青霉素和头孢菌素 (2)讲稿.ppt

关于青霉素和头孢菌素(2)1第一页，讲稿共七十一页哦2第二节第二节 头孢菌素头孢菌素C生产生产头孢菌素简介头孢菌素简介一、头孢菌素一、头孢菌素C生产菌种生产菌种二、头孢菌素二、头孢菌素C生物合成与代谢调控生物合成与代谢调控三、头孢菌素三、头孢菌素C的发酵的发酵四、头孢菌素四、头孢菌素C的分离纯化工艺的分离纯化工艺第二页，讲稿共七十一页哦3 可看作是由可看作是由-氨基已二酸、半胱氨酸、缬氨酸和醋酸氨基已二酸、半胱氨酸、缬氨酸和醋酸四部分结合而成四部分结合而成头孢菌素头孢菌素C(CephalosporinC，简称头，简称头C或或CPC)第三页，讲稿共七十一页哦4头孢菌素头孢菌素C(CephalosporinC，简称头，简称头C或或CPC)是由是由Newton和和Abraham于于1953年继青霉素之后，年继青霉素之后，在自然界中发现的第二种类型的在自然界中发现的第二种类型的-内酰胺抗生内酰胺抗生素，素，头孢菌素头孢菌素C与青霉素类结构的不同在于母核与青霉素类结构的不同在于母核7-氨基头孢烯酸氨基头孢烯酸(7-ACA)取代了取代了6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸(6-APA)，这种差异使头孢类抗生素可以耐青霉，这种差异使头孢类抗生素可以耐青霉素酶，在化学与生物学性质上与青霉素有许多素酶，在化学与生物学性质上与青霉素有许多共同特征，抗菌作用机制也是抑制细菌细胞壁共同特征，抗菌作用机制也是抑制细菌细胞壁肽聚糖的合成，对人体安全低毒。肽聚糖的合成，对人体安全低毒。由于头孢菌素由于头孢菌素C抗菌活性低，在半合成青霉素抗菌活性低，在半合成青霉素启示下，通过结构改造获得了很多更有效的半启示下，通过结构改造获得了很多更有效的半合成头孢菌素，因此头孢菌素合成头孢菌素，因此头孢菌素C是目前各种半是目前各种半合成头孢菌素的起始原料之一，目前临床上应合成头孢菌素的起始原料之一，目前临床上应用的都是它们的半合成衍生物。用的都是它们的半合成衍生物。第四页，讲稿共七十一页哦5头孢菌素的分类头孢菌素的分类类别类别抗菌谱抗菌谱注射注射口服口服第一代第一代Staphylococci(不包括不包括MRSA)Streptococci(不包括不包括Enterococci)E coli,Proteus,Klebsiella头孢噻吩头孢噻吩(Cephalothin)头孢唑啉头孢唑啉(Cefazolin)头孢氨苄头孢氨苄(Cephalexin)头孢拉定头孢拉定(Cephradine)头孢羟氨苄头孢羟氨苄(Cefadroxil)第二代第二代同第一代，另加同第一代，另加Haemophilus(包括包括-内内酰胺酶产生菌酰胺酶产生菌)头孢孟多头孢孟多(Cefamandole)头孢呋肟头孢呋肟(Cefuroxime)头孢克洛头孢克洛(Cefaclor)头孢丙烯头孢丙烯(Cefprozil)头孢呋肟头孢呋肟(Cefuroxime)氯碳头孢氯碳头孢(Loracarbef)第二代第二代同上另加同上另加Bacteroides头孢西丁头孢西丁(Cefoxitin)第三代第三代同第二代，另加除同第二代，另加除Pseudomonas以外的其以外的其它大多数它大多数G(-)(-)杆菌杆菌头孢他美头孢他美(Cefotaxime)头孢曲松头孢曲松(Ceftriaxone)头孢泊肟头孢泊肟(Cefpodoxime)头孢布烯头孢布烯(Ceftibuten)头孢克肟头孢克肟(Cefixime)第三第三/四四代代同上另加同上另加Pseudomonas头孢他啶头孢他啶(Ceftazidime)头孢吡肟头孢吡肟(Cefepime)头孢匹罗头孢匹罗(Cefpirome)第五页，讲稿共七十一页哦6头孢菌素头孢菌素C的工业生产的工业生产生产菌种：生产菌种：枝顶头孢（Cephalosporium acremonium），又称产黄枝顶孢（Acremonium chrysogenum）。生产流程：生产流程：枝顶头孢 斜面培养 摇瓶培养 种子罐 发酵 过滤 超滤 吸附 解吸 吸附 解吸 锌络合 结晶 过滤 干燥 头孢菌素锌盐第六页，讲稿共七十一页哦7一、头孢菌素一、头孢菌素C生产菌种生产菌种(一一)菌种来源菌种来源1945年，意大利的年，意大利的Brotzu从撒丁岛城市排污口从撒丁岛城市排污口附近的海水中发现一株顶头孢霉附近的海水中发现一株顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)，并证明它的，并证明它的代谢产物具有广谱抗细菌作用。