基因诊断 (2)课件.ppt

关于基因诊断(2)现在学习的是第1页，共69页第一节第一节基因诊断的概念基因诊断的概念及常用技术及常用技术现在学习的是第2页，共69页基因诊断基因诊断利用分子生物学技术，从利用分子生物学技术，从DNA/RNA水平检测基因的存在水平检测基因的存在,分分析基因的结构变异和表达状态，从而析基因的结构变异和表达状态，从而对疾病作出诊断。对疾病作出诊断。一、基本概念一、基本概念现在学习的是第3页，共69页二、基因诊断常用方法二、基因诊断常用方法核酸分子杂交核酸分子杂交PCRPCRDNADNA序列测定序列测定 DNADNA芯片技术芯片技术现在学习的是第4页，共69页(一一)核酸杂交核酸杂交基本原理基本原理-核酸变性和复性理论核酸变性和复性理论 即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。因此应用已知碱基序列的单链核苷酸片链结构。因此应用已知碱基序列的单链核苷酸片段作为探针，就可检测样本中是否存在与其互补段作为探针，就可检测样本中是否存在与其互补的同源核苷酸序列。的同源核苷酸序列。现在学习的是第5页，共69页probeprobe现在学习的是第6页，共69页核酸杂交的关键要素核酸杂交的关键要素probe DNAprobe DNAtarget DNAtarget DNAsignal detectionsignal detection现在学习的是第7页，共69页核酸杂交方法分类核酸杂交方法分类按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。类型。固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。现在学习的是第8页，共69页固相杂交分类固相杂交分类Southern 印记杂交Northern 印记杂交斑点杂交原位杂交现在学习的是第9页，共69页Southern blot是最经典的基因分析方法，不但能检出特异是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的的DNADNA片段，而且能进行定量和测定分子量，片段，而且能进行定量和测定分子量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。等。现在学习的是第10页，共69页Northern杂交用于用于RNARNA的检测，能对组织细胞中总的检测，能对组织细胞中总RNARNA或或mRNAmRNA进行定性和定量分析。进行定性和定量分析。现在学习的是第11页，共69页斑点杂交（斑点杂交（Dot blotDot blot）可用基因组中特定基因及其表达的定性及定量可用基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量少；其分析，方法简单、快速灵敏、样品用量少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不缺点是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。高，有一定比例的假阳性。现在学习的是第12页，共69页原位杂交原位杂交（Colony in situ hybridizationColony in situ hybridization）可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾病的诊断；原位杂交的结果是显示有关核酸序列病的诊断；原位杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的具体的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可检出基细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可检出基因和基因产物的亚细胞定位。因和基因产物的亚细胞定位。