免疫学检测技术及应用讲稿.ppt

关于免疫学检测技术及应用第一页，讲稿共八十八页哦免疫学检测技术应用：免疫学检测技术应用：1.1.疾病的诊断、治疗效果评价及发病疾病的诊断、治疗效果评价及发病机理探讨：机理探讨：如：感染性疾病、免疫缺陷病、超敏如：感染性疾病、免疫缺陷病、超敏反应、自身免疫病、免疫增殖病、移植排反应、自身免疫病、免疫增殖病、移植排斥反应、肿瘤等斥反应、肿瘤等 2.2.免疫分子的定性、定量测定：免疫分子的定性、定量测定：如：细胞因子、粘附分子、细胞受体、如：细胞因子、粘附分子、细胞受体、补体、抗体等补体、抗体等第二页，讲稿共八十八页哦 3.3.抗原物质的定性、定量检测：抗原物质的定性、定量检测：如：病原微生物及其代谢产物，组织细如：病原微生物及其代谢产物，组织细胞、蛋白质等胞、蛋白质等 4.4.免疫细胞的分离、鉴定及功能测定：免疫细胞的分离、鉴定及功能测定：如：如：T T细胞及其亚群等细胞及其亚群等第三页，讲稿共八十八页哦抗原抗体反应抗原抗体反应抗原与相应抗体在体内或体外相遇可发生抗原与相应抗体在体内或体外相遇可发生特异性结合，呈现的某种反应现象。特异性结合，呈现的某种反应现象。第四页，讲稿共八十八页哦抗原抗体反应有以下几个特点抗原抗体反应有以下几个特点:1.1.抗原与抗体结合是特异性结合抗原与抗体结合是特异性结合 表位表位(抗原抗原)超变区超变区(抗体抗体)2.2.抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合 氢键、疏水键、静电引力和范德华力氢键、疏水键、静电引力和范德华力(Van der waal(Van der waals force)s force)、电子云力的合、电子云力的合力。力。抗原和抗体可解离抗原和抗体可解离,性质不变。性质不变。第五页，讲稿共八十八页哦 3.3.抗原抗体反应可分为两个阶段抗原抗体反应可分为两个阶段 （1 1）特异性结合阶段）特异性结合阶段 此阶段需时短此阶段需时短,仅需几秒到几分钟仅需几秒到几分钟,无可见无可见 反应出现反应出现 （2 2）可见反应阶段）可见反应阶段 需时较长需时较长,数分数分,数小时或数日出现可见现数小时或数日出现可见现 象象,表现为沉淀表现为沉淀,凝集凝集,细胞溶解等细胞溶解等 4.4.抗原和抗体结合是否呈现明显可见的反应现抗原和抗体结合是否呈现明显可见的反应现 象象,与两者的分子比例密切相关与两者的分子比例密切相关 第六页，讲稿共八十八页哦第七页，讲稿共八十八页哦抗原抗体反应的主要影响因素抗原抗体反应的主要影响因素：1.1.电解质电解质:在中性或碱性条件下在中性或碱性条件下,抗原抗体均带负电抗原抗体均带负电荷荷,适当浓度的电解质会使它们失去一部适当浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷而互相结合分负电荷而互相结合,出现明显的沉淀或凝出现明显的沉淀或凝集现象。集现象。2.2.温度温度:37:37 3.酸碱度酸碱度:pH6-8第八页，讲稿共八十八页哦抗原抗体反应包括：抗原抗体反应包括：沉淀反应沉淀反应 凝集反应凝集反应 溶解反应溶解反应 补体结合反应补体结合反应 中和反应中和反应 已知抗体已知抗体 检测未知抗原；检测未知抗原；已知抗原已知抗原 检测未知抗体。检测未知抗体。第九页，讲稿共八十八页哦Sensitivity of varior immunoassaysSensitivity of varior immunoassays第十页，讲稿共八十八页哦一、沉淀反应一、沉淀反应(precipitation)(precipitation)可溶性抗原与相应抗体在电解质存在可溶性抗原与相应抗体在电解质存在条件下结合，出现沉淀物的现象。条件下结合，出现沉淀物的现象。沉淀反应的试验方法：环状法沉淀反应的试验方法：环状法 絮状法絮状法 琼脂中沉淀法琼脂中沉淀法 第十一页，讲稿共八十八页哦琼脂中沉淀反应法：琼脂中沉淀反应法：双向免疫扩散双向免疫扩散(double immunodiffusion)(double immunodiffusion)单向免疫扩散单向免疫扩散(single radial(single radial immunodiffusion)immunodiffusion)对流免疫电泳对流免疫电泳(counter(counter immunoelectrophoresis)immunoelectrophoresis)火箭电泳火箭电泳(rocket electrophoresis)(rocket electrophoresis)免疫电泳免疫电泳(immunoelectrophoresis)(immunoelectrophoresis)第十二页，讲稿共八十八页哦第十三页，讲稿共八十八页哦二、凝集反应二、凝集反应(agglutination)(agglutination)颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶性抗颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶性抗原原(或抗体或抗体)于相应抗体于相应抗体(或抗原或抗原)，在电解质，在电解质存在下出现凝集物的现象。