代谢产物具有广谱抗细菌作用。1953年，年，Abraham从这一霉菌的发酵液中分从这一霉菌的发酵液中分离出三种化合物，即头孢菌素离出三种化合物，即头孢菌素C、N和和P。头孢菌素头孢菌素P活性中等，但耐药性发展非常迅速；活性中等，但耐药性发展非常迅速；头孢菌素头孢菌素N活性极差；只有头孢菌素活性极差；只有头孢菌素C (Cephalosporin C)抗菌谱广，毒性小而发展抗菌谱广，毒性小而发展起来。起来。第七页，讲稿共七十一页哦8一、头孢菌素一、头孢菌素C生产菌种生产菌种(二二)菌种选育菌种选育顶头孢霉顶头孢霉M8650是用于工业生产的原始亲株，全世界所是用于工业生产的原始亲株，全世界所有高产菌株差不多都是由它反复诱变、筛选得到的。有高产菌株差不多都是由它反复诱变、筛选得到的。通过诱变在完全培养基上获得蛋氨酸营养缺陷株，通过诱变在完全培养基上获得蛋氨酸营养缺陷株，然后转入加有各种含硫化合物然后转入加有各种含硫化合物(如硫酸盐如硫酸盐)以代替蛋氨以代替蛋氨酸的基本培养基，可以筛选出不需要加入蛋氨酸的酸的基本培养基，可以筛选出不需要加入蛋氨酸的高产突变株，从而降低发酵成本。高产突变株，从而降低发酵成本。由于扩环和羟化是头孢菌素由于扩环和羟化是头孢菌素C生物合成途径的限速步骤，生物合成途径的限速步骤，因此可以用现代基因工程技术构建含有扩环羟化酶因此可以用现代基因工程技术构建含有扩环羟化酶基因的质粒，将其转入工业生产菌株中，以获得显著基因的质粒，将其转入工业生产菌株中，以获得显著提高头孢菌素提高头孢菌素C生产能力的基因工程菌。生产能力的基因工程菌。第八页，讲稿共七十一页哦9Cephalosporium acremonium 的气生菌丝和孢子囊第九页，讲稿共七十一页哦10Cephalosporium acremonium 的菌丝和节孢子节孢子第十页，讲稿共七十一页哦11一、头孢菌素一、头孢菌素C生产菌种生产菌种(三三)菌种保存菌种保存采用冷冻干燥法或液氮法。采用冷冻干燥法或液氮法。由于保存的大部分是营养菌丝，长期保存由于保存的大部分是营养菌丝，长期保存后生命力的恢复较差，故经过保存的菌株后生命力的恢复较差，故经过保存的菌株应对存活细胞进行计数。并在摇瓶及中试应对存活细胞进行计数。并在摇瓶及中试条件下进行生产能力试验，挑选复壮的菌条件下进行生产能力试验，挑选复壮的菌落作为生产用种子。落作为生产用种子。一般选择含麦芽提取物和优质蛋白胨的固一般选择含麦芽提取物和优质蛋白胨的固体培养基较为合适。体培养基较为合适。第十一页，讲稿共七十一页哦12二、头孢菌素二、头孢菌素C生物合成与代谢调控生物合成与代谢调控(一一)生物合成概述生物合成概述头孢菌素头孢菌素C也是由也是由L-氨基己二酸、氨基己二酸、L-半胱氨酸和半胱氨酸和L-缬氨酸缬氨酸经三肽途径生物合成的。而且，在异青霉素经三肽途径生物合成的。而且，在异青霉素N之前和青霉之前和青霉素的生物合成途径一样。素的生物合成途径一样。在顶头孢霉中，异青霉素在顶头孢霉中，异青霉素N在异构酶的作用下，将异青霉在异构酶的作用下，将异青霉素素N转化为青霉素转化为青霉素N，再由扩环酶，再由扩环酶(脱乙酰氧头孢菌素脱乙酰氧头孢菌素C合合成酶成酶)催化扩环生成脱乙酰氧头孢菌素催化扩环生成脱乙酰氧头孢菌素C，最后通过羟化和，最后通过羟化和转乙酰基反应得到头孢菌素转乙酰基反应得到头孢菌素C。扩环和羟化是头孢菌素扩环和羟化是头孢菌素C生物合成中的关键反应和限速阶段。生物合成中的关键反应和限速阶段。在顶头孢霉中，催化这一反应的是一种叫做扩环羟化酶的在顶头孢霉中，催化这一反应的是一种叫做扩环羟化酶的双功能酶，它需要双功能酶，它需要Fe2+、分子氧、分子氧、-酮戊二酸及还原剂酮戊二酸及还原剂(如抗如抗坏血酸或二硫苏糖醇坏血酸或二硫苏糖醇)作为辅助因子。作为辅助因子。第十二页，讲稿共七十一页哦13头头孢孢菌菌素素C的的生生物物合合成成途途径径第十三页，讲稿共七十一页哦14二、头孢菌素二、头孢菌素C生物合成与代谢调控生物合成与代谢调控(二二)顶头孢霉的硫代谢顶头孢霉的硫代谢硫可以通过两种途径由顶头孢霉掺入头孢菌硫可以通过两种途径由顶头孢霉掺入头孢菌素素C分子中。一种是和青霉素发酵一样的硫分子中。一种是和青霉素发酵一样的硫酸盐还原途径，另一种是蛋氨酸的逆转硫途酸盐还原途径，另一种是蛋氨酸的逆转硫途径。径。