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药品分析方法验证培训第1页，此课件共45页哦内 容分析方法验证的法规要求。ICH、USP、ChP和EP的方法验证分析方法验证的要求分析方法验证的步骤分析方法验证成功的前提分析方法验证的要点含量分析方法验证接受标准方法确认和方法传递第2页，此课件共45页哦分析方法验证的法规要求FDA cGMP21 CFR2411 Test Method,which are used for assessing compliance of pharmaceutical articles with establishde specifications,must meet proper standards of accuracy and reliability中国GMP(2010)、中国药典非常关注验证的过程，分析方法验证不完善是常见的问题药品质量标准中分析方法必须验证药物生产工艺变更、制剂的组分变更、原分析方法修订时，则质量标准分析方法必须进行验证EU GMP Volume 4 analytical method shall be validated,all testing operations described in the marketing authorisation should be carried out according to the approved method.第3页，此课件共45页哦分析方法验证的法规要求采用新的检验方法检验方法需要变更的采用中国药典未收载的检验方法法规规定的其他需要验证的检验方法 对不需要进行验证的检验方法，企业应进行方法确认，以保证检验数据准确、可靠。2015版药典中分析方法验证指导原则中国GMP（2010）对分析方法验证规定：符合下列情形之一的应对分析方法进行验证2010版药典中分析方法验证指导原则只规定了项目和基本方法而没有合格标准，ICH和USP类似。第4页，此课件共45页哦ICH、USP、CP和EP中的方法验证ICH Q2(R1)：Validation of analytical procedures:Text and Methodology2005/11ICH Q2A：Text on Validation of analytical procedure(Parent Guideline)-1994/10ICH Q2B：Validation of analytical procedure：Methodology(Develop to complement the Parent guideline)1996/11USP Validation of compendial ProcedureEuropean Directorate for the Quality of Medicines&HealthcarePA/PH/OMCL(05)47 DEFValidation of analytical procedure2005/06第5页，此课件共45页哦分析方法验证的要求目的：证明所用的分析方法适用于相应的检测要求需验证的分析项目：鉴别试验杂质定量或限度检查，原料或制剂中有效成分含量测定制剂中其他成分（降解产物、防腐剂）的测定溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等的测试方法第6页，此课件共45页哦分析方法验证的要求验证内容：准确度精密度专属性检测限定量限线性范围耐用性第7页，此课件共45页哦准确度 精密度第8页，此课件共45页哦准 确 度（Accuracy）准确度是指该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率表示测定回收率R（recovery）的具体方法一般采用回收试验法和加样回收法进行数据要求：规定范围内，至少用9次测定结果评价，如制备高、中、低三个不同浓度样品各测三次第9页，此课件共45页哦准 确 度（Accuracy）回收试验法：空白+已知量A的对照品测定，测定值为M回收率计算公式：加样回收法：在已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M回收率计算公式：第10页，此课件共45页哦含量测定方法的准确度（Accuracy）原料药：可用已知纯度的对照品或样品进行测定或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较制剂：可用已知量被测物的各组分混合物进行测定，即采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法，如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，或与另一个已建立准确度的方法比较结果第11页，此课件共45页哦精 密 度（Precision）精密度：是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差(d)、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)(变异系数，CV)表示计算公式：第12页，此课件共45页哦精 密 度（Precision）重复性（repeatability）：在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度：将同一份供试品溶液重复测定6次，计算相对标准偏差。