目的基因的获得酵母双杂交.ppt

关于目的基因的获得酵关于目的基因的获得酵母双杂交母双杂交现在学习的是第1页，共61页 酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母酵母中进行的，中进行的，研究研究活细胞内活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过间的作用也能通过报告基因报告基因的表达产物敏感地检测得到。的表达产物敏感地检测得到。一、酵母双杂交系统简介一、酵母双杂交系统简介 它是一种具有它是一种具有很高灵敏度很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。的研究蛋白质之间关系的技术。该技术既可用来研究该技术既可用来研究哺乳动物哺乳动物基因组编码的蛋白质基因组编码的蛋白质之间的相互作用，也可用来研究之间的相互作用，也可用来研究高等植物高等植物基因组编码的蛋基因组编码的蛋白质之间的相互作用。白质之间的相互作用。现在学习的是第2页，共61页经典文献出处经典文献出处n nFields S,Song O.A novel genetic system to detect protein-protein interactions.Nature,1989,340(6230):245-246 二、酵母双杂交系统的建立二、酵母双杂交系统的建立现在学习的是第3页，共61页 该系统的建立是基于对真核生物该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始调控转录起始过程的认过程的认识。真核生物基因转录需要识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子反式转录激活因子的参与，真的参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域：核生长转录因子含有两个不同的结构域：转录激活因子转录激活因子DNA结合结构域结合结构域(BD)(DNA binding domain)转录激活结构域转录激活结构域(AD)(activation domain)1989年美国纽约州立大学的年美国纽约州立大学的Fields和和Song首先描述了酵母双杂首先描述了酵母双杂交系统交系统(yeast two-hybrid system)。现在学习的是第4页，共61页 这两个结构域各具功能，互不影响，单独这两个结构域各具功能，互不影响，单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价共价或非共价键连接建立起来的空间结构或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。能。现在学习的是第5页，共61页n n目前酵母双杂交实验采用的系统有目前酵母双杂交实验采用的系统有目前酵母双杂交实验采用的系统有目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA LexA 系统系统系统系统和和和和Gal4 系系统统两种。两种。两种。两种。n n在在LexA 系统中，系统中，系统中，系统中，DNA 结合域由一个完整的原核蛋白结合域由一个完整的原核蛋白结合域由一个完整的原核蛋白结合域由一个完整的原核蛋白LexA LexA 构成，转录激活域则由一个构成，转录激活域则由一个构成，转录激活域则由一个构成，转录激活域则由一个88 个氨基酸的酸性的大个氨基酸的酸性的大个氨基酸的酸性的大个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽肠杆菌多肽肠杆菌多肽肠杆菌多肽B42 B42 构成，它在酵母中可以活化基因的转构成，它在酵母中可以活化基因的转录录;n n在在在在Gal4 Gal4 系统中，系统中，BD BD 和和AD AD 分别由分别由分别由分别由Gal4Gal4蛋白上不同的两蛋白上不同的两蛋白上不同的两蛋白上不同的两个结构域个结构域个结构域个结构域(1-147aa(1-147aa 与与与与768-881aa)构成。构成。现在学习的是第6页，共61页 两个结构域中的两个结构域中的BD由位于由位于N-末端的末端的1147位多肽构成，位多肽构成，能识别位于能识别位于Gal4基因的上游激活序列基因的上游激活序列(upstream activation sequence，UAS)。此外，在其此外，在其N-端还具有一段端还具有一段核定位序列核定位序列。AD由位于由位于C-末端的末端的768881位多肽构成。位多肽构成。Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能恢复上充分接近，则能恢复Gal4作为转录因子的活性。作为转录因子的活性。Gal4为酵母为酵母半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因gal1的的转录激活因子转录激活因子，天然的，天然的Gal4分子是由一条由分子是由一条由881个氨基酸残基个氨基酸残基组成的多肽链。