存在下出现凝集物的现象。第十四页，讲稿共八十八页哦凝集反应包括：凝集反应包括：直接凝集反应直接凝集反应 (direct agglutination)间接间接(被动被动)凝集反应凝集反应(indirect/passive agglutination)间接凝集抑制试验间接凝集抑制试验(indirect agglutination inhibition test)协同凝集试验协同凝集试验(coagglutination test)抗球蛋白试验抗球蛋白试验(antiglobulin test，Coombs test)第十五页，讲稿共八十八页哦第十六页，讲稿共八十八页哦三三.免疫标记技术免疫标记技术 用荧光素、同位素、酶及发光等示踪物质用荧光素、同位素、酶及发光等示踪物质标记抗体标记抗体(或抗原或抗原)，与抗原，与抗原(或抗体或抗体)进行反应，进行反应，通过检测示踪物质，分析被检抗原通过检测示踪物质，分析被检抗原(或抗体或抗体)的的存在或含量的方法。存在或含量的方法。灵敏度：高，灵敏度：高，1X101X10-4-4 1X101X10-5-5ugug抗体抗体/ml/ml 应用：微量物质的定性、定量或定位。应用：微量物质的定性、定量或定位。第十七页，讲稿共八十八页哦免疫标记技术的基本类型：免疫标记技术的基本类型：（一）免疫荧光技术（一）免疫荧光技术(immunofluorescence technique)（二）免疫酶技术（二）免疫酶技术(immunoenzymatic technique)（三）同位素标记技术（三）同位素标记技术(isotope labelling technique)（四）发光免疫测定（四）发光免疫测定(luminescent immuno-(luminescent immuno-assay,LIA)assay,LIA)（五）免疫胶体金标记技术（五）免疫胶体金标记技术(colloidal gold(colloidal gold immunogold staining)immunogold staining)第十八页，讲稿共八十八页哦（一）免疫荧光技术（一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技术又称荧光抗体技术)原理：用荧光素原理：用荧光素(如异硫氰酸荧光素、罗如异硫氰酸荧光素、罗丹明丹明B200B200等等)标记抗体标记抗体(荧光抗体荧光抗体)，用荧光抗，用荧光抗体浸染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体结合，体浸染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体结合，于荧光显微镜下观察荧光，确定被检抗原的存于荧光显微镜下观察荧光，确定被检抗原的存在。在。免疫荧光技术包括：免疫荧光技术包括：直接法直接法 间接法间接法 间接补体增强法间接补体增强法 第十九页，讲稿共八十八页哦Direct and indirect immunofluore-scence staining of membrane antigen(mAg).第二十页，讲稿共八十八页哦（二）免疫酶技术（二）免疫酶技术(immunoenzymatic(immunoenzymatic techniques)techniques)是将抗原抗体反应与酶催化底物的作用是将抗原抗体反应与酶催化底物的作用相结合的一种方法。相结合的一种方法。主要有两种类型：主要有两种类型：1.1.免疫酶染色免疫酶染色 2.2.酶免疫测定（酶免疫测定（enzyme immunoassay,enzyme immunoassay,EIA EIA）第二十一页，讲稿共八十八页哦1.