由一位分析人员将同一均匀样品重复称样制备供试品溶液 6份，每份测定一次，计算相对标准偏差，即得。把被测物浓度当做100%，至少测6次进行评价第13页，此课件共45页哦精 密 度（Precision）重现性（Reproducibility）：不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度：在不同实验室由两位检验人员将同一均匀样品分别重复称样制备供试品溶液六份，每份测定一次，分别计算平均值及相对标准偏差，即得。设计中间精密度试验应该注意的事情：样本量人员设备时间把被测物浓度当做100%，至少测6次进行评价第14页，此课件共45页哦精 密 度（Precision）重现性（Reproducibility）：不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度：在不同实验室由两位检验人员将同一均匀样品分别重复称样制备供试品溶液六份，每份测定一次，分别计算平均值及相对标准偏差，即得。此项方法仅用于方法传递 数据要求：需报告SD、RSD和置信区间第15页，此课件共45页哦专属性（Specificity）专属性：指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，是指该法用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量通常是通过分析含有加了杂质、降解产物、有关化学物质或安慰剂成分的样品，将所获分析结果与未加前述成分之样品的测试结果比较，两组测试结果之差即为专属性根据方法规定，同条件下测定普通空白样，特殊条件空白样（如设定：普通空白样在60条件下放置两周）、对照品、标准样品、可能的杂质、降解产物等，对照测定结果，良好的专属性应表现为其他各种组分均不干扰被测物的测定。如在液相色谱图谱中，普通空白样、特殊条件空白样、有关物质、内标、被测物对照品均应得到良好分离，如方法同时用于有关物质限度的测定，则要求各有关物质峰和可能存在的空白干扰峰均应完全分离，互不干扰。第16页，此课件共45页哦专属性（Specificity）鉴别反应：应能与可能共存的物质或结构相似化合物区别，不含被分析样品，以及结构相似或组分中的有关化合物，均应成负反应。含量测定与杂质测定：色谱法和其他方法，应附典型图谱，亦说明专属性。图中应标明各组分的位置，色谱法中的分离度应符合要求。杂质可获得的情况下，对于含量测试，试样中可加入杂质或辅料，考察测试结果是否受干扰；对于杂质测定，也可向试样中加入一定量的杂质，考察杂质间是否得到分离；反之则需用其他方法进行比较。色谱峰纯度试验（二极管阵列、质谱）。第17页，此课件共45页哦检 测 限（Detection Limit LOD）检测限是指试样在确定的实验条件下，被测物能被检测出的最低浓度或含量。他是限度检验效能指标，无需定量测定，只要指出高于或低于该规定浓度即可。非仪器目视法：用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量信噪比法：用于能显示基线噪音的分析方法（仪器分析方法）是把已知浓度试样测出的信号与空白样品测出的最低浓度或量，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比3:1或2:1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。标准差法：测定背景10次以上，求出标注差 将乘以3倍 在工作曲线上求出3相对应的浓度X；即为检限 将求得的对应浓度值加上空白值（空白值为零则不加），即得检出限第18页，此课件共45页哦定 量 限（Quantitation Limit LOQ）定量限是指试样在确定的实验条件下，被测物能被定量测定最低浓度或含量。结果具有一定的准确度和精密度的要求。非仪器目视法：用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的符合准确度和精密度要求的最低浓度或量。信噪比法：一般以信噪比10:1时相应浓度或注入仪器的量确定定量限，也可以用仪器所测空白背景响应标准差（SD）的10倍为估计值，再经试验确定方法的实际测定下限。