野生顶头孢霉菌株不能利用硫酸盐，故只能野生顶头孢霉菌株不能利用硫酸盐，故只能以蛋氨酸为基质，主要通过逆转硫途径提供以蛋氨酸为基质，主要通过逆转硫途径提供硫。硫。通过突变筛选获得的能有效利用硫酸盐的工通过突变筛选获得的能有效利用硫酸盐的工业生产菌株，可在不加蛋氨酸的情况下高效业生产菌株，可在不加蛋氨酸的情况下高效地合成头孢菌素地合成头孢菌素C。第十四页，讲稿共七十一页哦15二、头孢菌素二、头孢菌素C生物合成与代谢调控生物合成与代谢调控(三三)生物合成的调控生物合成的调控较高的葡萄糖浓度不影响异青霉素较高的葡萄糖浓度不影响异青霉素N合成酶，合成酶，主要阻遏扩环酶的生成。只有当葡萄糖接近主要阻遏扩环酶的生成。只有当葡萄糖接近耗尽时，头孢菌素耗尽时，头孢菌素C才大量合成。高浓度的磷才大量合成。高浓度的磷酸盐助长这种碳源阻遏。酸盐助长这种碳源阻遏。限制碳源流加的补料发酵可显著提高头孢菌限制碳源流加的补料发酵可显著提高头孢菌素素C的产率，减少青霉素的产率，减少青霉素N的积累，即使在高的积累，即使在高浓度磷酸盐存在下也不例外。浓度磷酸盐存在下也不例外。在分批和补料分批发酵中，用代谢慢的植物在分批和补料分批发酵中，用代谢慢的植物油做碳源也可以避免碳源阻遏。油做碳源也可以避免碳源阻遏。第十五页，讲稿共七十一页哦16二、头孢菌素二、头孢菌素C生物合成与代谢调控生物合成与代谢调控(三三)生物合成的调控生物合成的调控在顶头孢霉的发酵液中存在乙酰酯酶，能将头孢菌素在顶头孢霉的发酵液中存在乙酰酯酶，能将头孢菌素C水解生成脱乙酰头孢菌素水解生成脱乙酰头孢菌素C。后者的抗菌活性很弱，。后者的抗菌活性很弱，且影响头孢菌素且影响头孢菌素C的分离和提纯，应当在发酵过的分离和提纯，应当在发酵过程中尽量减少它的生成。程中尽量减少它的生成。对于某些菌株，碳源的存在可抑制乙酰酯酶的活性，对于某些菌株，碳源的存在可抑制乙酰酯酶的活性，故在发酵液中保持一定的碳源浓度对于防止头孢菌素故在发酵液中保持一定的碳源浓度对于防止头孢菌素C的水解，降低脱乙酰头孢菌素的水解，降低脱乙酰头孢菌素C的含量是一个决定性的含量是一个决定性因素。因素。另外，避免发酵过程中温度和另外，避免发酵过程中温度和pH的异常升高，对的异常升高，对减少脱乙酰头孢菌素减少脱乙酰头孢菌素C的生成也有一定的作用。的生成也有一定的作用。第十六页，讲稿共七十一页哦17二、头孢菌素二、头孢菌素C生物合成与代谢调控生物合成与代谢调控(三三)生物合成的调控生物合成的调控蛋氨酸在头孢菌素蛋氨酸在头孢菌素C的发酵中不仅起着供的发酵中不仅起着供硫体的作用，而且还有某种不明机制的硫体的作用，而且还有某种不明机制的诱导调控作用。诱导调控作用。已知蛋氨酸能调节细胞的生长，促进细已知蛋氨酸能调节细胞的生长，促进细胞的呼吸和形态分化，从而强化头孢菌胞的呼吸和形态分化，从而强化头孢菌素素C的生物合成。的生物合成。第十七页，讲稿共七十一页哦18三、头孢菌素三、头孢菌素C的发酵的发酵(一一)发酵培养基发酵培养基头孢菌素头孢菌素C发酵过程中的物质消耗发酵过程中的物质消耗 物质名称物质名称 消耗量消耗量(kg/m3发酵液发酵液)物质名称物质名称 消耗量消耗量(kg/m3发酵液发酵液)氧氧80160玉米浆玉米浆5075豆油豆油70130无机盐无机盐1723糖糖30120氨氨1020第十八页，讲稿共七十一页哦19三、头孢菌素三、头孢菌素C的发酵的发酵(一一)发酵培养基发酵培养基玉米浆已被证明是一种优良的氮源，它提供各种丰富的氨基酸、肽、蛋白质和微量元素，起始用量一般为26g(N)L。其他氮源有花生饼粉、硫酸铵、氨、尿素等。当基础培养基中的氮源消耗到一定程度时，要不断补入硫酸铵或氨，以维持发酵液中铵氮含量在0507gL之间。补氨还能起到控制pH的作用(一般在67之间)。第十九页，讲稿共七十一页哦20三、头孢菌素三、头孢菌素C的发酵的发酵(一一)发酵培养基发酵培养基碳源可以使用葡萄糖、糊精、淀粉或植物油。植物油碳源可以使用葡萄糖、糊精、淀粉或植物油。植物油通常作为流加碳源，而其他加入基础培养基中。通常作为流加碳源，而其他加入基础培养基中。当培养基中含有丰富的玉米浆时，其中所含的有机酸可当培养基中含有丰富的玉米浆时，其中所含的有机酸可以作为前期菌丝生长的优良碳源，就没有必要加大其他以作为前期菌丝生长的优良碳源，就没有必要加大其他糖类。糖类。流加用的植物油若为豆油，应以卵磷脂含量低者为好，为此流加用的植物油若为豆油，应以卵磷脂含量低者为好，为此可将新鲜豆油放置一段时间使卵磷脂大部分沉淀后再使用。