组成的多肽链。现在学习的是第7页，共61页 Fields和和Song将两个融合蛋白分别构建在穿梭将两个融合蛋白分别构建在穿梭质粒上，一个是将质粒上，一个是将Gal4的的DNA-BD与酵母蛋白与酵母蛋白SNF1融合；另一个是将融合；另一个是将Gal4的的AD和酵母蛋白和酵母蛋白SNF4融合。融合。其中，其中，SNF1是一种丝氨酸是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，苏氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一个结合蛋白，是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是已知可以这两种蛋白是已知可以相互作用的。相互作用的。现在学习的是第8页，共61页 当两种穿梭质粒共转化含有当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报告基因结合位点的报告基因LacZ的酵母菌株的酵母菌株后，通过后，通过SNFl与与SNF4的相互作用，的相互作用，Gal4的的DNA-BD与与Gal4的的AD靠近靠近,形成一个大的复合物形成一个大的复合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。Gal4的的DNA-BD可识别位于可识别位于Gal4效应基因的效应基因的UAS，并可，并可与之结合；与之结合；Gal4的的AD则可与转录复合物中其他成分结合，激活则可与转录复合物中其他成分结合，激活UAS下游报告基因下游报告基因LacZ的转录。的转录。现在学习的是第9页，共61页三、酵母双杂交系统的原理三、酵母双杂交系统的原理ADYADYXDNA-BDGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS)reporter genetranscriptionGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS)reporter geneGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS)reporter geneXDNA-BD现在学习的是第10页，共61页许多真核生物的许多真核生物的转录激活因子转录激活因子都是由两个在都是由两个在结构结构上可以分开上可以分开的、的、功能上也相互独立的结构域功能上也相互独立的结构域组成。组成。1.结构域（结构域（Domain）合作）合作现在学习的是第11页，共61页例如：例如：啤酒酵母的啤酒酵母的半乳糖苷酶半乳糖苷酶基因激活因子基因激活因子GAL4:DNA binding domainActive domainNC1-147aa768-881aa上游激活序列（上游激活序列（UAS）转录激活转录激活GAL4效应基因效应基因结合结合结合结合激活转录激活转录实验发现：实验发现：转录表达转录表达只要只要DNA binding domain（DNA-BD）与与Active domain（AD）靠近就能激活转录。）靠近就能激活转录。现在学习的是第12页，共61页2.拆开拆开 DomainDNA binding domainActive domain上游激活序列（上游激活序列（UAS）转录激活转录激活GAL4效应基因效应基因结合结合用重组用重组DNA技术把技术把GAL4的两个的两个Domain分开，就分开，就丧失丧失了激活效应基因的能力。了激活效应基因的能力。不能转录不能转录现在学习的是第13页，共61页3.重组重组Domain用重组用重组DNA技术把这两个技术把这两个Domain分别与两个不同的分别与两个不同的多肽连接。多肽连接。Active domain蛋白蛋白A蛋白蛋白BDNA binding domain在体内，蛋白在体内，蛋白A与蛋白与蛋白B是否能结合。是否能结合。4.观察报告基因表达观察报告基因表达现在学习的是第14页，共61页GAL4的的BD domain与与AD Domain也不能靠近，也不能靠近，所所以仍然不能启动效应基因的转录。以仍然不能启动效应基因的转录。（1）如果蛋白）如果蛋白A与蛋白与蛋白B不能相互结合不能相互结合（2）如果蛋白）如果蛋白A与蛋白与蛋白B能相互结合能相互结合上游激活序列（上游激活序列（UAS）转录激活转录激活GAL4效应基因效应基因蛋白蛋白ADNA binding domain转录激活转录激活domain蛋白蛋白B激活转录激活转录转录表达转录表达现在学习的是第15页，共61页X基因和基因和基因和基因和Y Y基因产物的基因产物的基因产物的基因产物的相互结合，导致相互结合，导致相互结合，导致相互结合，导致reporter genereporter gene表达。表达。表达。表达。Reporter gene表达就说表达就说明明X基因产物与基因产物与Y基因产基因产物能结合。