免疫酶染色免疫酶染色(又称免疫组化技术又称免疫组化技术,immunohistochemistry technique)immunohistochemistry technique)原理：用酶原理：用酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶等)标记抗体标记抗体(酶标抗体酶标抗体)，将酶标抗体与，将酶标抗体与抗原抗原(细胞或组织切片细胞或组织切片)作用，抗原与酶标记作用，抗原与酶标记抗体结合，加底物，酶催化底物产生有色抗体结合，加底物，酶催化底物产生有色物质，观察结果。物质，观察结果。应用：细胞内、组织内抗原的定性、应用：细胞内、组织内抗原的定性、定量和定位检测。定量和定位检测。第二十二页，讲稿共八十八页哦2.2.酶免疫测定酶免疫测定 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(enzyme linked(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)immunosorbent assay,ELISA)原理：原理：将抗原将抗原(或抗体或抗体)结合于固相载体；结合于固相载体；与抗体与抗体(或抗原或抗原)反应；反应；加酶底物，酶促反加酶底物，酶促反应。应。灵敏度：灵敏度：2X102X10-5-5 ggmlml 应用：广泛，可检测微量抗体和抗原应用：广泛，可检测微量抗体和抗原(如微如微生物成分、激素、细胞因子、粘附分子等）。生物成分、激素、细胞因子、粘附分子等）。第二十三页，讲稿共八十八页哦 ELISAELISA法：法：直接法直接法 间接法间接法 双抗体夹心法双抗体夹心法(双位点法双位点法)竞争法竞争法第二十四页，讲稿共八十八页哦ELISA第二十五页，讲稿共八十八页哦(三三)同位素标记技术同位素标记技术(isotope-labelling technique)放射免疫分析放射免疫分析(radioimmunoassay,(radioimmunoassay,RIA)RIA)是一种用放射性同位素分析抗原抗体反应是一种用放射性同位素分析抗原抗体反应相结合方法。相结合方法。优点：灵敏度高优点：灵敏度高,可检测可检测0.001pg0.001pgmLmL 特异性强特异性强 应用：微量抗原和抗体检测。应用：微量抗原和抗体检测。缺点：不稳定，废物处理麻烦等。缺点：不稳定，废物处理麻烦等。第二十六页，讲稿共八十八页哦（四）发光免疫分析（四）发光免疫分析(luminescent immuno-(luminescent immuno-assay,LIA)assay,LIA)原理：用发光物质标记抗体原理：用发光物质标记抗体(或抗原或抗原),),再同再同抗原抗原(或抗体或抗体)进行反应，以发光现象作为抗原进行反应，以发光现象作为抗原抗体反应的指示系统。抗体反应的指示系统。应用：定量检测抗原、抗体。应用：定量检测抗原、抗体。发光分为：化学发光发光分为：化学发光(chemiluminescence)(chemiluminescence)生物发光（生物发光（bioluminescencebioluminescence）第二十七页，讲稿共八十八页哦化学发光原理：化学发光原理：发光物质发光物质 激发态分子激发态分子 基态分子基态分子 释放光子释放光子(发光发光)化学发光剂：鲁米诺（化学发光剂：鲁米诺（luminol luminol）反应剂：过氧化阴离子反应剂：过氧化阴离子反应剂反应剂反应剂反应剂第二十八页，讲稿共八十八页哦（五）免疫胶体金技术（五）免疫胶体金技术(colloidal gold(colloidal goldimmunogold staining)immunogold staining)原理：胶体金标记蛋白质原理：胶体金标记蛋白质(如抗体如抗体)+)+组组织细胞织细胞(待测待测)观察结果观察结果(用电镜、光镜用电镜、光镜或肉眼或肉眼)应用：免疫组织化学定位，测定细胞表应用：免疫组织化学定位，测定细胞表面标志和细胞内成分。面标志和细胞内成分。优点：易行、省时、价廉、灵敏度高。优点：易行、省时、价廉、灵敏度高。胶体金：用还原法将四氯金酸胶体金：用还原法将四氯金酸(HAuCl(HAuCl4 4)制制成特定大小的金颗粒，该颗粒由于静电作用成特定大小的金颗粒，该颗粒由于静电作用呈稳定的胶体状态，称为胶体金。呈稳定的胶体状态，称为胶体金。第二十九页，讲稿共八十八页哦淋巴细胞的检测技术淋巴细胞的检测技术一一.淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离 1.1.