可将新鲜豆油放置一段时间使卵磷脂大部分沉淀后再使用。除了碳、氮源外，通常还要添加无机盐以满足菌丝生长对除了碳、氮源外，通常还要添加无机盐以满足菌丝生长对Mg2+、PO43-等的需要，特别是当采用含有机物少的稀等的需要，特别是当采用含有机物少的稀薄培养基时。薄培养基时。对于某些不能利用硫酸根的菌株来说，还必须加入蛋对于某些不能利用硫酸根的菌株来说，还必须加入蛋氨酸。氨酸。第二十页，讲稿共七十一页哦21三、头孢菌素三、头孢菌素C的发酵的发酵(二二)通气与搅拌通气与搅拌三肽的环化、青霉素N的扩环和脱乙酰氧头孢菌素C的羟化都是氧化反应，要求较高的氧传递速率。溶氧浓度低于25饱和度，产率将显著降低。溶氧的耗尽先是导致中间产物青霉素N的积累，随后整个生物合成过程减慢。一般要求搅拌输入功率为4kwm3(发酵液)以上。第二十一页，讲稿共七十一页哦22三、头孢菌素三、头孢菌素C的发酵的发酵(二二)通气与搅拌通气与搅拌根据溶氧的变化情况，可将发酵过程分为两个阶段。第根据溶氧的变化情况，可将发酵过程分为两个阶段。第一阶段是菌丝量高速增长、溶氧迅速下降的生长阶段。一阶段是菌丝量高速增长、溶氧迅速下降的生长阶段。这一阶段必须在溶氧成为限制因子之前结束，它可以通这一阶段必须在溶氧成为限制因子之前结束，它可以通过使碳源成为限制因子来达到。在第二阶段即产物合成过使碳源成为限制因子来达到。在第二阶段即产物合成阶段，要严格控制油的流加，使溶氧始终保持在阶段，要严格控制油的流加，使溶氧始终保持在25饱饱和度以上。和度以上。发酵液中含有过多的油，一方面会提高比生长率而加速氧发酵液中含有过多的油，一方面会提高比生长率而加速氧的消耗，另一方面又会增加传氧阻力而降低氧传递速率，的消耗，另一方面又会增加传氧阻力而降低氧传递速率，两者同时导致溶氧下降。一旦加油过多，可以通过提高搅两者同时导致溶氧下降。一旦加油过多，可以通过提高搅拌转速和发酵温度，以加速氧的传递和油的消耗，避免溶拌转速和发酵温度，以加速氧的传递和油的消耗，避免溶氧过分下降。氧过分下降。第二十二页，讲稿共七十一页哦23三、头孢菌素三、头孢菌素C的发酵的发酵(三三)菌丝生长速率菌丝生长速率葡萄糖作为生长限制基质进行的恒化器实验葡萄糖作为生长限制基质进行的恒化器实验表明，菌丝比生长率与抗生素比生产率成反表明，菌丝比生长率与抗生素比生产率成反比。比。但用豆油作为生长限制基质时，比生长率则但用豆油作为生长限制基质时，比生长率则与比生产率成正比；比生长率由与比生产率成正比；比生长率由001h提提高到高到004h，比生产率增加到，比生产率增加到2倍。倍。因此，在前一种情况下，与其说是生长率的因此，在前一种情况下，与其说是生长率的影响，不如说是葡萄糖的碳源调控在起作用。影响，不如说是葡萄糖的碳源调控在起作用。第二十三页，讲稿共七十一页哦24三、头孢菌素三、头孢菌素C的发酵的发酵(四四)菌丝形态菌丝形态在头孢菌素C发酵过程中，顶头孢霉呈现明显的形态分化。在快速生长期，菌体以细长的丝状为主；随着营养的消耗和比生长率的下降，菌丝开始膨胀、断裂，最后形成单细胞的节孢子。这种节孢子可以生成芽管，发育成新的菌丝，产生新的生长循环。蛋氨酸的加入及碳源的限制可以促进这种形态分化，而形态分化是头孢菌素C生物合成启动的关键要素。第二十四页，讲稿共七十一页哦25Cephalosporium acremonium 的菌丝和的菌丝和节孢子节孢子节孢子节孢子第二十五页，讲稿共七十一页哦26顶头孢霉菌株形成节孢子能力与头孢菌素顶头孢霉菌株形成节孢子能力与头孢菌素C生产生产能力的关系能力的关系在菌株选育过程中，随着菌株生产能力的提高，形成节孢子的能力呈增加的趋势。第二十六页，讲稿共七十一页哦27三、头孢菌素三、头孢菌素C的发酵的发酵(五五)发酵终点的确定发酵终点的确定头孢菌素头孢菌素C不稳定，分子中的不稳定，分子中的-内酰胺环以内酰胺环以510-3h的的一级反应速率非酶降解，故随着发酵液中头孢菌素一级反应速率非酶降解，故随着发酵液中头孢菌素C浓度的提高，绝对降解量逐渐加大。浓度的提高，绝对降解量逐渐加大。同时，由于乙酰酯酶的存在，部分头孢菌素同时，由于乙酰酯酶的存在，部分头孢菌素C被转化为脱被转化为脱乙酰头孢菌素乙酰头孢菌素C，而且后者比前者稳定，因而后者占，而且后者比前者稳定，因而后者占发酵总产物的比例将越来越高。发酵总产物的比例将越来越高。