物能结合。双杂交原理双杂交原理现在学习的是第16页，共61页现在学习的是第17页，共61页酵母细胞酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点:v 易于转化、便于回收扩增质粒易于转化、便于回收扩增质粒v 具有可直接进行选择的具有可直接进行选择的标记基因标记基因和特征性和特征性报告基因报告基因v 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相 互结合互结合报道株报道株经经改造改造的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞现在学习的是第18页，共61页v 基因组中基因组中GAL4基因基因是缺失型的是缺失型的v 基因组中引入额外的报告基因基因组中引入额外的报告基因LEU、TRP、HIS改造后的酵母细胞的特点：改造后的酵母细胞的特点：通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落现在学习的是第19页，共61页 表达表达“诱饵诱饵”和和“猎物猎物”蛋白；蛋白；检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报告基因。检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报告基因。做法：首先构建能表达做法：首先构建能表达“诱饵诱饵”和和“猎物猎物”蛋白的表蛋白的表达载体。该载体中可加入进行营养型筛选的基因。达载体。该载体中可加入进行营养型筛选的基因。四、酵母双杂交系统的基本策略四、酵母双杂交系统的基本策略现在学习的是第20页，共61页五、酵母双杂交系统的优点五、酵母双杂交系统的优点1.高敏感性。高敏感性。原因：原因：2.采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白过量表达；过量表达；3.激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物，激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物，之后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋白各组分之后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定；间结合更趋于稳定；4.通过通过mRNA使信号放大；使信号放大；5.检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测存在检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。现在学习的是第21页，共61页五、酵母双杂交系统的优点五、酵母双杂交系统的优点2.真实性。真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。3.简洁性。简洁性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤。蛋白质的繁琐步骤。4.广泛性。广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。现在学习的是第22页，共61页 分析分析已知蛋白已知蛋白之间的相互作用之间的相互作用 对蛋白质对蛋白质功能域的分析功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点突变或，如可将待测蛋白质进行点突变或缺失突变再进行双杂交。缺失突变再进行双杂交。用已知功能蛋白质用已知功能蛋白质筛选双杂交筛选双杂交cDNA文库文库，研究蛋白质，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。之间相互作用的传递途径，发现新基因。分析分析新基因的生物学功能新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛。即以功能未知的新基因去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。绘制绘制蛋白质相互作用系统图谱蛋白质相互作用系统图谱 在在药物设计药物设计中的应用中的应用六、酵母双杂交系统的应用现状六、酵母双杂交系统的应用现状现在学习的是第23页，共61页1.利用酵母双杂交发现新的蛋白质与蛋白质利用酵母双杂交发现新的蛋白质与蛋白质的新功能的新功能 将已知基因作为将已知基因作为诱饵诱饵，在选定的，在选定的cDNA文库中筛选与文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到以分离得到AD-文库载体，并从载体中进一步克隆得到文库载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。