现在学习的是第13页，共69页（二）利用（二）利用PCR及结合其他技术进行基因及结合其他技术进行基因诊断诊断直接采用PCR进行基因诊断采用采用PCRPCR产物的限制性片段长度多态性分析（产物的限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLPs）进行基因诊断采用采用PCRPCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO）斑点杂交进行基因诊断 *通过通过PCRPCR产物的反相点杂交产物的反相点杂交(RBD)(RBD)进行基因诊断采用PCRPCR产物的单链构象多态性(SSCP)(SSCP)分析进行基因诊分析进行基因诊断断采用PCR技术对靶核酸进行定量分析技术对靶核酸进行定量分析现在学习的是第14页，共69页寡核苷酸杂交分析寡核苷酸杂交分析SNP和等位基因特异和等位基因特异寡核苷酸杂交寡核苷酸杂交（ASO）#现在学习的是第15页，共69页（三）（三）DNA序列测定序列测定 DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法，可以确定突变的部位，突变的性质。现在学习的是第16页，共69页（四（四）DNA芯片技术芯片技术 应用DNA芯片，可以检测基因的结构及其突变多态性，对基因表达的情况进行分析。现在学习的是第17页，共69页二二 基因诊断的特点基因诊断的特点高特异性高特异性高灵敏度高灵敏度获得稳定的结果获得稳定的结果早期快速早期快速适用性强，应用范围广适用性强，应用范围广现在学习的是第18页，共69页第二节第二节 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断现在学习的是第19页，共69页一、概述 人类的遗传病达数千种地中海贫血在意大利等国家发病率达10镰状细胞贫血在美国黑人中发病率达14我国常见的遗传性疾病有地中海贫血、异常血红蛋白病和血友病。有效治疗难；通过基因诊断进行携带者筛查，产前早期诊断，降低发病率。现在学习的是第20页，共69页二、镰状细胞贫血血红蛋白病（异常血红蛋白病）红细胞呈镰刀状，寿命短，引起溶血性贫血。患者多在成年以前死亡现在学习的是第21页，共69页Mst酶切位点酶切位点(CCTNAGG)53正常基因正常基因53突变基因突变基因1.15kb1.35kb（一）镰状红细胞贫血分子机制（一）镰状红细胞贫血分子机制5 67-Pro GluGlu-CCT GAG GAG-5 67-Pro AlaGlu-CCT GTG GAG-现在学习的是第22页，共69页（二）镰状细胞贫血的基因诊断方法限制性内切酶限制性内切酶/Southern blot采集制备血液DNA内切酶Mst消化电泳转膜32P标记的珠蛋白cDNA杂交放射自显影现在学习的是第23页，共69页+0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析现在学习的是第24页，共69页PCR/PCR/限制性内切酶限制性内切酶设计引物设计引物PCRPCRPCRPCR扩增扩增产物进行产物进行限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切电泳电泳电泳电泳EBEB染色染色直接观察直接观察例：例：例：例：引物引物1 1：5-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-35-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-35-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-35-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-3引物引物2 2：5-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-35-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-35-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-35-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-3扩增产物扩增产物294bp294bp镰状细胞贫血的基因诊断方法现在学习的是第25页，共69页引物引物1CCT GAG GAGCCT GTG GAG引物引物1引物引物2引物引物2294bp103bp191bpMst酶切位点酶切位点(CCTNAGG)现在学习的是第26页，共69页+103bp191bp294bp正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者镰状红细胞贫血患者PCR产物的限制性酶切分析产物的限制性酶切分析现在学习的是第27页，共69页RT-PCR/序列分析 采集制备血液RNART-PCR产物测序推测氨基酸序列进行诊断镰状细胞贫血的基因诊断方法现在学习的是第28页，共69页二、地中海贫血(Thalassaemia,简写thal或T)珠珠蛋蛋白白基基因因突突变变导导致致该该多多肽肽链链的的合合成成大大为为减减少少（）或完全缺失（）或完全缺失（）或完全缺失（）或完全缺失（0 0）珠珠蛋蛋白白合合成成速速率率降降低低，导导致致链链和和链链合合成成的的不不平平衡衡多多余余的的珠珠蛋蛋白白链链沉沉积积在在红红细细胞胞膜膜上上改改变变了了膜膜的的通通透性和硬度透性和硬度导致溶血性贫血。