-内酰胺环降解后的产物及脱乙酰头孢菌素内酰胺环降解后的产物及脱乙酰头孢菌素C含量的增含量的增加，将对头孢菌素加，将对头孢菌素C的回收造成不利的影响。的回收造成不利的影响。另外，随着发酵时间的延长，由于菌丝形态的变化另外，随着发酵时间的延长，由于菌丝形态的变化及自溶，发酵液将变得难以过滤。及自溶，发酵液将变得难以过滤。应综合考虑，把握终点，达到最大生产效益。应综合考虑，把握终点，达到最大生产效益。第二十七页，讲稿共七十一页哦28头孢菌素头孢菌素C的工业生产的工业生产工艺控制点：工艺控制点：发酵液残油：微量，但离心后肉眼可见；发酵液残油：微量，但离心后肉眼可见；铵氮：铵氮：0.50.7 g/L；pH：6.5。原料消耗：原料消耗：物质名称物质名称消耗量消耗量(kg/m3发酵液发酵液)物质名称物质名称消耗量消耗量(kg/m3发酵液发酵液)氧氧80160玉米浆玉米浆5075豆油豆油70130无机盐无机盐1723糖糖30120氨氨1020第二十八页，讲稿共七十一页哦29四、头孢菌素四、头孢菌素C的分离纯化工艺的分离纯化工艺头孢菌素C(简称头C)为氨基酸，通常为内铵盐，水溶性很大，化学稳定性较差，并且在生物合成过程中常伴随产生性质相近的头孢菌素C(CPC)、脱乙酰氧头孢菌素C(DOCPC)、脱乙酰头孢菌素C(DCPC)和青霉素N等多种头C类似物，这些都给头C的分离纯化带来较大困难。虽然吸附法、溶媒提取法、离子交换法及沉淀法都可用来分离头C，但上述任何一种单一的传统方法，均达不到满意的效果。第二十九页，讲稿共七十一页哦30目前主要采用多种分离纯化方法相结合的生产工艺。即先用大孔网状吸附剂从发酵液中初步分离出头C，然后经离子交换法纯化，最后采用络盐沉淀法进行结晶。第三十页，讲稿共七十一页哦31(一一)发酵液预处理发酵液预处理发酵终了时，按头发酵终了时，按头C C游离酸计，一般游离酸计，一般CPCCPC含含量为量为181820mg20mgmlml，还含有，还含有5 51515的的DCPCDCPC及微量及微量DOCPCDOCPC。先使发酵液冷却至先使发酵液冷却至1515以下，再用硫酸酸以下，再用硫酸酸化至化至pH 2pH 25 53 30 0，放置一定时间，使，放置一定时间，使DCPCDCPC内酯化而易于与头内酯化而易于与头C C分离。然后板框分离。然后板框或真空鼓式过滤机过滤，并用水顶洗滤渣。或真空鼓式过滤机过滤，并用水顶洗滤渣。收集、合并滤液和洗液于低温收集、合并滤液和洗液于低温(10)(10)下保下保存。存。第三十一页，讲稿共七十一页哦32(二二)吸附与解吸吸附与解吸用大孔网状吸附剂吸附滤液和洗液中的头用大孔网状吸附剂吸附滤液和洗液中的头C C。滤液在。滤液在进入吸附柱之前一定要强调澄明，以免污染树脂。进入吸附柱之前一定要强调澄明，以免污染树脂。国外常用国外常用Amberlite XAD-2Amberlite XAD-2、XAD-4XAD-4及及Diaion HP-20Diaion HP-20等。国产大孔网状吸附剂有等。国产大孔网状吸附剂有SKC-02SKC-02、SIP-1300SIP-1300、312312等，其性能与等，其性能与XAD-4XAD-4相似。相似。头头C C的最适吸附的最适吸附pHpH应为应为2 25 53 30 0，XAD-4XAD-4的吸附容量的吸附容量为为151520g20gL L树脂。树脂。吸附完毕，需用吸附完毕，需用2 24 4倍吸附体积去离子水洗涤，除去倍吸附体积去离子水洗涤，除去SO42-SO42-等阴离子，以免干扰后工序离子交换树脂的纯化。等阴离子，以免干扰后工序离子交换树脂的纯化。然后用然后用15152525乙醇，丙酮或异丙醇水溶液来解吸。乙醇，丙酮或异丙醇水溶液来解吸。收集解吸液收率约为收集解吸液收率约为9090。第三十二页，讲稿共七十一页哦33(三三)纯化纯化用离子交换树脂纯化解吸液中的头用离子交换树脂纯化解吸液中的头C C。头头C C分子具有两个羧基和一个氨基，由于氨基碱性较弱，分子具有两个羧基和一个氨基，由于氨基碱性较弱，不能用阳离子交换树脂处理，用强碱性树脂，吸附虽不能用阳离子交换树脂处理，用强碱性树脂，吸附虽好，但解吸困难。故采用弱碱性阴离子交换树脂来分好，但解吸困难。故采用弱碱性阴离子交换树脂来分离纯化头离纯化头C C，常用，常用Amberlite IRA-68Amberlite IRA-68、Amberlite IR-4BAmberlite IR-4B及国产医工及国产医工-82-82、330330等。等。