外周血单个核细胞外周血单个核细胞(淋巴细胞淋巴细胞 90%)90%)的分离的分离 密度梯度离心法密度梯度离心法 (密度为密度为1.077)1.077)(2000rpm,15min)(2000rpm,15min)第三十页，讲稿共八十八页哦2.2.尼龙纤维分离法：尼龙纤维分离法：单个核细胞单个核细胞 通过通过尼龙纤维柱尼龙纤维柱 B B细胞和单核细胞细胞和单核细胞(粘附特性粘附特性)T T细胞细胞(非粘附性非粘附性)。3.3.流式细胞术（流式细胞术（flow cytometry,FCMflow cytometry,FCM）：）：荧光素标记抗体待检细胞荧光素标记抗体待检细胞单列经过单列经过FACSFACS分离（荧光素不同）的细胞分离（荧光素不同）的细胞 *FACS *FACS：荧光激活细胞分类仪：荧光激活细胞分类仪(fluore-(fluore-scent activated cell sorter)scent activated cell sorter)第三十一页，讲稿共八十八页哦流式细胞仪流式细胞仪第三十二页，讲稿共八十八页哦第三十三页，讲稿共八十八页哦4.4.磁珠分离术磁珠分离术：(1)(1)直接法：直接法：免疫磁珠免疫磁珠(磁性微粒结合抗体磁性微粒结合抗体)+)+细胞细胞 通过磁场通过磁场 分离分离磁珠结合磁珠结合细胞细胞 +解离剂解离剂 获纯化细胞获纯化细胞 (2)(2)间接法：间接法：免疫磁珠免疫磁珠(磁性微粒结合第二抗体磁性微粒结合第二抗体)+)+细细胞胞+抗体抗体 通过通过磁场磁场 分离磁珠结合分离磁珠结合细胞细胞+解离剂解离剂 获纯化细胞获纯化细胞 第三十四页，讲稿共八十八页哦第三十五页，讲稿共八十八页哦 淋巴细胞的功能测定技术淋巴细胞的功能测定技术（一）体外法（一）体外法 1 1淋巴细胞增殖检测淋巴细胞增殖检测3 3H-H-胸腺嘧啶核苷参入法（胸腺嘧啶核苷参入法（3H-TdR3H-TdR）:间接观察间接观察DNADNA合成合成含量。灵敏度高，具有放射性。含量。灵敏度高，具有放射性。四甲基偶氮唑盐法（四甲基偶氮唑盐法（MTTMTT）:MTT MTT商品名为噻唑蓝。原商品名为噻唑蓝。原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将外源性理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将外源性MTTMTT还原成蓝紫色结晶还原成蓝紫色结晶-甲瓒（甲瓒（formazanformazan）,DMSO,DMSO使其溶解，使其溶解，酶标分析仪检测。简便，灵敏度高，稳定性差。酶标分析仪检测。简便，灵敏度高，稳定性差。第三十六页，讲稿共八十八页哦二甲氧唑黄比色法（二甲氧唑黄比色法（XTTXTT）：）：XTTXTT是一种是一种MTTMTT类似的四唑氮衍生物，活细胞将其还类似的四唑氮衍生物，活细胞将其还原成橘黄色甲瓒产物，水溶性，可直接酶原成橘黄色甲瓒产物，水溶性，可直接酶标仪测定。加上电子耦合剂硫酸酚嗪甲酯标仪测定。加上电子耦合剂硫酸酚嗪甲酯（PMSPMS）可提高其效率。快速、简便灵敏。）可提高其效率。快速、简便灵敏。XTTXTT水溶液不稳定，现用现配，稳定性差。水溶液不稳定，现用现配，稳定性差。第三十七页，讲稿共八十八页哦四唑单钠盐法（四唑单钠盐法（WST-1WST-1）:WAT-1WAT-1是一种类似于是一种类似于MTTMTT的的水溶性四唑盐，在水溶性四唑盐，在PMSPMS存在下被活细胞脱氢酶还原成橙黄存在下被活细胞脱氢酶还原成橙黄色甲瓒产物，水溶性，直接酶标仪测定。色甲瓒产物，水溶性，直接酶标仪测定。WAT-1WAT-1的水溶液的水溶液比比MTT MTT 和和XTTXTT稳定。结果稳定，灵敏度高。可多次用酶稳定。结果稳定，灵敏度高。可多次用酶标仪重复检测结果。标仪重复检测结果。Cell-Counting Kit-8Cell-Counting Kit-8（CCK-8CCK-8）:CCK-8 CCK-8中含有中含有WST-8WST-8，较较WST-1WST-1更新的四唑盐，检测原理与更新的四唑盐，检测原理与WST-1WST-1类似。类似。操作更简便，检测结果更稳定、溶解性更高、灵敏操作更简便，检测结果更稳定、溶解性更高、灵敏度更高、保存时间更长。度更高、保存时间更长。第三十八页，讲稿共八十八页哦（放射性核素摄取法）（放射性核素摄取法）（放射性核素摄取法）（放射性核素摄取法）第三十九页，讲稿共八十八页哦2.2.