导致溶血性贫血。高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人；中国人群高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人；中国人群高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人；中国人群高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人；中国人群中又一广东、广西、四川、贵州等省发病率最高。中又一广东、广西、四川、贵州等省发病率最高。中又一广东、广西、四川、贵州等省发病率最高。中又一广东、广西、四川、贵州等省发病率最高。缺乏有效治疗措施。缺乏有效治疗措施。缺乏有效治疗措施。缺乏有效治疗措施。现在学习的是第29页，共69页（一）地贫病的分子基础珠蛋白基因全长珠蛋白基因全长2053bp，含，含2个内含子个内含子（IVSI和和IVS-II），），3个外显子。个外显子。目前发现突变有百余种，中国人群发现约目前发现突变有百余种，中国人群发现约20种；种；一般对特定种族来说，一般对特定种族来说，90%的的地贫基因仅地贫基因仅由由46种突变组成。种突变组成。现在学习的是第30页，共69页（二）地中海贫血的基因诊断PCR/ASO斑点杂交法合成2对PCR引物（扩增区段700bp和580bp，分别包含14种和1种可能突变）合成等位特异寡核苷酸(ASO)探针（46对，分别标记）制备DNA样品PCR扩增斑点印迹杂交RFLP分析法现在学习的是第31页，共69页三地中海贫血的基因诊断ac左侧缺失左侧缺失4.2kb右侧缺失右侧缺失3.7kbbbba2112N端端1C端端正常基因正常基因序列序列PCR扩增法定性分析左侧缺失型基左侧缺失型基因序列因序列右侧缺失型基右侧缺失型基因序列因序列ac扩增0.4kbab无扩增片段ab扩增1.2kb现在学习的是第32页，共69页+0.4kb1.2kb正常人正常人右侧缺右侧缺失患者失患者地中海贫血患者基因组的地中海贫血患者基因组的PCR分析分析左侧缺左侧缺失患者失患者现在学习的是第33页，共69页四、杜氏肌营养不良症（四、杜氏肌营养不良症（DMD）1.DMD是常见的性连锁隐性遗传病，是常见的性连锁隐性遗传病，2.主要特征是进行性肌萎缩和肠肌假性肥主要特征是进行性肌萎缩和肠肌假性肥大，大，XP21.2121.3区抗肌萎缩蛋白基因突区抗肌萎缩蛋白基因突变形式不同。变形式不同。DMD多在多在5岁发病，岁发病，10岁左右瘫痪，在岁左右瘫痪，在20岁左右由于心力和呼吸衰竭而死亡，其发病岁左右由于心力和呼吸衰竭而死亡，其发病率为活产男婴的率为活产男婴的1/3500。现在学习的是第34页，共69页（一）（一）DMD分子基础：分子基础：抗肌萎缩蛋白基因长约抗肌萎缩蛋白基因长约抗肌萎缩蛋白基因长约抗肌萎缩蛋白基因长约2900kb，含，含，含，含7979个外显子。抗个外显子。抗肌萎缩蛋白基因突变分为基因缺失型和非基因缺失肌萎缩蛋白基因突变分为基因缺失型和非基因缺失型。型。（1 1）DNA片段缺失（片段缺失（60%的病例的病例导致阅读框移码导致阅读框移码移码实变移码实变致致DMD，整码缺失，整码缺失BMDBMD）。缺失的）。缺失的2 2个热点区个热点区个热点区个热点区该基因该基因该基因该基因5端处端处45554555外显子范围内。外显子范围内。（2）非基因缺失型部分重复（病例的）非基因缺失型部分重复（病例的）非基因缺失型部分重复（病例的）非基因缺失型部分重复（病例的5%）现在学习的是第35页，共69页（1 1）基因组探针法）基因组探针法）基因组探针法）基因组探针法 用用用用XP21XP21区分离得到的不同探针如（区分离得到的不同探针如（区分离得到的不同探针如（区分离得到的不同探针如（P20P20）来进行相应内切酶）来进行相应内切酶）来进行相应内切酶）来进行相应内切酶酶谱分析、检出率取决于探针数和酶切位点数目。酶谱分析、检出率取决于探针数和酶切位点数目。酶谱分析、检出率取决于探针数和酶切位点数目。酶谱分析、检出率取决于探针数和酶切位点数目。