上的联系。现在学习的是第24页，共61页 利用酶联免疫（利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可研究抗原和抗体之间的相互作用抗原和抗体间的免疫反应，可研究抗原和抗体之间的相互作用，但它们都是基于用，但它们都是基于体外非细胞体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在质的相互作用。而在细胞体内细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。以通过酵母双杂交进行检测。2.利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和 抗抗体的相互作用体的相互作用现在学习的是第25页，共61页3.利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响药物对蛋白质之间相互作用的影响 对于能够引发疾病反应的蛋白相互作用可采对于能够引发疾病反应的蛋白相互作用可采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。治疗疾病的目的。现在学习的是第26页，共61页4.利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map）基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序序列。列。利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。现在学习的是第27页，共61页七、酵母双杂交系统中常见问题的解决七、酵母双杂交系统中常见问题的解决和改进措施和改进措施（一）（一）假阳性较多假阳性较多（二）（二）转化效率偏低转化效率偏低（三）（三）阴性干扰阴性干扰现在学习的是第28页，共61页假阳性定义：假阳性定义：在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因仍被激活。的情况下，报告基因仍被激活。（一）（一）假阳性较多假阳性较多 BD融合诱饵蛋白的单独激活作用。这种融合蛋白的激活作融合诱饵蛋白的单独激活作用。这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。用被外来蛋白激活。如如AD融合靶蛋白有融合靶蛋白有DNA的特异性结合，则可单独激活的特异性结合，则可单独激活报告基因的表达。报告基因的表达。AD融合蛋白直接与转录因子作用激活报告基因；融合蛋白直接与转录因子作用激活报告基因；AD融合靶蛋白与融合靶蛋白与BD相互作用或者相互作用或者AD与与BD融合蛋白之融合蛋白之间的相互作用，尤其是后者带来许多假阳性。间的相互作用，尤其是后者带来许多假阳性。原因原因：现在学习的是第29页，共61页排除假阳性的措施排除假阳性的措施 作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。基因的鉴定。采用多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不采用多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同。目前试剂公司已采用。相同。目前试剂公司已采用。报告基因整合到染色体上，可使基因表达水平稳定。报告基因整合到染色体上，可使基因表达水平稳定。优化优化3-AT(3-aminotriazole，3-氨基三唑氨基三唑)浓度。适当增加浓度。适当增加浓度可减少假阳性。浓度可减少假阳性。现在学习的是第30页，共61页n n进一步分析：进一步分析：n n这种相互作用是否会在细胞内自然发生。这种相互作用是否会在细胞内自然发生。这种相互作用是否会在细胞内自然发生。这种相互作用是否会在细胞内自然发生。n n有些蛋白依赖于泛素的蛋白酶降解途径成员，它们有些蛋白依赖于泛素的蛋白酶降解途径成员，它们有些蛋白依赖于泛素的蛋白酶降解途径成员，它们有些蛋白依赖于泛素的蛋白酶降解途径成员，它们具有普遍的蛋白间的相互作用。具有普遍的蛋白间的相互作用。具有普遍的蛋白间的相互作用。具有普遍的蛋白间的相互作用。n n 一些实际没有相互作用的蛋白但有相同的模体蛋白一些实际没有相互作用的蛋白但有相同的模体蛋白一些实际没有相互作用的蛋白但有相同的模体蛋白一些实际没有相互作用的蛋白但有相同的模体蛋白也可发生相互作用。也可发生相互作用。也可发生相互作用。也可发生相互作用。排除假阳性的措施排除假阳性的措施现在学习的是第31页，共61页原因：原因：由于酵母转化效率较细菌由于酵母转化效率较细菌低低4个数量级个数量级，因此，因此转化成为双杂交技术的重要转化成为双杂交技术的重要瓶颈瓶颈。