参加1-2滴过氧化氢，摇匀，纯水稀释，制成消化液；3取两支试管，参加消化液3ml，摇匀，另一只参加纯水3ml，各参加定磷试剂3ml，至于45水浴加热25min，冷却至室温，660nm下分光；4以吸光度为纵坐标，ATP浓度为横坐标，绘制曲线；5用上述曲线的吸光度在无机磷标准曲线上查出相应的无机磷含量，然后作为纵坐标，ATP为横坐标，绘制Pi-ATP相关曲线。脲酶活性 测定方法参考：【李振高,骆永明,滕应.土壤与环境微生物研究法M.科学,2021.】根据脲酶水解时生成的氨与苯酚钠及次氯酸钠反响，形成兰色靛酚这一原理。一试验方法：1水样预处理：取 10ml 待测样品经甲苯处理后，加 510 滴甲苯，盖好；2加试剂：15min 后加 10ml 10%尿素和 20mlpH=6.7 柠檬酸盐缓冲液 3样品培养：将锥形瓶置于 37条件下恒温箱，培养 24h 过滤；4继续加试剂：取滤液 1-3mg/L视样品浓度定与 50ml 比色管中，参加4ml 苯酚钠溶液和 3ml 次氯酸钠溶液，边加边摇匀；5比色分析：20min后定容，并在578nm波长下分光；6计算：并在标准曲线上求氨氮的量，测出脲酶活性。每一土样设置用水代替基质 即尿素 的对照，以除掉土壤中氨态氮引起的误差？。-.z.还需减去无土基质尿素柠檬酸盐。二试剂：1甲苯分析纯；210%尿素：尿素分析纯10 克溶于 100 毫升蒸馏水中，现配现用；3PH6.7柠檬酸盐缓冲液：368克柠檬酸分析纯溶于600毫升蒸馏水中；295克氢氧化钾溶于水；将二种溶液合并，调pH至6.7，并用水稀释至2L；4苯酚钠溶液：A液：62.5 苯酚溶于少量 95%乙醇，加 2 毫升甲醇和 18.5 毫升丙酮，用乙醇稀释至 100 毫升。B 液.27 克氢氧化钠溶于 100 毫升水中。将二溶液保存在冰箱里。使用前，将溶液 A、B 各吸取 20 毫升混合，用蒸馏水稀释至 100 毫升；5次氯酸钠溶液：用蒸馏水稀释试剂，至活性氯浓度为 0.9%。次氯酸钠活性氯浓度为 5.2%。6标准溶液：称 0.4717 克硫酸铵105烘干溶于水，稀释至 1 升1 毫升含 100 微克氮即 100ppm。三标准曲线的绘制：1将 100ppm 的标准溶液稀释为 10ppm，分别吸取 0.5ml、1.5ml、2.5ml、3.5ml、4.5ml、5.5ml、6.5ml、7.5ml 于 50 毫升容量瓶或刻度试管中，加蒸馏水至 20ml；2再加 4ml 苯酚钠溶液和 3ml 次氯酸钠溶液，边加边摇匀，20min 后显色，定容，使溶液浓度为：0.1ppm、0.3ppm、0.5ppm、0.7ppm、0.9ppm、1.1ppm、1.3ppm、1.5ppm。31h 内在分光光度计上与波长 578nm 处比色，绘制标准曲线。-.z.四计算：脲酶活性以 24h 内每克土中氨态氮的毫克数来表示。NH3-Nmg/1g 土 24h=土样浓度稀释倍数比色体积1000干土重 1000：1000 为 ug 换算成 mg 土样浓度：标准曲线查得浓度 硝酸复原酶活性 测定方法参考：【李振高,骆永明,滕应.土壤与环境微生物研究法M.科学,2021.】原理：在厌氧条件下，通过样品与酚二磺酸的显色反响计算出反响前后硝态氮的含量差值，从而计算出硝酸复原酶的活性。一试验方法：取 10ml 待测样品与 50ml 三角瓶中，参加葡萄糖，硝酸钾溶液，在真空下培养24h 后，利用酚二磺酸分光光度计测定反响前后硝酸盐的含量差值，最后计算出硝酸复原酶活性 二试剂：亚硝酸复原酶活性 测定方法参考：【李振高,骆永明,滕应.土壤与环境微生物研究法M.科学,2021.】原理：通过亚硝态氮与格里试剂反响所产生的颜色深度，测定酶促反响前后亚硝态氮的变化，从而得出亚硝酸复原酶的活性。一试验方法：取 50ml 待测样品与 50ml 三角瓶中，参加葡萄糖，亚硝酸钠溶液，在真空下培养 24h 后，参加格里试剂显色，最后再波长 550nm 处测定反响前后的样品吸光-.z.度值，其差值可表示亚硝酸复原酶活性 硝化速率的测定方法 硝化强度的试验方法 一试验方法：1150ml 三角瓶中盛 30ml 硝酸细菌培养基，灭菌；2培养：冷却，接种 1ml 活性污泥溶液，于 28培养 15 天，取出过滤。滤液装于塑料瓶中，低温保存4 度以下，最好马上测下步。用比色法测定虑液中的亚硝酸含量。3加试剂：取滤液 1ml取决于虑液中亚硝酸量于 50ml 容量瓶中，定容。再取 1ml 定溶液于 50ml 比色管中，稀释至约 40ml，参加 1ml 对氨根本磺酸试剂，放置 10 分钟，然后参加 1ml萘胺试剂、1ml20醋酸钠，定容，呈色 10分钟后，用分光光度计波长 520nm比色测定。潮土亚硝酸含量较少，可在第一步就就加显色剂，定容测定。4 标准曲线的绘制：同时吸取亚硝酸根溶液 每毫升含 NO-20.01 毫克 0.5、1、2、3、4、5ml，分别放入 50ml 比色管中，即得 0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg 亚硝酸根，与待测标本同样条件进展比色，根据标准系列得透光度绘制标准曲线，查出待测标本中亚硝酸根毫克数。5与此同时，用同一方法测定原始培养液中亚硝酸根含量 二试剂：1硝酸细菌培养基：NaNO2 1.0 克 MgSO47 H2O 0.03 克-.z.K2HPO4 0.75 克 MnSO44 H2O 0.01 克 NaH2PO40.25 克 蒸馏水 1000 毫升 Na2CO31.0 克 2格利斯氏试剂：a对氨基苯磺酸试剂：溶解 0.6g 对氨基苯磺酸于 70ml 沸蒸馏水中，冷却后参加 20ml 浓盐酸，然后稀释成 100ml，贮于棕色瓶中，保存于冷处备用。b萘胺试剂：溶解 0.6g萘胺于含 1ml 浓盐酸的蒸馏水中，然后稀释至100ml，贮于棕色瓶中，保存于冷处备用。320醋酸钠 三标准曲线的绘制：亚硝酸根标准溶液：称取 1.500g 分析纯亚硝酸钠于烧杯中，加蒸馏水溶解后洗入 1000ml 量瓶中，再加蒸馏水至刻度，摇匀。此溶液中亚硝酸根浓度为1000ppm 即 1ml 含亚硝酸根 1mg。用时以此液配成稀的亚硝酸根标准溶液 每毫升含 NO-20.01mg。四计算：1NO-2N 毫克数/30 毫升活性污泥ppm比色体积稀释倍数10-3 式中 ppm由标准曲线查知；10-3换算为毫克。2根据下式计算活性污泥硝化作用强度：硝化作用原始培养基中 NO-2量-培养后培养基中 NO-2量100/原始培-.z.养基中 NO-2量 原始培养基中 NO-2量：1g/L