预先用醋酸溶液处理树脂使成醋酸型，再开始吸附。预先用醋酸溶液处理树脂使成醋酸型，再开始吸附。330330树脂对树脂对CPCCPC的交换容量为的交换容量为606080g80gL L树脂。树脂。吸附完毕，用去离子水洗涤树脂，然后以吸附完毕，用去离子水洗涤树脂，然后以1.51.52.52.5的醋酸钠的醋酸钠(钾钾)水溶液解吸。解吸收率一般也有水溶液解吸。解吸收率一般也有9090左右。左右。第三十三页，讲稿共七十一页哦34(四四)沉淀结晶沉淀结晶头头C C可与二价重金属离子可与二价重金属离子Cu2+Cu2+、Zn2+Zn2+、Ni2+Ni2+、Co2+Co2+、Fe2+Fe2+、pb2+pb2+等形成等形成llll摩尔比的难溶性络摩尔比的难溶性络盐微晶沉淀。利用这一原理，在头盐微晶沉淀。利用这一原理，在头C C二次解吸液二次解吸液中直接进行沉淀结晶。其中以锌盐用得最普遍。中直接进行沉淀结晶。其中以锌盐用得最普遍。将将CPCCPC浓度为浓度为303050mg50mgmLmL的离子交换解吸液，的离子交换解吸液，放入结晶罐中冷却至放入结晶罐中冷却至55，加入醋酸锌搅拌使溶，加入醋酸锌搅拌使溶解，然后再加入结晶液体积解，然后再加入结晶液体积3030的乙醇或丙酮，的乙醇或丙酮，即逐渐析出头即逐渐析出头C C锌盐微晶沉淀。结晶收率为锌盐微晶沉淀。结晶收率为85859090。此法简单，收率也好，但由于重金属盐。此法简单，收率也好，但由于重金属盐的选择性较差，需在一定浓度下才能析出络盐结的选择性较差，需在一定浓度下才能析出络盐结晶，因此，此法只能用于经过纯化后的头晶，因此，此法只能用于经过纯化后的头C C水溶水溶液。液。第三十四页，讲稿共七十一页哦35(四四)沉淀结晶沉淀结晶头头C C锌盐含锌盐含2 2分子结晶水分子结晶水C16H20O8N3SZn2H2OC16H20O8N3SZn2H2O，为淡黄，为淡黄色微晶性粉末，不溶于水及氯仿、甲醇、乙醇等有机溶色微晶性粉末，不溶于水及氯仿、甲醇、乙醇等有机溶剂，其剂，其CPCCPC游离酸，游离酸，Zn2+Zn2+及水分三种含量的理论值分别为及水分三种含量的理论值分别为808030%30%、12126969及及6 69898。该工艺的特点是将大孔吸附剂法、离子交换法及沉淀法三该工艺的特点是将大孔吸附剂法、离子交换法及沉淀法三者合理地结合起来，扬长避短，使头者合理地结合起来，扬长避短，使头C C的分离纯化在收率与的分离纯化在收率与质量上达到较为满意的结果。质量上达到较为满意的结果。发酵液至头发酵液至头C C锌盐总收率一般为锌盐总收率一般为65657070。从质量上看，。从质量上看，发酵液中发酵液中CPCCPC的纯度为的纯度为60606565，经过大孔网状吸附剂，经过大孔网状吸附剂分离的一次解吸液分离的一次解吸液CPCCPC纯度可提高至纯度可提高至75758080，在弱碱性，在弱碱性树脂离子交换纯化后的二次解吸液树脂离子交换纯化后的二次解吸液CPCCPC纯度已达纯度已达90%90%以上。以上。第三十五页，讲稿共七十一页哦36四四.头孢菌素类及半合成头孢菌素类头孢菌素类及半合成头孢菌素类（一）天然头孢菌素（一）天然头孢菌素头孢菌素头孢菌素C C1.1.结构：结构：头孢菌素头孢菌素C C的化学结构中母核是由氢化噻嗪环的化学结构中母核是由氢化噻嗪环与与 -内酰胺环稠合而成，内酰胺环稠合而成，7 7位上有位上有D-D-氨基己氨基己二单酰胺基侧链。二单酰胺基侧链。第三十六页，讲稿共七十一页哦372.2.稳定性：稳定性：四、六元环稠合四、六元环稠合C2C2、C3C3双键双键3.3.特点：抗菌活性比较低；但对酸比较稳定，特点：抗菌活性比较低；但对酸比较稳定，可以口服，毒性较小，与青霉素很少或无交可以口服，毒性较小，与青霉素很少或无交叉过敏反应。抗菌谱广，对革兰阴性菌有抗叉过敏反应。抗菌谱广，对革兰阴性菌有抗菌活性。菌活性。第三十七页，讲稿共七十一页哦384.4.结构改造：对头孢菌素结构改造：对头孢菌素C C进行结构改造，进行结构改造，增强抗菌活性，扩大抗菌谱，增强抗菌活性，扩大抗菌谱，发展了第一、二、三、四发展了第一、二、三、四代头孢菌素。代头孢菌素。第三十八页，讲稿共七十一页哦39头孢菌素可进行结构改造的部位有以下四处：头孢菌素可进行结构改造的部位有以下四处：（）7 7位酰胺侧链。是决定抗菌谱的基团，位酰胺侧链。是决定抗菌谱的基团，可扩大抗菌谱，提高活性。可扩大抗菌谱，提高活性。（）7-7-氢原子。