（2 2）cDNAcDNA探针法探针法探针法探针法抗抗抗抗肌肌肌肌萎萎萎萎缩缩缩缩蛋蛋蛋蛋白白白白基基基基因因因因系系系系列列列列cDNAcDNA探探探探针针针针分分分分析析析析患患患患者者者者基基基基因因因因缺缺缺缺失失失失、外外外外显显显显子子子子拼接改变和基因内部分重复。拼接改变和基因内部分重复。拼接改变和基因内部分重复。拼接改变和基因内部分重复。（3 3）多重）多重）多重）多重PCRPCR法法法法如如如如有有有有人人人人设设设设计计计计多多多多对对对对引引引引物物物物进进进进行行行行多多多多重重重重PCRPCR扩扩扩扩增增增增该该该该基基基基因因因因的的的的9 9个个个个易易易易发发发发缺缺缺缺失失失失“热点区热点区热点区热点区”DNADNA片段，可检出片段，可检出片段，可检出片段，可检出80%80%有基因缺失的有基因缺失的有基因缺失的有基因缺失的DMDDMD患者。患者。患者。患者。（4 4）多态性分析法）多态性分析法）多态性分析法）多态性分析法基因内及其旁侧探针进行基因内及其旁侧探针进行基因内及其旁侧探针进行基因内及其旁侧探针进行RFLPRFLP连锁分析。连锁分析。连锁分析。连锁分析。（5 5）RTPCRRTPCR扩扩扩扩增增增增该该该该基基基基因因因因外外外外显显显显子子子子（全全全全长长长长2.4MB2.4MB、外外外外显显显显子子子子起起起起来来来来全全全全长长长长c14kbc14kb、用用用用多多多多对对对对引引引引物物物物）可可可可检检检检出出出出：外外外外显显显显子子子子拼拼拼拼接接接接异异异异常常常常。联联联联用用用用测测测测序序序序：可定位基因缺失的起始和终止。可定位基因缺失的起始和终止。可定位基因缺失的起始和终止。可定位基因缺失的起始和终止。现在学习的是第36页，共69页1 1、苯丙酮尿症是一种常见的隐性遗传性氨基酸代谢病。、苯丙酮尿症是一种常见的隐性遗传性氨基酸代谢病。、苯丙酮尿症是一种常见的隐性遗传性氨基酸代谢病。、苯丙酮尿症是一种常见的隐性遗传性氨基酸代谢病。2 2、主要特征：、主要特征：、主要特征：、主要特征：（1 1）苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸 酪氨酸酪氨酸酪氨酸酪氨酸多巴多巴多巴多巴儿茶酚胺儿茶酚胺儿茶酚胺儿茶酚胺 苯丙酮酸苯丙酮酸苯丙酮酸苯丙酮酸 酪胺酪胺酪胺酪胺 黑色素黑色素黑色素黑色素 （2 2）患患患患儿儿儿儿出出出出生生生生后后后后须须须须及及及及早早早早得得得得到到到到低低低低phephe饮饮饮饮食食食食治治治治疗疗疗疗，否否否否则则则则发发发发生生生生不不不不可可可可逆大脑损害和严重智力发育障碍逆大脑损害和严重智力发育障碍逆大脑损害和严重智力发育障碍逆大脑损害和严重智力发育障碍。苯丙氨酸苯丙氨酸羟化酶羟化酶（肝）（肝）五、苯丙五、苯丙酮尿症（酮尿症（PKU）现在学习的是第37页，共69页（一）PKU分子基础分子基础（1 1）迄迄迄迄今今今今约约约约3/4的的导导致致中中国国人人PKUPKU的的突突变变基基因因已已被被查查清清，它它们们分分属属11种种PAH基基基基因因因因点点点点突突突突变变变变。体体体体外外外外研研研研究究究究表表表表明明明明，这些突变导致这些突变导致这些突变导致这些突变导致PAH活力活力或丧失。或丧失。（2 2）PAHPAH第第 11外外 显显 子子 的的 第第399密密 码码GTA（val）GTTGTT（valval）中中性性突突变变：不不改改变变任任何何限限制制酶酶识识别别位位点点，故故又又称称“序序列列多多态态性性”。这这一一“序序列列多多态态性性”在在PKU患患者者和和正正常常人人中中存存在在着着连连锁锁不不平平衡衡性性，故故可可作作为为一一种种“遗遗传传标标记记”应应用用于于产前诊断。产前诊断。现在学习的是第38页，共69页PCR/ASO探探针针法法和和PCR-RFLP连连锁锁分分析析法。法。PCR/SSCP直直接接测测序序法法若若待待诊诊断断的的PKU家家系系的的基基因因突突变类型尚属变类型尚属“未知未知”或无或无RFLP信息。信息。