第19页，此课件共45页哦线 性（Linearity）线性是指在设计范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。也是证明被测物的浓度和检测器响应的线性关系，必须制备不少于5种浓度，包括50%、100%150%，线性在分析方法的范围内进行。评价。线性关系应以信号对被分析物的浓度或含量作图，根据图形是否呈线性进行评价，再用最小二乘法处理数据求得回归曲线的斜率来表示。必要时可对响应信号进行数学转换数据要求：至少需要五个浓度考察线性，需提供相关系数，截距，回归斜率及方差等参数，应列出回归方程和线性图第20页，此课件共45页哦范 围（Range）范围：是指达到一定的精确度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高、低限浓度或量的区间。范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果和要求确定。原料药和制剂含量测定范围为80%120%；制剂含量均匀度范围为70%130%；杂质测定应为被测杂质报告值到限度的120%溶出度应为测定范围的20，如规定了限度范围，应为下限的-20%至上线的+20%第21页，此课件共45页哦耐 用 性（Robustness）耐用性：又称粗放度，是指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据，是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下试验结果重现性的尺度；如果方法易受到分析条件的影响或要求苛刻，应注明。典型的变动包括：-分析溶液的稳定性 用不同时间段的样品和标准品溶液与新制的标准品溶 液的对比结果来分析溶液的稳定性第22页，此课件共45页哦耐 用 性（Robustness）-液相色谱的典型变动 流动相pH（0.5）流动相组成（有机相5%）色谱柱温度（5）检测波长（5nm）气相色谱的典型变动色谱柱同厂家温度流速第23页，此课件共45页哦检验项目和验证内容总结中国药典中国药典鉴别鉴别杂质定杂质定量测定量测定杂质限杂质限度测定度测定含量含量溶出度溶出度等等校正因校正因子子准确度准确度精密度精密度-重复重复性性精密度精密度-中间中间精密度精密度专属性专属性检测限检测限定量限定量限线性线性范围范围耐用性耐用性第24页，此课件共45页哦检验项目和验证内容总结USP鉴别鉴别杂质定量杂质定量测定测定杂质限度杂质限度测定测定含量含量溶出度等溶出度等准确度准确度*精密度精密度-重复性重复性精密度精密度-中间精中间精密度密度专属性专属性*检测限检测限*定量限定量限*线性线性*范围范围*第25页，此课件共45页哦分析方法验证步骤预验证验证方案的制定 -验证目的、背景 -验证设施、试剂、对照品、样品信息 -待验证的方法、项目、可接受标准 -实施人员和计划 -实施人员及培训 -参考文献验证实施收集完整的验证过程记录和原始图谱数据和记录的复核验证结果的评估根据验证报告制定检验标准第26页，此课件共45页哦分析方法验证注意要点预验证：预验证是指在正式验证之前进行的试验，目的是收集证据，以初步证实该检验方法可以达到预期要求，同时确定各个项目的可接受标准。空白样：空白样是指根据样品的特性、配方和工艺过程，制备除了不含被测物外其他组成与样品完全一致的模拟样品。取样效率:取样效率仅用于清洁验证所用检验方法的验证，是指用棉签或特定溶剂从设备表面获取的被测物的量与设备表面被测物的实际含量接近的程度，以回收率（%）表示。第27页，此课件共45页哦含量测定方法验证的可接受标准准确度：各浓度下的平均回收率均应在98%102%之间。9个回收率数据的相对标准偏差（RSD）应不大于2.0%精密度：重复性：6份供试品液含量的相对标准偏差应不大于2.0%中间精密度：12个含量数据相对标准偏差应不大于2.0%检测限：主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3定量限：主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10第28页，此课件共45页哦含量测定方法验证的可接受标准线性：回归线的相关系数应不得小于0.998，Y轴截距应在100%响应值的2%以内，相应因子的相对标准偏差应不大于2.0%耐用性：主峰拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离，各条件下的含量数据（n=6）的相对标准偏差应不大于2.0%系统适应性：主峰峰面积的相对标准偏差应不大于2.0%，主峰保留时间的相对标准偏差应不大于1.0%，另外主峰拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离，主峰理论塔板数应符合质量标准的规定。第29页，此课件共45页哦分析方法确认方法确认是一种简化了的方法验证，目的是为了确认药典方法或其他方法是否适用于实际使用环境。