细胞毒试验细胞毒试验(1)NK(1)NK细胞的细胞毒活性测定细胞的细胞毒活性测定 放射性核素释放法放射性核素释放法 放射性核素标记靶细胞放射性核素标记靶细胞(K562(K562细胞细胞)+)+效应细胞效应细胞 培养培养 靶细胞破坏，释放放射性核素靶细胞破坏，释放放射性核素 测测cpmcpm值值 NKNK细胞毒活性细胞毒活性(%)=(%)=100%100%实验孔实验孔cpmcpm值值-自然释放孔自然释放孔cpmcpm值值最大释放孔最大释放孔cpmcpm值值-自然释放孔自然释放孔cpmcpm值值第四十页，讲稿共八十八页哦 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(LDH)(LDH)释放法释放法 靶细胞靶细胞(YAC-1(YAC-1细胞细胞)+效应细胞效应细胞(小鼠脾胞小鼠脾胞)LDHLDH释放释放+LDH+LDH底物底物(氧化型辅酶氧化型辅酶I I、吩嗪二甲酯硫酸、吩嗪二甲酯硫酸盐和硝基氯化四氮唑蓝盐和硝基氯化四氮唑蓝)形成甲基化合物形成甲基化合物(色色)测定测定ODOD570570值值 NK NK细胞毒活性细胞毒活性(%)=(%)=100%100%实验孔实验孔ODOD值值-自然释放孔自然释放孔ODOD值值最大释放孔最大释放孔ODOD值值-自然释放孔自然释放孔ODOD值值第四十一页，讲稿共八十八页哦 Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity(ADCC）第四十二页，讲稿共八十八页哦第四十三页，讲稿共八十八页哦Generation of effector CTLs第四十四页，讲稿共八十八页哦MHC tetramers第四十五页，讲稿共八十八页哦Two pathways of target-cell apoptosis stimulated by CTLs第四十六页，讲稿共八十八页哦 In vitro cell-mediated lympholysis(CML)assay第四十七页，讲稿共八十八页哦3.3.酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法(ELISPOT)(ELISPOT)抗原包被抗原包被 B B细胞细胞 抗体产生并附着抗体产生并附着 第第二抗体二抗体(酶标记酶标记)底物底物 显色显色 抗体抗体(抗细胞因子抗细胞因子)包被包被 +T+T细胞细胞 产生细产生细胞因子并与抗体结合胞因子并与抗体结合 +第二抗体第二抗体(酶标记酶标记)底底物物 显色显色第四十八页，讲稿共八十八页哦第四十九页，讲稿共八十八页哦第五十页，讲稿共八十八页哦第五十一页，讲稿共八十八页哦（二）体内法（二）体内法 抗原定量注入皮内，抗原定量注入皮内，48487272小时后观察结果。小时后观察结果。结果判定：结果判定：阳性：注射局部出现红肿、硬结，直径阳性：注射局部出现红肿、硬结，直径0.5cm0.5cm 弱阳性：硬结直径弱阳性：硬结直径0.5cm0.5cm 阴性：无变化阴性：无变化 实际意义：实际意义：阳性阳性 细胞免疫功能正常者细胞免疫功能正常者 弱阳性或阴性弱阳性或阴性 多为细胞免疫功能低下者多为细胞免疫功能低下者 *常用的抗原为结核菌素常用的抗原为结核菌素(OT)(OT)、PHAPHA第五十二页，讲稿共八十八页哦皮内注射法皮内注射法皮内注射法皮内注射法第五十三页，讲稿共八十八页哦划痕法划痕法划痕法划痕法第五十四页，讲稿共八十八页哦第五十五页，讲稿共八十八页哦细胞因子的检测技术细胞因子的检测技术一、一、生物学检测技术生物学检测技术 依赖细胞株测定法依赖细胞株测定法 二、二、免疫学检测技术免疫学检测技术 ELISA ELISA法法三、分子生物学检测技术三、分子生物学检测技术 分子杂交、分子杂交、PCRPCR 等检测等检测mRNAmRNA 第五十六页，讲稿共八十八页哦细胞因子检测的特点细胞因子检测的特点 样品含量低样品含量低样品具有时效性样品具有时效性生物效应特异性差生物效应特异性差第五十七页，讲稿共八十八页哦Figure 14-12第五十八页，讲稿共八十八页哦第五十九页，讲稿共八十八页哦细胞因子的功能细胞因子的功能 Cell activation Cell growth and differentiation Induction of MHC Induction of cytokine receptors Promotion of antibody class-switching 第六十页，讲稿共八十八页哦影响细胞因子作用特异性的因素影响细胞因子作用特异性的因素 Only antigen-activated lymphocytes express receptors Different combinations of receptor