以甲氧基取代可以增加氢原子。以甲氧基取代可以增加 -内酰胺环的稳定性。内酰胺环的稳定性。（）氢化噻唑环中的硫原子。对抗菌活性）氢化噻唑环中的硫原子。对抗菌活性 有影响。有影响。（）3 3位上的取代基。影响药物的药代动力学位上的取代基。影响药物的药代动力学 性质，提高活性。性质，提高活性。第三十九页，讲稿共七十一页哦40部位是部位是7 7位酰胺基取代基位酰胺基取代基R R：7 7位侧链上引入亲脂性基团，如苯环位侧链上引入亲脂性基团，如苯环 、噻吩、噻吩、含氮杂环，并在含氮杂环，并在3 3位引入杂环，可扩大抗菌谱，位引入杂环，可扩大抗菌谱，并增强抗菌活性，并增强抗菌活性，如：头孢噻吩（如：头孢噻吩（CefalothinCefalothin）、头孢噻啶）、头孢噻啶（CefaloridineCefaloridine）和头孢唑林（）和头孢唑林（CefazolinCefazolin）等。）等。第四十页，讲稿共七十一页哦41头孢噻吩头孢噻吩头孢噻啶头孢噻啶头孢唑啉头孢唑啉第四十一页，讲稿共七十一页哦427 7位酰胺基的位酰胺基的 位引入亲水性基团位引入亲水性基团SOSO3 3H H，NHNH2 2，COOHCOOH，可扩大抗菌谱，得到广谱头，可扩大抗菌谱，得到广谱头孢菌素。孢菌素。如果同时改变如果同时改变3 3位上的取代基，用位上的取代基，用-CH-CH3 3、-Cl-Cl或或含氮杂环取代，除改进口服吸收外还扩大了抗含氮杂环取代，除改进口服吸收外还扩大了抗菌谱。如：头孢氨苄（菌谱。如：头孢氨苄（CefalexinCefalexin）、头孢羟氨）、头孢羟氨苄苄(Cefadoxil)(Cefadoxil)、头孢拉定、头孢拉定(Cefradine)(Cefradine)、头孢克、头孢克洛（洛（CefaclorCefaclor）、头孢哌酮（）、头孢哌酮（CefoperazoneCefoperazone），），头孢磺啶（头孢磺啶（CefsulodinCefsulodin）等。）等。第四十二页，讲稿共七十一页哦43头孢氨苄头孢氨苄头孢羟氨苄头孢羟氨苄头孢拉啶头孢拉啶第四十三页，讲稿共七十一页哦44头孢克洛头孢克洛头孢哌酮头孢哌酮头孢磺啶头孢磺啶第四十四页，讲稿共七十一页哦45具有具有7 7位顺式甲氧亚氨基位顺式甲氧亚氨基2 2氨基噻唑侧链氨基噻唑侧链，可提高药物对可提高药物对 -内酰胺酶的稳定性，增强对革内酰胺酶的稳定性，增强对革兰氏阴性菌外膜的渗透，从而扩大了抗菌谱。兰氏阴性菌外膜的渗透，从而扩大了抗菌谱。许多第三代头孢菌素都具有氨基噻唑侧链，许多第三代头孢菌素都具有氨基噻唑侧链，如：头孢克肟（如：头孢克肟（CefiximeCefixime）、头孢噻肟、）、头孢噻肟、头孢甲肟（头孢甲肟（CefmenoximeCefmenoxime）等。）等。第四十五页，讲稿共七十一页哦46头孢甲肟头孢甲肟头孢噻肟头孢噻肟头孢克肟头孢克肟第四十六页，讲稿共七十一页哦47部位部位：引入引入7-7-甲氧基，增加了药物对甲氧基，增加了药物对 内酰内酰胺酶的稳定性，头孢西丁（胺酶的稳定性，头孢西丁（CefoxitinCefoxitin）等）等一系列头霉素对一系列头霉素对内酰胺酶非常稳定。内酰胺酶非常稳定。第四十七页，讲稿共七十一页哦48部位部位S S：氢化噻唑环中的硫原子用生物电子等排体氢化噻唑环中的硫原子用生物电子等排体-O-O-取代，称为取代，称为氧头孢菌素氧头孢菌素（OxacefalosprinOxacefalosprin）；）；用生物电子等排体用生物电子等排体-CH-CH2 2-取代时，称为取代时，称为碳头碳头孢烯孢烯（CarbacephemCarbacephem）类。碳头孢烯是一类）类。碳头孢烯是一类新的新的 -内酰胺抗生素，不但活性强，而且内酰胺抗生素，不但活性强，而且有广谱、耐酶、长效作用。有广谱、耐酶、长效作用。氯碳头孢氯碳头孢是用碳取代头孢克罗中硫原子的化合物。是用碳取代头孢克罗中硫原子的化合物。拉他头孢拉他头孢（LatamoxefLatamoxef）是第一个用于临床）是第一个用于临床的氧头孢烯。的氧头孢烯。第四十八页，讲稿共七十一页哦49部位：部位：如有如有-CH-CH3 3、-Cl-Cl、杂环等基团时可增强抗菌活、杂环等基团时可增强抗菌活性，并改善药物在体内的吸收、分布等药物代性，并改善药物在体内的吸收、分布等药物代谢动力学性质，如谢动力学性质，如头孢曲松、头孢克肟、头孢头孢曲松、头孢克肟、头孢他啶他啶。