解决办法：解决办法：引进酵母接合型引进酵母接合型 a接合型和接合型和接合型和接合型和 接合型（两者之间可形成二倍体，但接合型（两者之间可形成二倍体，但自身不能）自身不能）（二）（二）转化效率偏低转化效率偏低现在学习的是第32页，共61页 接合型酵母细胞接合型酵母细胞cDNA文库文库 诱铒蛋白基因诱铒蛋白基因多克隆位点多克隆位点DNA-BD 载体载体 AD 载体载体转化转化转化转化a接合型酵母细胞接合型酵母细胞筛选平板生筛选平板生长菌苔长菌苔筛选平板生筛选平板生长菌苔长菌苔同一个三重筛选平板同一个三重筛选平板克隆（诱饵与靶蛋白相互作用）克隆（诱饵与靶蛋白相互作用）鉴定鉴定-半乳糖苷酶半乳糖苷酶部分已商部分已商品化品化现在学习的是第33页，共61页（三）阴性干扰（三）阴性干扰n n融合蛋白的表达融合蛋白的表达融合蛋白的表达融合蛋白的表达对细胞有毒性对细胞有毒性对细胞有毒性对细胞有毒性，该怎么办？该怎么办？该怎么办？该怎么办？应选择应选择敏感性较低敏感性较低敏感性较低敏感性较低的菌株或拷贝数低的载体的菌株或拷贝数低的载体n n蛋白间的蛋白间的蛋白间的蛋白间的相互作用较弱相互作用较弱相互作用较弱相互作用较弱，应选择高敏感的菌株或多拷，应选择高敏感的菌株或多拷贝载体。贝载体。n n蛋白在酵母中蛋白在酵母中蛋白在酵母中蛋白在酵母中不能稳定地表达不能稳定地表达不能稳定地表达不能稳定地表达，或者，或者，或者，或者不能正确地折叠不能正确地折叠不能正确地折叠不能正确地折叠，或杂交蛋白或杂交蛋白或杂交蛋白或杂交蛋白不能转入胞核不能转入胞核不能转入胞核不能转入胞核。两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。程度甚低以至于检测不出来。原因：原因：现在学习的是第34页，共61页 酵母双杂交系统是分析蛋白酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作蛋白间相互作用的有效和快速的方法，用的有效和快速的方法，有多方面的应用，有多方面的应用，但但仍存在一些仍存在一些局限性局限性。八、酵母双杂交系统使用注意事项八、酵母双杂交系统使用注意事项现在学习的是第35页，共61页酵母双杂交系统酵母双杂交系统局限性局限性1.某些诱饵蛋白具有某些诱饵蛋白具有自身激活自身激活性质。性质。2.-双杂交前删除该部分，但应避免删除相互作用的结双杂交前删除该部分，但应避免删除相互作用的结构域构域2.某些蛋白在酵母中某些蛋白在酵母中不稳定表达或不能准确定位不稳定表达或不能准确定位到胞核到胞核内。在细胞表面发生的相互作用可采用内。在细胞表面发生的相互作用可采用噬菌体显示系噬菌体显示系统。统。3.双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法这些反应在核内无法进行。进行。现在学习的是第36页，共61页酵母双杂交系统局限性酵母双杂交系统局限性3.有时有时DNA-BD或或AD融合部分不包括相互作用位点，或融合部分不包括相互作用位点，或破坏了融合蛋白的正确折叠。破坏了融合蛋白的正确折叠。4.4.哺乳动物蛋白之间相互作用有时要求哺乳动物蛋白之间相互作用有时要求正确的折叠和正确的折叠和翻译后修饰，而酵母细胞不能提供这样的环境。翻译后修饰，而酵母细胞不能提供这样的环境。这限这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究5.阳性克隆必须进行体外翻译和表达，用抗原表阳性克隆必须进行体外翻译和表达，用抗原表位特异性的抗体进行共定位研究。位特异性的抗体进行共定位研究。6.双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它的双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它的实验手段来验证。实验手段来验证。现在学习的是第37页，共61页 在酵母双杂交的基础上，又发展：在酵母双杂交的基础上，又发展：酵母单杂交酵母单杂交-用于核酸和文库蛋白之间的研究用于核酸和文库蛋白之间的研究酵母三杂交酵母三杂交-三种不同蛋白之间的互作研究三种不同蛋白之间的互作研究酵母的反向杂交酵母的反向杂交-两种蛋白相互作用的结构和位点。两种蛋白相互作用的结构和位点。反向双杂交系统和三杂交技术反向双杂交系统和三杂交技术现在学习的是第38页，共61页(一一)酵母单杂交系统酵母单杂交系统(one-hybrid system)1993年，由年，由Wang和和Reed等相继创立发展出一种研究蛋等相继创立发展出一种研究蛋白质和白质和DNA相互作用的实验体系。相互作用的实验体系。Wang MM,Reed RR.Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor Olf-1 by genetic selection in yeast.Nature，1993，364(6433):121-126.