subunits result in low-,intermediate-,or high-affinity receptors Requirement of cell-cell interaction Short half-life of cytokines Cytokine antagonists Synergistic and antagonistic interactions among cytokines 第六十一页，讲稿共八十八页哦限制细胞因子临床应用的因素限制细胞因子临床应用的因素High local concentrations of cytokines during immune response cannot be mimicked clinically Short half-life of cytokines Pleiotropic effects can cause unpredictable side-effects第六十二页，讲稿共八十八页哦细胞因子的生物学检测细胞因子的生物学检测检测方法与原理检测方法与原理 细胞增殖或增殖抑制试验细胞增殖或增殖抑制试验 细胞病变抑制试验细胞病变抑制试验 细胞毒试验细胞毒试验 细胞趋化试验细胞趋化试验第六十三页，讲稿共八十八页哦 检测中的操作注意要点检测中的操作注意要点 靶细胞的选择与培养靶细胞的选择与培养 检测标本的制备检测标本的制备 显示检测结果显示检测结果2023/3/31第六十四页，讲稿共八十八页哦靶细胞的选择与培养靶细胞的选择与培养 1 1、对所测的细胞因子有特异的敏感性、对所测的细胞因子有特异的敏感性 2 2、易培养、保存、生物学特性稳定、易培养、保存、生物学特性稳定 3 3、有良好的生长状态、有良好的生长状态 4 4、种属适配、种属适配 2023/3/31第六十五页，讲稿共八十八页哦 各类细胞因子检测的常用靶细胞各类细胞因子检测的常用靶细胞 细胞因子细胞因子 实验系统实验系统 干扰因素干扰因素 IL-1 D10IL-1 D10（MM）增殖法）增殖法 IL-2 IL-2、IL-4IL-4 EL-4 EL-4（MM）增殖法）增殖法 IL-4 IL-4 A352 A352（H H）增殖抑制法）增殖抑制法 IL-2 CTLL IL-2 CTLL（MM）增殖法）增殖法 IL-4 IL-4 IL-3 KG-1 IL-3 KG-1（H H）增殖法）增殖法 TF-1 TF-1（H H）增殖法）增殖法 GN-CSF GN-CSF、IL-5IL-5 IL-6 IL-6、EPOEPO IL-4 CTLL IL-4 CTLL（MM）增殖法）增殖法 IL-2 IL-2 IL-5 BCL-1 IL-5 BCL-1（MM）增殖法）增殖法 IL-4 IL-4第六十六页，讲稿共八十八页哦各类细胞因子检测的常用靶细胞各类细胞因子检测的常用靶细胞 细胞因子细胞因子 实验系统实验系统 干扰因素干扰因素 IL-6 B9 IL-6 B9（MM）增殖法）增殖法 IL-4 IL-4、IL-11IL-11 BM60 BM60（H H）增殖法）增殖法 IL-7 Clone-IXN/2b IL-7 Clone-IXN/2b（MM）增殖法）增殖法 IL-8 IL-8 中性粒细胞（中性粒细胞（MM、H H）趋化法）趋化法 GM-CSF TF-1 GM-CSF TF-1（H H）增殖法）增殖法 IL-3 IL-3、IL-5IL-5 IL-6 IL-6、IL-5IL-5 TNF TNF/L929 L929（MM、H H）细胞毒法）细胞毒法 IFN IFN wish wish（H H）病变保护法）病变保护法 IFN-IFN-IFN-IFN-L929 L929（MM）病变保护法）病变保护法 IFN-IFN-IFN-IFN-第六十七页，讲稿共八十八页哦检测标本的准备检测标本的准备 1 1、分离特定的产生细胞、分离特定的产生细胞 2 2、对产生细胞进行诱导、激活、对产生细胞进行诱导、激活 3 3、选择适当的收集时间选择适当的收集时间2023/3/31第六十八页，讲稿共八十八页哦显示检测结果显示检测结果 1 1、细胞增殖状态的显示：、细胞增殖状态的显示：放射性核素掺入法、放射性核素掺入法、胞内酶活性显示法胞内酶活性显示法 活细胞染色法活细胞染色法 细胞荧光测定法细胞荧光测定法 2 2、细胞毒或细胞病变状态的显示、细胞毒或细胞病变状态的显示 活细胞染色法活细胞染色法 胞内酶活性显示法胞内酶活性显示法 DNA DNA断片测定法断片测定法2023/3/31第六十九页，讲稿共八十八页哦 依赖细胞株测定法依赖细胞株测定法PBMC+PHA PBMC+PHA 培养培养 取上清液取上清液+CTLL-2+CTLL-2细胞细胞 培养培养 +MTT +MTT 培养培养 测测ODOD570570值值 第七十页，讲稿共八十八页哦TNFTNF对靶细胞的细胞毒活性对靶细胞的细胞毒活性 TNF TNF对小鼠对小鼠L929L929成纤维细胞株具有细胞毒活性，细成纤维细胞株具有细胞毒活性，细胞死亡率与胞死亡率与TNFTNF生物学活性成正相关关系。