实验八亲和层析分离纯化蛋白质.ppt

关于实验八亲和层析分离纯化蛋白质现在学习的是第1页，共34页 实验目的实验目的掌握掌握GST亲和层析分离纯化目标蛋白的亲和层析分离纯化目标蛋白的原理和实验方法（第一部分）原理和实验方法（第一部分）掌握掌握SDS-PAGE检测目标蛋白原理和检测目标蛋白原理和方法（第二部分）方法（第二部分）现在学习的是第2页，共34页第一部分第一部分 GST亲和层析分离纯化目标蛋白亲和层析分离纯化目标蛋白现在学习的是第3页，共34页 一、实验原理一、实验原理现在学习的是第4页，共34页亲和层析亲和层析 生物大分子与配体特异非共价可逆结合。生物大分子与配体特异非共价可逆结合。酶酶-底物或底物类似物底物或底物类似物抗体抗体-抗原抗原激素激素-受体受体外源凝集素外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体多糖、糖蛋白、细胞表面受体核酸核酸-互补核苷酸序列（互补核苷酸序列（Oligo-dT）现在学习的是第5页，共34页亲亲和和层层析析原原理理现在学习的是第6页，共34页GST亲合层析亲合层析 谷胱甘肽硫转移酶（谷胱甘肽硫转移酶（GST，26kd，与谷胱甘，与谷胱甘肽肽GSH特异结合）特异结合）GSH作为配体，共价结合在葡聚糖上，作为配体，共价结合在葡聚糖上，（Sepharose 4B）GST融合目标蛋白融合目标蛋白葡聚糖上的葡聚糖上的GSH与与GST融合蛋白结合融合蛋白结合用还原型用还原型GSH洗脱洗脱GST融合蛋白融合蛋白现在学习的是第7页，共34页GSH-Sepharose 4B现在学习的是第8页，共34页GSH-Sepharose 4B现在学习的是第9页，共34页现在学习的是第10页，共34页现在学习的是第11页，共34页外源蛋白的表达和纯化外源蛋白的表达和纯化现在学习的是第12页，共34页 二、实验步骤二、实验步骤现在学习的是第13页，共34页现在学习的是第14页，共34页 （一）目标蛋白诱导表达和菌体收集（一）目标蛋白诱导表达和菌体收集 10.5 mmol/L IPTG诱导大肠杆菌中的蛋白表诱导大肠杆菌中的蛋白表达，达，28，200 rpm培养培养3-6 h。25000 rpm离心离心5 min，倒掉上清。，倒掉上清。3沉淀加沉淀加40 ml水，水，5000 rpm离心离心5 min。现在学习的是第15页，共34页（二）细胞破碎（二）细胞破碎1倒掉上清，加倒掉上清，加30 ml PBS缓冲液悬浮菌体。缓冲液悬浮菌体。2破碎菌体，超声波破碎菌体，超声波2 min，停止，停止1 min。（菌液始终保持在冰浴中）（菌液始终保持在冰浴中）3重复重复8-10遍，直至菌液清澈。遍，直至菌液清澈。现在学习的是第16页，共34页（三）离心（三）离心1每个小组分取每个小组分取1-2 ml细胞破碎液，细胞破碎液，12000 rpm，离心，离心5 min。2分取分取50 uL上清液，上清液，4保存。保存。3其余的上清液准备过其余的上清液准备过GST柱子。柱子。现在学习的是第17页，共34页（四）装（四）装GST柱子柱子1清洗和装好层析柱，封闭出口。清洗和装好层析柱，封闭出口。2加入加入2 mL PBS。3用滴管取用滴管取0.5-1 ml GST填料，加入柱子中。填料，加入柱子中。4打开柱子出口，使打开柱子出口，使PBS缓慢流出。缓慢流出。注意：始终保持柱内的液面高于注意：始终保持柱内的液面高于GST树脂。树脂。现在学习的是第18页，共34页（五）纯化目的蛋白（五）纯化目的蛋白1用用5 ml PBS缓冲液洗柱床，重复缓冲液洗柱床，重复3遍。遍。2将混合蛋白质溶液加到柱子中。将混合蛋白质溶液加到柱子中。3用用5 ml PBS缓冲液洗柱子，重复缓冲液洗柱子，重复3遍。遍。4加入加入1ml 洗脱液。洗脱液。现在学习的是第19页，共34页5用离心管收集洗脱液，每管收集用离心管收集洗脱液，每管收集0.2ml。6PBS 缓冲液洗柱子缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。遍，关闭出口。7用分光光度计测定每一管的吸光度值，用分光光度计测定每一管的吸光度值，记录读数，绘制洗脱曲线。记录读数，绘制洗脱曲线。8将读数最大的一管用于将读数最大的一管用于SDS-PAGE分析。分析。现在学习的是第20页，共34页第二部分第二部分SDS-PAGE检测目标蛋白检测目标蛋白现在学习的是第21页，共34页 一、实验原理一、实验原理现在学习的是第22页，共34页蛋白质与蛋白质与SDS按按1：1.4比例形成复合物，消比例形成复合物，消除了蛋白质间原有的电荷差异。