（二）（二）PKU的的DNA诊断诊断现在学习的是第39页，共69页先合成ASO如：正常探针：TCCATTAACAGTAAGAATTT突变探针：TCCATTAACAATAAGAATTT利用利用PCR/ASO探针法诊断苯丙酮探针法诊断苯丙酮尿症尿症现在学习的是第40页，共69页利用利用PCR/ASO探针法诊断苯丙酮探针法诊断苯丙酮尿症尿症 健康男性健康男性 男性携带者男性携带者男性患者男性患者 健康女性健康女性 女性携带者女性携带者女性患者女性患者正常探针突变探针现在学习的是第41页，共69页第三节第三节 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断现在学习的是第42页，共69页1 1通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤慢粒：（染色体易位）费城染色体慢粒：（染色体易位）费城染色体PCRPCR检测融合基因检测融合基因2 2检测肿瘤相关基因检测肿瘤相关基因检测肿瘤相关基因检测肿瘤相关基因癌基因（癌基因（rasras）、抑癌基因（）、抑癌基因（p53p53）、肿瘤转移基因）、肿瘤转移基因3 3检测肿瘤相关病毒基因检测肿瘤相关病毒基因检测肿瘤相关病毒基因检测肿瘤相关病毒基因HBV HCVHBV HCV肝癌肝癌EBEB鼻咽癌鼻咽癌4 4检测肿瘤标志物基因或检测肿瘤标志物基因或检测肿瘤标志物基因或检测肿瘤标志物基因或mRNAmRNA 肝癌肝癌甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFPAFP）结肠癌结肠癌癌胚抗原（癌胚抗原（CEACEA）肿瘤基因诊断的策略肿瘤基因诊断的策略现在学习的是第43页，共69页1.肿瘤标记物基因的检测肿瘤标记物基因的检测着丝粒着丝粒 染色体染色体 22 bcr genec-abl gene 染色体染色体 9 bcr-mRNA bcr-abl mRNA 染色体染色体 9,22 bcr-abl 融合蛋白（具融合蛋白（具PTK活性）活性）慢性骨髓白血病慢性骨髓白血病 引物A 引物 B现在学习的是第44页，共69页2癌基因和抑癌基因的检测癌基因和抑癌基因的检测ras癌基因的检测癌基因的检测ras基因中最常见的点突变是第基因中最常见的点突变是第基因中最常见的点突变是第基因中最常见的点突变是第1212，1313或或或或6161密码子突变密码子突变密码子突变密码子突变检测方法：检测方法：检测方法：检测方法：1.1.PCR/ASOPCR/ASO2.2.PCR-SSCP现在学习的是第45页，共69页 p53的检测的检测p53基因突变主要为点突变，热点区域位于密码子基因突变主要为点突变，热点区域位于密码子130290，以，以175、273、284最多见最多见检测方法：检测方法：1.1.PCRSSCPPCRSSCP2.PCR测序测序3.3.PCRRFLPPCRRFLP现在学习的是第46页，共69页 其它基因的其它基因的 检测检测PCR结合其它技术结合其它技术基因芯片基因芯片现在学习的是第47页，共69页4、肿瘤标志物检测或、肿瘤标志物检测或mRNA诊断诊断肿瘤标志物肿瘤标志物肿瘤标志物肿瘤标志物是由肿瘤组织细胞产生的、与肿瘤形成和发展相是由肿瘤组织细胞产生的、与肿瘤形成和发展相是由肿瘤组织细胞产生的、与肿瘤形成和发展相是由肿瘤组织细胞产生的、与肿瘤形成和发展相关的物质，包括肿瘤抗原、激素、酶、同工酶等。关的物质，包括肿瘤抗原、激素、酶、同工酶等。关的物质，包括肿瘤抗原、激素、酶、同工酶等。关的物质，包括肿瘤抗原、激素、酶、同工酶等。基因标志和基因表型标志（胚胎性抗原）基因标志和基因表型标志（胚胎性抗原）基因标志和基因表型标志（胚胎性抗原）基因标志和基因表型标志（胚胎性抗原）检测方法：检测方法：检测方法：检测方法：1.1.PCRASOPCRASO2.2.PCRPCR测序测序测序测序3.3.PCRRFLPPCRRFLP4.4.PCRPCRSSCPSSCP现在学习的是第48页，共69页第四节第四节 感染性疾病的感染性疾病的基因诊断基因诊断现在学习的是第49页，共69页一、感染性疾病基因一、感染性疾病基因诊断的策略诊断的策略1.针对病原体特异的核酸序列设计探针进行针对病原体特异的核酸序列设计探针进行杂交杂交2.应用应用PCR技术扩增病原体基因保守序列技术扩增病原体基因保守序列3.核酸杂交技术与核酸杂交技术与PCR技术联合应用技术联合应用现在学习的是第50页，共69页特点简便、特异、快捷能检测出潜在的病原体可对病原体进行分类、分型鉴定不能得知病原体进入体内后机体的反应现在学习的是第51页，共69页二、基因诊断的感染性疾病（一）、病毒特点：1.1.分离培养周期长，操作繁杂，制约因素多周期长，操作繁杂，制约因素多2.2.电镜观察电镜观察直观快速，但昂贵3.3.