各国药典和行业法规收载的检验方法。从外部引入的已经验证的检验方法。以往老品种的检验方法，原厂无力或无法进行方法传送。方法确认一般应进行准确度、重复性、专属性的测试第30页，此课件共45页哦如何对不需要验证的检验方法做确认方法确认是一种简化了的方法验证，对不需要进行验证的检验方法以及药典方法和其他已验证的法定方法，通过方法确认来证明在本实验室条件下的适用性。方法确认方法确认一般应进行准确度、重复性、专属性的测试，操作及限度要求同方法验证。对于特殊检验方法，确认项目及限度可作适当调整，以确认方案为准。第31页，此课件共45页哦如何对不需要验证的检验方法做确认法定来源的检验方法已经过法定机构的方法验证，方法本身的可靠性准确性已得到确认，以含量为例，一般应确认准确度，系统重复性，分析重复性、专属性。确认目的：1.确认你的产品是否适应这个检查方法，尤其是制剂处方中的辅料是否对检查结果有干扰。2.确认你的实验室的条件是否用这个检测方法获得准确的结果，包括仪器、设备、环境、人员等方面。第32页，此课件共45页哦哪些检验项目不需要做方法确认 物理量检查（pH、熔点、相对密度、粘度、颜色）-其基本理论已经多方验证，所以无需在验证、确认或传送，但必须保证测定值在所用仪器的量程范围内，仪器必须定期校验且校验结果符合要求。如果已使用多年的检验方法能确保检验数据的准确性、可靠性，不需要再补充确认。其他如干燥失重、炙灼残渣等实验室日常测试步骤不需方法确认。第33页，此课件共45页哦分析方法转移 分析方法转移是指一方将已经验证的方法转移给另一方的过程。分析方法转移主要进行不同实验室在一定时限内对同一份样品的重现性测试的结果对比。第34页，此课件共45页哦微生物分析方法验证 验证目的：满足法规要求的基础上，保证检验结果的准确性和有效性，确保产品及检验环境等符合相应的标准要求 微生物方法验证内容：无菌制剂微生物检测方法验证非无菌制剂微生物检测方法验证防腐剂效能试验方法验证消毒剂效力测试方法验证环境检测方法验证清洁验证时微生物检测方法有效 性验证第35页，此课件共45页哦分析方法验证成功的前提第36页，此课件共45页哦分析方法验证成功的前提 按法规指导原则制定分析方法验证方案清晰的描述了各项验证的实验制定了各项验证实验的可接受标准分析方法验证方案已经经过批准在验证过程中，没有验证偏离，如果需要改变验证过程需要执行变更程序。所用的样品和试剂、数据都是真实的和符合要求的第37页，此课件共45页哦影响因素试验强降解试验条件热：视各原料药的熔点，不应超过100，多选用40和60，降解时间一般不少于24小时热和湿：多选用40 75%和60 75%，降解时间一般不少于7天l按ICH光照条件要求，视光照箱辐射能力而定时间，达到1.2106 lx或紫外光200瓦小时/平方米的条件第38页，此课件共45页哦影响因素试验强降解试验条件氧化：1%至3%的双氧水，在30,124小时酸降解：0.01mol/L至0.1mol/L盐酸，在30,时间视分解程度而异碱性水解：0.01mol/L至0.1mol/L氢氧化钠，在30,时间视分解程度而异经酸碱破坏的样品需经中和后方可进行试验第39页，此课件共45页哦影响因素试验HPLC法含量测定强降解试验目标调节强降解条件，一般要求达到5%10%的分解无需检测物在各种强化条件下都能达到5%10%的分解，至少应有一种强化条件下的分解第40页，此课件共45页哦影响因素试验强降解后样品总量平衡用含量和杂质的分析方法检测同一条件下的分解样品，检验其方法的选择性、准确性和精确性，计算含量的降低与所产生的降解产物总量是否平衡强降解样品的峰纯度（DAD、LC-MASS）第41页，此课件共45页哦溶 液 稳 定 性标样和样品溶液的稳定性选择一定的储存条件：温度条件、存储容器标样溶液的稳定性：可接受标准99.0%101.0%样品溶液的稳定性：原料药可接受标准99.0%101.0%，制剂成品药98.0%102.0%将数据列表，归纳并作出结论，将溶液有效期写进检验方法中第42页，此课件共45页哦杂质分析方法验证除了需验证含量分析方法的所有项目外，还需进行定量限度在其最低浓度时检测物可被准确的，重复的和定量的检测到。原料药0.05%，RSD；NMT 10%制剂：0.080.10%RSD；NMT 10%第43页，此课件共45页哦报告阈报告阈的计算：按ICH规定，如果每天最大剂量中的原料药低于或等于1g时，其必须报告的限度时0.1%，任何杂质的含量在0.1和超过0.1%都必须列出并计入杂质总和如果每天最大剂量中的原料药超过1g时，其必须报告的限度时0.05%，必须报告至小数点后两位。通常分析方法中列出报告阈，但验证方法的定量限度，其浓度必须低于必须报告的限度浓度。第44页，此课件共45页哦分析方法验证报告完成验证项目后，写出其分析方法的验证报告列出各个验证项目的数据和单项验证结论附上典型图谱分析方法验证总结论分析方法验证过程中的变更、偏差及评价第45页，此课件共45页哦