除了蛋白质间原有的电荷差异。蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在15-200 KD之间，迁移率和分子量的对数呈之间，迁移率和分子量的对数呈线性关系：线性关系：log MW=K-bm现在学习的是第23页，共34页现在学习的是第24页，共34页浓缩胶浓缩胶浓缩胶浓缩胶pH6.8，Gly pI6.0，三类离子在电场，三类离子在电场中的迁移速度：中的迁移速度：Cl-蛋白质蛋白质Gly-。电泳时，电泳时，Cl-快，快，Gly-慢，在快慢离子间形慢，在快慢离子间形成了一个低离子浓度的高压区，区内的蛋成了一个低离子浓度的高压区，区内的蛋白质加速移动。白质加速移动。当蛋白质移到当蛋白质移到Cl-区时，高电压消失，蛋白区时，高电压消失，蛋白质的移动速度减慢，在快慢离子间被浓缩。质的移动速度减慢，在快慢离子间被浓缩。现在学习的是第25页，共34页二、实验步骤二、实验步骤1洗净玻璃板，用蒸馏水冲洗干净后吹干，洗净玻璃板，用蒸馏水冲洗干净后吹干，安装制胶器。安装制胶器。2根据下列配方制作根据下列配方制作12%分离胶。分离胶。现在学习的是第26页，共34页12%分离胶分离胶试剂名称试剂名称12%分离胶分离胶蒸馏水蒸馏水2.5 ml30%丙丙烯酰烯酰胺（胺（29:1）3.0 ml1.5M Tris-HCl（pH8.8）2.0 ml10%SDS75 ul四甲基乙二四甲基乙二铵铵（TEMED）10 ul10%过过硫酸硫酸铵铵（AP）75 ul总总体体积积7.5 ml现在学习的是第27页，共34页按上表中所列顺序加试剂，加完按上表中所列顺序加试剂，加完AP后轻轻后轻轻摇匀，迅速加入两块玻璃板间。摇匀，迅速加入两块玻璃板间。在分离胶液面上缓慢滴加在分离胶液面上缓慢滴加1 mL蒸馏水，聚蒸馏水，聚合合15 min，至分离胶与水之间出现一条清，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倒掉水层，用滤纸条吸干残亮的分界线，倒掉水层，用滤纸条吸干残余的水。余的水。现在学习的是第28页，共34页试剂名称试剂名称5.0%蒸馏水蒸馏水1.7 ml30%丙丙烯酰烯酰胺（胺（29:1）430 ul1M Tris-HCl（pH6.8）310 ul10%SDS25 ul四甲基乙二四甲基乙二铵铵（TEMED）10 ul10%过过硫酸硫酸铵铵（AP）25 ul总总体体积积2.5 ml3制作制作5.0%浓缩胶浓缩胶 按照下表配好浓缩胶，轻轻混匀，灌胶按照下表配好浓缩胶，轻轻混匀，灌胶2ml，插，插入梳子，聚合入梳子，聚合15 min。现在学习的是第29页，共34页4把胶板放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，把胶板放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，拔掉梳子，电极缓冲液应该完全没过电极。拔掉梳子，电极缓冲液应该完全没过电极。5每个点样孔加每个点样孔加30ul样品，每板胶加样品，每板胶加10ul Marker。650V电泳电泳20min，等蛋白进入分离胶后，将，等蛋白进入分离胶后，将电压调节到电压调节到80V，电泳，电泳2-3h。7等到溴酚蓝接近胶底部时，关闭电源。等到溴酚蓝接近胶底部时，关闭电源。现在学习的是第30页，共34页8撬开玻璃板，将凝胶放在塑料盒内，撬开玻璃板，将凝胶放在塑料盒内，加入染色液，染色加入染色液，染色30min。9染色后的凝胶用蒸馏水漂洗，用脱色液染色后的凝胶用蒸馏水漂洗，用脱色液脱色。（或用蒸馏水加热脱色）脱色。（或用蒸馏水加热脱色）现在学习的是第31页，共34页pGEX-4T-3 纤维素酶的纯化纤维素酶的纯化非诱导非诱导诱导诱导纯化纯化1 纯化纯化2 Marker100KD75KD50KD32KD25KD15KD37，OD=0.8，0.5mmol/L，IPTG，28，200rpm，6h现在学习的是第32页，共34页SDS-PAGE样品制备样品制备 1号样，过亲和层析柱前的蛋白质溶液号样，过亲和层析柱前的蛋白质溶液25uL，加加5uL 5X上上 样缓冲液。样缓冲液。2号样，分离纯化后的蛋白质溶液号样，分离纯化后的蛋白质溶液25uL，加加5uL 5X上样缓冲液上样缓冲液 3号样，蛋白质分子量标准，老师准备。号样，蛋白质分子量标准，老师准备。现在学习的是第33页，共34页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第34页，共34页