生物学活性成正相关关系。结晶紫染色死细胞结晶紫染色死细胞 MTT MTT检测活细胞检测活细胞 如同时加用转录抑制剂放线菌素如同时加用转录抑制剂放线菌素D D，可提高靶细，可提高靶细胞对胞对TNFTNF的敏感性的敏感性10-10010-100倍。倍。第七十一页，讲稿共八十八页哦 滤膜：计数受趋化细胞滤膜：计数受趋化细胞趋化因子趋化因子细胞细胞趋化试验原理示意趋化试验原理示意第七十二页，讲稿共八十八页哦 细胞因子的免疫学检测细胞因子的免疫学检测 分泌型细胞因子的检测分泌型细胞因子的检测 ELISA ELISA ELISPOT ELISPOT RT-PCR RT-PCR（分子生物学）（分子生物学）细胞内细胞因子的检测细胞内细胞因子的检测 免疫组化技术免疫组化技术第七十三页，讲稿共八十八页哦细胞因子受体的存在细胞因子受体的存在 形式形式 膜型细胞因子受体膜型细胞因子受体 分泌型细胞因子受体分泌型细胞因子受体2023/3/31第七十四页，讲稿共八十八页哦细胞因子受体的检测方法细胞因子受体的检测方法 膜型细胞因子受体的检测：膜型细胞因子受体的检测：配体检测法配体检测法 抗体检测法抗体检测法 分泌型细胞因子受体的检测：分泌型细胞因子受体的检测：标记抗体检测法标记抗体检测法2023/3/31第七十五页，讲稿共八十八页哦 细胞因子检测临床意义细胞因子检测临床意义细细胞因子胞因子 正常正常对对照照 病人病人 疾病疾病 年代年代及受体及受体 （pg/mlpg/ml）（pg/mlpg/ml）IL-1 IL-1 0.160.17 0.530.57 0.160.17 0.530.57 肾细肾细胞癌胞癌 2003 2003 0.3 18.8 0.3 18.8 心心绞绞痛痛 1996 1996 166.7 38.528.8 166.7 38.528.8 胰腺炎胰腺炎 1994 1994 IL-2 2.40.8 10.81.8 IL-2 2.40.8 10.81.8 急性缺血性急性缺血性综综合征合征 1999 1999 IL-4 3.340.84 4.051.02 IL-4 3.340.84 4.051.02 支气管高反支气管高反应应性性 2003 2003 IL-6 54.1 485.2 IL-6 54.1 485.2 疟疟疾疾 2004 2004 1.792.03 8.9113.12 1.792.03 8.9113.12 肾细胞癌肾细胞癌 2002 42 1620 42 1620 败血症败血症 2001 2.10.1 101.6 2.10.1 101.6 风湿风湿 2000 2.55 4.29 2.55 4.29 非酒精性脂肪肝非酒精性脂肪肝 2003 1.10.1 18.62.1 1.10.1 18.62.1 原发性甲状旁腺功原发性甲状旁腺功 1996 1996 能亢进症能亢进症 4.340.9 97.30.97 4.340.9 97.30.97 宫外孕宫外孕 1996 1996 12.30.8 9412.1 12.30.8 9412.1 类风湿关节炎类风湿关节炎 19991999 0.39 16 0.39 16 关节炎关节炎 2004 2004 1.20.6 10.81.8 1.20.6 10.81.8 急性缺血性综合征急性缺血性综合征 1999 1999IL-6IL-6受体受体 25.11(ng/ml)41.71.2(ng/ml)25.11(ng/ml)41.71.2(ng/ml)原发性甲状旁腺功能原发性甲状旁腺功能 1996 1996（可溶性）（可溶性）亢进症亢进症第七十六页，讲稿共八十八页哦 续续表表细细胞因子胞因子 正常正常对对照照 病人病人 疾病疾病 年代年代及受体及受体 （pg/mlpg/ml）（pg/mlpg/ml）IL-8 IL-8 63 331 63 331 败败血症血症 20012001 3.8 43.68 3.8 43.68 非酒精性脂肪肝非酒精性脂肪肝 2003 2003 16.3 1078181.5 16.3 1078181.5 泌尿道感染泌尿道感染 1993 1993 1 17.6 1 17.6 肝癌肝癌 2003 2003 