第四代头孢菌素特点是第四代头孢菌素特点是3 3 位含有带正电荷季铵，位含有带正电荷季铵，增加了药物对细胞膜的穿透力，如增加了药物对细胞膜的穿透力，如头孢匹罗头孢匹罗、头孢吡肟、头孢克定、头孢吡肟、头孢克定等。等。第四十九页，讲稿共七十一页哦50头孢曲松头孢曲松头孢他啶头孢他啶头孢克肟头孢克肟第五十页，讲稿共七十一页哦51（二）半合成头孢菌素（二）半合成头孢菌素1.1.头孢氨苄头孢氨苄第五十一页，讲稿共七十一页哦52化学名：化学名：(6R,7R)-3-(6R,7R)-3-甲基甲基-7-(R)-2-7-(R)-2-氨基氨基-2-2-苯乙酰氨基苯乙酰氨基-8-8-氧代氧代-5-5-硫杂硫杂-1-1-氮杂双化氮杂双化4.2.04.2.0辛辛-2-2-烯烯-2-2-甲酸一水合物。甲酸一水合物。又名先锋霉素又名先锋霉素，头孢力新，头孢力新第五十二页，讲稿共七十一页哦532.2.头孢噻肟钠：头孢噻肟钠：第五十三页，讲稿共七十一页哦54性质：结构中性质：结构中7 7位侧链上的甲氧肟基呈顺式构型，位侧链上的甲氧肟基呈顺式构型，顺式异构体的抗菌活性强于反式异构体。顺式异构体的抗菌活性强于反式异构体。在光照下，顺式异构体向反式异构体转化，在光照下，顺式异构体向反式异构体转化，因此应避光保存。因此应避光保存。头孢噻肟为第三代半合成头孢菌素。头孢噻肟为第三代半合成头孢菌素。7 7位侧链上引入顺式甲氧肟取代基，由于空间位侧链上引入顺式甲氧肟取代基，由于空间位阻作用，阻碍酶分子接近位阻作用，阻碍酶分子接近 -内酰胺环，内酰胺环，保护保护 -内酰胺环不易被酶破坏。内酰胺环不易被酶破坏。第五十四页，讲稿共七十一页哦55（三）半合成头孢菌素的方法：（三）半合成头孢菌素的方法：7-ACA7-ACA为合成中间体为合成中间体缩合方法同半合成青霉素缩合方法同半合成青霉素第五十五页，讲稿共七十一页哦561.1.内酰胺环是活性必须；内酰胺环是活性必须；二个手性中心是活性必须。二个手性中心是活性必须。2.3-2.3-位被甲基、氯、含氮杂环取代，活性增加或位被甲基、氯、含氮杂环取代，活性增加或 改变体内药代动力学。改变体内药代动力学。3.2-3.2-的羧基是活性必须，的羧基是活性必须，2-32-3位双键位移失活。位双键位移失活。（四）构效关系：（四）构效关系：第五十六页，讲稿共七十一页哦574.7-4.7-位侧链是结构修饰的主要部位，位侧链是结构修饰的主要部位，能产生各式各样的作用。能产生各式各样的作用。5.7-5.7-位位-H-H用用甲氧基取代，可提高甲氧基取代，可提高对酶的稳定性。对酶的稳定性。6.5-6.5-位的位的S S 可被可被C C、OO取代，不丧失活性。取代，不丧失活性。第五十七页，讲稿共七十一页哦58五五.非经典的非经典的-内酰胺抗生素内酰胺抗生素 及及 -内酰胺内酰胺 酶抑制剂酶抑制剂碳青霉烯、青霉烯、氧青霉烷、单环碳青霉烯、青霉烯、氧青霉烷、单环-内酰胺抗生素内酰胺抗生素-内酰胺内酰胺 酶抑制剂也属于非经典的酶抑制剂也属于非经典的-内酰胺抗生素。内酰胺抗生素。-内酰胺酶是细菌产生的保护性酶。内酰胺酶是细菌产生的保护性酶。第五十八页，讲稿共七十一页哦591.1.氨曲南属于单环氨曲南属于单环-内酰胺抗生素。内酰胺抗生素。对需氧的革兰氏阴性菌包括绿脓杆菌有很对需氧的革兰氏阴性菌包括绿脓杆菌有很强的活性，对需氧的革兰氏阳性菌和厌氧菌强的活性，对需氧的革兰氏阳性菌和厌氧菌作用较小，对各种作用较小，对各种内酰胺酶稳定，能透内酰胺酶稳定，能透过血脑屏障，副作用小。临床主要用于呼吸过血脑屏障，副作用小。临床主要用于呼吸道感染、尿路感染、软组织感染、败血症等道感染、尿路感染、软组织感染、败血症等，疗效良好。，疗效良好。第五十九页，讲稿共七十一页哦60 值得注意的是氨曲南耐受性好，副作用发值得注意的是氨曲南耐受性好，副作用发生机会小，未发生过过敏反应，而且与青霉素生机会小，未发生过过敏反应，而且与青霉素和头孢菌素不发生交叉性过敏反应，从而为寻和头孢菌素不发生交叉性过敏反应，从而为寻找无过敏反应的、高效、广谱找无过敏反应的、高效、广谱内酰胺酶抗内酰胺酶抗生素的一个新方向。生素的一个新方向。第六十页，讲稿共七十一页哦61 2.2.舒巴坦（舒巴坦（SulbactamSulbactam）为不可逆竞争）为不可逆竞争性性 -内酰胺酶抑制剂，舒他西林是氨苄西内酰胺酶抑制剂，舒他西林是氨苄西林与舒巴坦以亚甲基相连形成的双酯结构，林与舒巴坦以亚甲基相连形成的双酯结构，是一个前药，在体内经代谢分解出氨苄