免疫学诊断免疫学诊断简便快速，但存在问题：不易检出潜伏期的病毒有些病毒亚型多，抗原变异性大有些病毒亚型多，抗原变异性大整合进入人基因组的病毒现在学习的是第52页，共69页病毒核酸分析技术HBV包含4个开放阅读框，S、C、P、XPCRPCR/限制性内切酶谱分析PCR/点杂交,PCR/Southern blot基因芯片目的基因目的基因引物序列引物序列扩增片段扩增片段C C5ACTGTTCAAGCCTCCAAGCT35ACTGTTCAAGCCTCCAAGCT3425 425 bpbp5AGTGCGAATCCACACTC35AGTGCGAATCCACACTC3现在学习的是第53页，共69页 调节和调节和调节和调节和启动转录启动转录启动转录启动转录 LTR gag pol env tat，rev LTR 长末端长末端长末端长末端重复序列重复序列重复序列重复序列调节蛋白基因调节蛋白基因正常的病毒基因正常的病毒基因正常的病毒基因正常的病毒基因产生病毒产生病毒产生病毒产生病毒核心蛋白核心蛋白核心蛋白核心蛋白产生逆转录产生逆转录产生逆转录产生逆转录酶和整合酶酶和整合酶酶和整合酶酶和整合酶 产生病毒产生病毒产生病毒产生病毒 外膜蛋白外膜蛋白外膜蛋白外膜蛋白附加基因附加基因附加基因附加基因*HIV*HIV病毒基因组结构病毒基因组结构现在学习的是第54页，共69页目的基因目的基因引物序列引物序列扩增片段扩增片段envenv5ACAATTATTGTCTGGTATAG35ACAATTATTGTCTGGTATAG3135 135 bpbp5AGGTATCTTTCCACAGCCAG35AGGTATCTTTCCACAGCCAG3HIV-1HIV-1Probe TGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAGPCR/核酸杂交诊断艾滋病现在学习的是第55页，共69页SARSRTPCR 多重PCR 荧光定量PCR现在学习的是第56页，共69页（二）、细菌细菌性痢疾志贺菌，侵袭性大肠杆菌，大质粒；PCR结核病PCR 现在学习的是第57页，共69页（三）、寄生虫 重复序列探针法、寡核苷酸探针法、基因组探针法、PCR现在学习的是第58页，共69页第五节第五节 基因诊断策略基因诊断策略现在学习的是第59页，共69页（一）检测致病基因突变（一）检测致病基因突变基因变异致病的类型：基因变异致病的类型：1.内源基因的变异内源基因的变异基因结构的突变基因结构的突变基因结构的突变基因结构的突变点突变、插入、缺失、重排、异位点突变、插入、缺失、重排、异位点突变、插入、缺失、重排、异位点突变、插入、缺失、重排、异位基因表达异常基因表达异常基因表达异常基因表达异常mRNAmRNA剪接异常剪接异常剪接异常剪接异常2.外源基因的插入外源基因的插入现在学习的是第60页，共69页点突变的诊断点突变的诊断诊断已知的点突变诊断已知的点突变（PCR）一对探针一对探针突变碱基置探针中央突变碱基置探针中央控制杂交条件控制杂交条件结果分析：结果分析：反向杂交技术反向杂交技术现在学习的是第61页，共69页诊断未知的突变诊断未知的突变 PCR/测序测序DNA芯片技术芯片技术现在学习的是第62页，共69页分析与疾病连锁的遗传标志分析与疾病连锁的遗传标志 对于还不清楚基因的多数基因病，可通对于还不清楚基因的多数基因病，可通过检测与特定染色体位点连锁的遗传标过检测与特定染色体位点连锁的遗传标记来进行基因诊断。记来进行基因诊断。基基本本方方法法：PCR产产物物酶酶切切产产物物电电泳泳分分析析。基基因因连连锁锁分分析析（PCR/RFLP连连锁锁分析法）分析法）现在学习的是第63页，共69页（三）建立多基因疾病表型克隆（三）建立多基因疾病表型克隆一些多基因、多因素疾病，不仅涉及多个基因还涉及一些环境因素及其与基因的相互作用。表型克隆从分析正常与异常基因组的相同或差异，找到正常人与疾病患者之间的差异序列和相同序列，进而分离、鉴定与疾病相关的多个基因，确定导致疾病的分子缺陷。现在学习的是第64页，共69页定量分析致病基因的表达水平定量分析致病基因的表达水平 1.1.mRNA的相对定量分析的相对定量分析斑点杂交或狭缝杂交斑点杂交或狭缝杂交斑点杂交或狭缝杂交斑点杂交或狭缝杂交RTPCR2.mRNA的绝对定量分析的绝对定量分析RTPCR/竞争性竞争性PCR3.mRNA长度分析长度分析Northern杂交杂交/RTPCR产物电泳产物电泳产物电泳产物电泳现在学习的是第65页，共69页第六节基因诊断的应用前景第六节基因诊断的应用前景现在学习的是第66页，共69页一、基因诊断技术的发展史20世纪80年代初以前，DNA分子杂交、RFLPPCR技术建立和完善后PCR基因芯片技术的建立高通量密集型技术现在学习的是第67页，共69页二、基因诊断技术的前景人类基因组计划的完成功能基因组计划的进行现在学习的是第68页，共69页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第69页，共69页