4.80.5 27.52.6 4.80.5 27.52.6 轻轻度子度子宫宫内膜异位症内膜异位症 2003 2003 530.265.1 530.265.1 重度子重度子宫宫内膜异位症内膜异位症IL-10 IL-10 14.1 1099.3 14.1 1099.3 严严重重疟疟疾疾 20042004 9.21.5 17.74.4 9.21.5 17.74.4 非小非小细细胞肺癌胞肺癌 2002 2002 214.2 214.2 转转移癌移癌IL-13 35.2012.70 92.699.87 IL-13 35.2012.70 92.699.87 系系统统性性红红斑狼斑狼疮疮 2005 2005IL-15 16.24 356 IL-15 16.24 356 腹膜炎腹膜炎 2000 2000IL-16 16323 28746 IL-16 16323 28746 轻轻度子度子痫痫 2008 2008 （正常妊娠）（正常妊娠）51558 51558 严严重子重子痫痫IL-18 2811 5121 IL-18 2811 5121 充血性心力衰竭充血性心力衰竭 2000 2000IL-21 46690(ng/ml)1051335(ng/ml)IL-21 46690(ng/ml)1051335(ng/ml)原原发发性干燥性干燥综综合征合征 2007 20072023/3/31第七十七页，讲稿共八十八页哦第七十八页，讲稿共八十八页哦细胞内细胞因子的测定技术（细胞内细胞因子的测定技术（ICSICS）激活细胞：多克隆激活剂，如佛波酯（激活细胞：多克隆激活剂，如佛波酯（PMAPMA）和）和离子霉素（离子霉素（ionomycinionomycin）等或特定的抗原；）等或特定的抗原；抑制细胞因子释放：阻断胞内高尔基体介导的蛋白抑制细胞因子释放：阻断胞内高尔基体介导的蛋白质转运，用布雷菲德菌素质转运，用布雷菲德菌素A A（Brefeldin,BFABrefeldin,BFA）与莫能）与莫能霉素（霉素（MonensinMonensin）等药物；）等药物；增加细胞膜通透性：多聚甲醛固定和皂角苷破膜；增加细胞膜通透性：多聚甲醛固定和皂角苷破膜；荧光标记的抗细胞因子的特异抗体与细胞内细胞因子荧光标记的抗细胞因子的特异抗体与细胞内细胞因子结合，通过流式细胞术（结合，通过流式细胞术（flow cytometry,FCMflow cytometry,FCM）进行检测。）进行检测。第七十九页，讲稿共八十八页哦Principle of Plate-Based ICS AssaysAntigenic stimulus+brefeldin AIncubate 6-24 h Fix cells Permeabilize Stain20 ml PBMC/WB sampleGate on cellsof interest第八十页，讲稿共八十八页哦ICS 应用应用Measure production of cytokines in short-term stimulated whole blood,PBMC,etc.Can measure multiple cell-surface and intracellular markers in combination,using multiparameter flow cytometryCan detect rare events such as antigen-specific T cells第八十一页，讲稿共八十八页哦Example of ICS Resultspp65 proteinpeptide mixA2 peptideCMV lysateCD8CD4anti-IFN FITCCD69 PE第八十二页，讲稿共八十八页哦CFSE AssaysCells(usually PBMC)are labeled with CFSE dye,then allowed to proliferate in vitro(or in vivo in mice)CFSE is divided equally among daughter cells,so each generation becomes half as intense in CFSE staining第八十三页，讲稿共八十八页哦免疫分子生物学技术免疫分子生物学技术1.1.免疫印迹试验免疫印迹试验(immunoblotting,Western blotting)(immunoblotting,Western blotting)(1)(1)电泳：抗原电泳：抗原(如蛋白质如蛋白质