文献出处文献出处现在学习的是第39页，共61页酵母单杂交系统原理酵母单杂交系统原理 在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的的BD-X蛋白质杂交体，而用蛋白质杂交体，而用特异的特异的DNA序列取代序列取代DNA Gal4结合位点。结合位点。该该DNA序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位点。点。靶靶DNA序列特异的结合蛋白序列特异的结合蛋白(BDPX)与与Gal4 P的激活结构的激活结构域可融合形成融合体，域可融合形成融合体，BDPX与其特异与其特异DNA结合位点之间通结合位点之间通过相互作用可激活作为表型选择性标志的报告基因的表达。过相互作用可激活作为表型选择性标志的报告基因的表达。现在学习的是第40页，共61页酵母单杂交系统原理酵母单杂交系统原理 理论上，酵母单杂交系统可利用靶理论上，酵母单杂交系统可利用靶DNA序列，捕获具序列，捕获具有与该元件特异结合的结构域的蛋白质。有与该元件特异结合的结构域的蛋白质。该系统不仅适用于识别转录因子，也适用于研究参与该系统不仅适用于识别转录因子，也适用于研究参与转录抑制和转录抑制和DNA复制过程的蛋白质。复制过程的蛋白质。现在学习的是第41页，共61页酵母单杂交系统应用酵母单杂交系统应用 确定已知确定已知DNA-蛋白质之间是否存在相互作用。蛋白质之间是否存在相互作用。分离编码结合于目的顺式调控元件或其他短分离编码结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合结合位点蛋白的新基因。位点蛋白的新基因。定位已经证实的具有相互作用的定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的结合蛋白的DNA结合结构域以及准确定位与结合结构域以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。结合的核苷酸序列。-研究研究DNA-蛋白质相互作用蛋白质相互作用现在学习的是第42页，共61页(二二)反向酵母双杂交系统反向酵母双杂交系统（reverse yeast two-hybrid system）1996年，年，Vidal等人建立了反向酵母双杂交系统等人建立了反向酵母双杂交系统Vidal M,Brachmann RK,Fattaey A,Harlow E,Boeke JD.Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(19):10315-10320.现在学习的是第43页，共61页(二二)反向酵母双杂交系统反向酵母双杂交系统（reverse yeast two-hybrid system）该系统是一项鉴定该系统是一项鉴定阻断阻断蛋白间相互作用的技术，核心在蛋白间相互作用的技术，核心在于构建一种反向筛选的报告基因。于构建一种反向筛选的报告基因。在这系统中，野生型在这系统中，野生型BD-X/AD-Y间的相互作用激活一种间的相互作用激活一种毒性标志毒性标志作为报告基因，对酵母宿主是毒性或致死性的，作为报告基因，对酵母宿主是毒性或致死性的，即所谓的即所谓的阴性阴性筛选。筛选。在此情况下在此情况下BD-X/AD-Y作用的解离作用的解离赋予酵母一种选择生赋予酵母一种选择生长优势。长优势。利用这种方法能方便地鉴定利用这种方法能方便地鉴定作用缺陷等位基因作用缺陷等位基因、解离肽解离肽或相关的小分子物质或相关的小分子物质。现在学习的是第44页，共61页 反向双杂交系统基本原理示意图反向双杂交系统基本原理示意图 现在学习的是第45页，共61页 反向双杂交系统基本原理示意图反向双杂交系统基本原理示意图 双杂交产生的相互作用激活双杂交产生的相互作用激活Tet阻遏蛋白，从而抑制阳性阻遏蛋白，从而抑制阳性筛选标志筛选标志His3的表达，此时野生型相互作用使宿主细胞表现为的表达，此时野生型相互作用使宿主细胞表现为组氨酸营养缺陷型。组氨酸营养缺陷型。现在学习的是第46页，共61页反向酵母双杂交系统的应用反向酵母双杂交系统的应用用于筛选缺陷等位基因的研究用于筛选缺陷等位基因的研究：在稳定、全长及能够形成正：在稳定、全长及能够形成正确蛋白质折叠的条件下，已有了几种遗传学策略来筛选作用缺陷确蛋白质折叠的条件下，已有了几种遗传学策略来筛选作用缺陷性等位基因。性等位基因。在反式作用解离分子方面的应用在反式作用解离分子方面的应用 在蛋白质组研究方面的应用在蛋白质组研究方面的应用：利用反向双杂交系统对文库：利用反向双杂交系统对文库进行预清除，则可能大大减轻以后的假阳性鉴定工作。反向进行预清除，则可能大大减轻以后的假阳性鉴定工作。反向双杂交系统作为正向双杂交系统的补充，提出了创建整个有双杂交系统作为正向双杂交系统的补充，提出了创建整个有机体蛋白质连锁图谱的设想。机体蛋白质连锁图谱的设想。现在学习的是第47页，共61页酵母双杂交酵母双杂交GAL4 系统筛选系统筛选cDNA 文库实验流程文库实验流程现在学习的是第48页，共61页GAL 系统所用酵母菌株系统所用酵母菌株注：注：菌株菌株AH109 可利用所带的可利用所带的HIS3、ADE2、MEL1 三个报道基进行筛库。