qPCR实验操作流程21276.pdf
qPCR 实验操作流程 公司内部编号：（GOOD-TMMT-MMUT-UUPTY-UUYY-DTTI-Q-PCR实验流程 一、实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开 15-20 分钟。超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA 抽提需带口罩。取 EP 管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完 EP 管/枪头后，袋子及时封好。橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用 75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。二、总 RNA 抽提 1）细胞培养皿中细胞样品用 1*PBS 洗两次后，用 1ml 枪将 PBS 吸干净，加入 1ml Trizol（Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP 管中使细胞充分裂解，室温静置 5min；组织样品用液氮充分研磨，加入 1ml Trizol（Invitrogen）溶液，混匀，室温放置 5min 使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入 200l 氯仿，剧烈振荡混匀 30s，使水相和有机相充分接触，室温静置 3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3）4下，14,000g 离心 15min，可见分为三层，RNA 在上层水相，移至另一个新的 RNase free EP 管；（用 20-200ul 的枪吸取 上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀 RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒 6-8 次）（不应用振荡器混匀），室温静置 10min；5）4下，14,000g 离心 10min，收集 RNA 沉淀（如离心后仍不见 EP 管底部有沉淀，应将 EP 管放置在-80 度冰箱过夜，继续在4下，14,000g 离心 10min，收集 RNA 沉淀），去上清；6）用 75乙醇洗涤两次（12,000g 离心 5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒 EP 管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。7）视沉淀量加入适量 DEPC 水（至少 15ul）溶解沉淀。三、去基因组 使用 RNase-free 的 DNase?（Promega），按以下体系配置反应液，37消化 30min，65灭活 10min。RNA DNase?10 x buffer H2O(RNase free)RNasin 30 20 10 39.5 0.5 l l l l l 总体积 100 l 然后按以下步骤操作：1)加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置 5min，后14,000rpm，离心 15min，取上清。2)加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后 14,000rpm，离心 15min，取上清。3）加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒 6-8 次），-20静置 15min；4）4下，14,000g 离心 15min，收集 RNA 沉淀，去上清；5）用 75乙醇洗涤两次（12,000g 离心 5min），超净台风干；6）加入适量 DEPC 水（至少 15ul）溶解沉淀。四、总 RNA 纯度和完整性检测 1）纯度检测：取 1l RNA 样品 50 倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定 OD值，OD260/OD280的比值大于 1.8，说明制备的 RNA 较纯，无蛋白质污染。2）总 RNA 完整性检测：取 RNA 样品 1l，1琼脂糖凝胶电泳80V20min，EB 染色 10min，用凝胶成像系统观察并拍照，总 RNA 的5s rRNA，18s rRNA 和 28s rRNA 条带，三条条带完整的话即可证明总 RNA 抽提比较完整。五、逆转录 1.mRNA：1)在 RNase free 的 PCR 管中配置下列溶液.Total RNA H2O 1.0 g l 2)将上述溶液吹打均匀，置85保温 5min，使 RNA 变性。随后立即冰上致冷，以防止 RNA 复性；3)在该 PCR 管中加入下列试剂（Promega）oligo（dT）Random primer 10mM dNTP RNase inhibitor 5 x buffer M-MLV 0.5 0.5 2.0 0.5 4.0 0.5 l l l l l l 总体积 8.0 l 4)将上述 20l 反应溶液 30保温 10min；5)42保温 50min；6)85保温 10min；7)-20保存。2.microRNA：使用茎环逆转录法，原理如下图：1）在去 RNase 的 PCR 管中配置以下溶液.2）将上述溶液混匀，85孵育5min，以打开 RNA二级结构。随后立即置于冰上，以防止 RNA 复性再次恢复二级结构；3）在另一去 RNase 的 PCR 管中配置以下溶液：总体积 12 l total RNA X 个 miR 逆转录引物 H2O 1.0 0.5*X g l 总体积 12.5 l 10mM dNTP(promega)RNase inhibitor(promega)U6 逆转录引物 5x buffer M-MLV(promega)2.0 0.5 0.5 4.0 0.5 l l l l l 总体积 7.5 l 4）将 3）溶液加入到 1）溶液中，混匀后 30保温 10min；5）42孵育 50min；6）85孵育 10min 灭活逆转录酶。四、定量 PCR 检测 1.引物测试：根据 mRNA 设计的引物正式实验前需进行 qPCR 测试其特异性和扩增效率，具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性，选择标准为：单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。若设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好，则应对比各引物的扩增曲线，优先选择 Ct值小、扩增效率高的引物进行正式实验。2确定上机内容后，首先在记录本上编排好上机的样品排放顺序。（1）一个样品的加样尽可能安排在同一行（2）如正式实验中三次重复不能安排在同一板上，则需把三次重复中的实验分开，但同一次重复的实验不能分开两板 3正式实验：体系配制：H2O 4ul SYBR Green PCR Master Mix 10ul (TOYOBO)(使用前需振荡均匀)上游引物 0.5ul（10uM）下游引物 0.5ul（10uM）总体积 15ul 计算好实验中需用多少份体系，则按具体量配置。体系分装会有损失，一般多配 0.5 份-1 份体系。总的体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后 15ul每管分装至 8 连管中。3cDNA 用灭菌纯水稀释适当的浓度，一般为 1:20 稀释，如遇到基因表达低的样品，则适当降低稀释比例至 1:10 或 1:5。cDNA 按一定顺序排好后，即可加至刚配好的反应体系中。加样完毕，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上标记好 1-12 的顺序（不可将标记写在反应管的盖子上，八连管盖避免裸手触摸中间透明的荧光采集区域，且保证每孔均盖紧，否则影响重复性或可能出现熔解曲线峰漂移。）4把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。五上机：5.1 先开电脑，进入 Windows 界面。接着打开 PCR 仪电源开关。5.2 打开 7500 软件，选择“新建”，在“Template”下拉菜单中选择“60”或“65”（普通基因检测为“60”，MicroRNA 检测为“65”）5.3 打开样品架，放入八连管，关上样品架，并在软件上选择已放反应管的孔位，剔除无反应管的孔位。5.4 点击 File 菜单中 Save，输入要保存结果的文件名，命名为日期-上机时间-客户名字简写，如 100830-1008-WL 表示 8 月 30 日 10 点 08 分魏立的实验。5.5 点击 Start 键，开始运行程序。5.6 程序运行完毕后，取出样品架上的八连管，按顺序关闭 ABI PRISM 7500 SDS 软件、PCR 仪电源开关。5.7 在 7500 软件上标记好每个反应孔的样品名称及检测基因的名称，分类保存好结果文件。反应完成后，八连管应装到封口袋中，袋子上标记好文件名，客户的名字。（同一个客户的三次重复实验，则只需保存其中一次重复的反应管即可，其余可丢弃）