三个报道基进行筛库。菌株菌株Y187 可利用所带的可利用所带的IacZ 报道基因来验证两个已知蛋白间的相互作用。报道基因来验证两个已知蛋白间的相互作用。菌株菌株CG-1945 可被用于用环己酰亚胺来分离可被用于用环己酰亚胺来分离BD-bait 和和AD-library 质粒。质粒。现在学习的是第49页，共61页酵母菌株的表型酵母菌株的表型现在学习的是第50页，共61页GAL 系统所用各种质粒系统所用各种质粒现在学习的是第51页，共61页诱饵载体诱饵载体现在学习的是第52页，共61页诱饵载体序列诱饵载体序列现在学习的是第53页，共61页猎物载体猎物载体现在学习的是第54页，共61页猎物载体序列猎物载体序列现在学习的是第55页，共61页实验流程n n构建于AD 载体的cDNA 文库的扩增n n构建于AD 载体的cDNA 文库的纯化n npGBKT7/bait 小规模转化酵母菌AH109n n钓饵蛋白自身激活报道基因的活性检测pGBKT7/bait 与pACT2 小规模共转化酵母n n文库质粒大规模转化已携带钓饵质粒的酵母n n转化子的筛选与库质粒纯化现在学习的是第56页，共61页n n酵母双杂合系统阳性克隆的鉴定酵母双杂合系统阳性克隆的鉴定 酵母质粒DNA DNA 的的提取提取n n大肠杆菌感受态细胞的制备（电转化）n n文库质粒文库质粒DNA DNA 电转化大肠杆菌电转化大肠杆菌E.coliE.coliKC8KC8n n碱裂解法小量制备细菌质粒碱裂解法小量制备细菌质粒DNADNAn nDNA DNA 的限制性内切酶分析的限制性内切酶分析n nDNA 片段的连接n n蛋白相互作用的验证pGBKT7/bait 与与pACT2 pACT2 小小规模共转化酵母规模共转化酵母现在学习的是第57页，共61页生物信息技术分离和鉴定目的基因生物信息技术分离和鉴定目的基因ESTEST：基因表达的短的基因表达的短的基因表达的短的基因表达的短的cDNAcDNA序列，包含基因编码区的部分序列，包含基因编码区的部分序列，包含基因编码区的部分序列，包含基因编码区的部分信息，信息，信息，信息，称为表达序列标签。称为表达序列标签。称为表达序列标签。称为表达序列标签。利用利用利用利用ESTEST数据库发现新基因也被称为基因的电脑克隆。数据库发现新基因也被称为基因的电脑克隆。数据库发现新基因也被称为基因的电脑克隆。数据库发现新基因也被称为基因的电脑克隆。GenBank的的EST数据库中已收集了数据库中已收集了EST序列序列2,020,608条条.2000 2000年，夏家辉用年，夏家辉用年，夏家辉用年，夏家辉用ESTEST方法发现了神经性耳聋基因。方法发现了神经性耳聋基因。方法发现了神经性耳聋基因。方法发现了神经性耳聋基因。1、利用、利用EST数据库发现新基因数据库发现新基因现在学习的是第58页，共61页2、通过蛋白家族的保守性分离目的基因、通过蛋白家族的保守性分离目的基因(1)利用序列利用序列同源性比较同源性比较软件软件(如如B1ast软件软件)将待进行延伸将待进行延伸的序列的序列(以下简称种子序列以下简称种子序列)对库检索；对库检索；(2)从数据库中挑选出从数据库中挑选出全部相关序列全部相关序列；(3)对所有序列进行对所有序列进行片段整合分析片段整合分析(即即Contig分析分析)，形成延，形成延伸后的序列伸后的序列(简称新生序列简称新生序列)。随后，此新生序列作为种子序列。随后，此新生序列作为种子序列重复进行上述三步过程，直至新生序列不能够被进一步延伸重复进行上述三步过程，直至新生序列不能够被进一步延伸为止。为止。现在学习的是第59页，共61页n n用相同引物对用相同引物对PCRPCR产物再次扩增产物再次扩增 存在以下几个问题：存在以下几个问题：1.PCR1.PCR产物并不是很稳定，存在端点的降解，如果放时间长了可产物并不是很稳定，存在端点的降解，如果放时间长了可能导致引物不能结合到模板上，导致扩增失败，这也是巢式能导致引物不能结合到模板上，导致扩增失败，这也是巢式PCRPCR第一轮产物较第二轮产物长的原因；第一轮产物较第二轮产物长的原因；2.2.经过第一轮经过第一轮PCRPCR后，模板呈指数扩增，把第一轮后，模板呈指数扩增，把第一轮PCRPCR产物作为模板，产物作为模板，如果不稀释的话，会导致第二轮时模板浓度过高。在退火过程中，如果不稀释的话，会导致第二轮时模板浓度过高。在退火过程中，模板模板-模板的退火一旦发生，往往是不可逆的，并间接抑制了引物模板的退火一旦发生，往往是不可逆的，并间接抑制了引物-模板的退货；模板的退货；3.3.把第一轮把第一轮PCRPCR产物作为模板，模板中存在很多抑制产物作为模板，模板中存在很多抑制PCRPCR产物的东西，产物的东西，如如dNTPdNTP产生的焦磷酸等，可能也是导致扩增失败的原因。产生的焦磷酸等，可能也是导致扩增失败的原因。现在学习的是第60页，共61页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第61页，共61页