蛋白质的提取纯化和分析课件.ppt
关于蛋白质的提取纯化和分析现在学习的是第1页，共25页材料选择和预处理细胞破碎蛋白质的粗提目目 录录题目分析蛋白质的纯化分析检测现在学习的是第2页，共25页1题目解析已知某蛋白的分子量约为17 kDa，等电点3.94.1，它能耐一定的高温，在90 C加热34 min后仍然能够保持80%的活性。该蛋白含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体内酶的激活剂。在钙离子的作用下才能起到暴露疏水在钙离子的作用下才能起到暴露疏水集团发挥性能，结合蛋白质基础知识集团发挥性能，结合蛋白质基础知识从而可以判断其为从而可以判断其为钙调蛋白。钙调蛋白。现在学习的是第3页，共25页材料的选择材料的选择TEXTTEXT材料的预处理材料的预处理成年健康雄性大鼠脑组织20克（比雌鼠体积大，成本较低物种易获得）将切取的组织用4预 冷0.01mol/l的PBS漂洗去血渍，再用滤纸吸干残留的PBS（磷酸盐缓冲液）现在学习的是第4页，共25页 预处理过的组织预处理过的组织 细胞破碎（高速珠磨细胞破碎（高速珠磨法）法）制备制备组织细胞悬组织细胞悬液液（剪碎法）（剪碎法）蛋白质被释放出来蛋白质被释放出来破碎现在学习的是第5页，共25页剪碎法1.将组织块放入平皿后，加入少量PBS；2.用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入10 ml PBS；3.用吸管吸取组织匀浆，用200目尼龙网过滤到试管内；返回返回现在学习的是第6页，共25页高速珠磨法破碎机理：高速珠磨法是一种有效的细胞破碎方法，珠磨机是该法所用的设备，其结构示意图见图（1）。微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切、碰撞促进细胞膜破裂，释出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作。破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走。现在学习的是第7页，共25页钙调蛋白的粗提取钙调蛋白的粗提取抽提 蛋白质破碎后，使用适当的溶剂，将蛋白质提取溶解到溶剂当中，常用稀酸、稀碱、有机溶剂等电点3.94.1酸性蛋白质稀碱性溶液抽提溶液碱性的程度，碱性过大则难以复性pH调至等电点偏碱的一侧（4.1）现在学习的是第8页，共25页粗提取物离心操作除去固体杂质的上清液现在学习的是第9页，共25页热变性初步纯化热变性初步纯化天然结构%钙调蛋白一般蛋白100热稳定性不同现在学习的是第10页，共25页其他方法其他方法盐析法等电点法有机溶剂法现在学习的是第11页，共25页3现在学习的是第12页，共25页亲和色谱亲和色谱配体配体蛋白质蛋白质蛋白质和配蛋白质和配体复合物体复合物交联试剂交联试剂载体载体配体配体载体与配载体与配体交联体体交联体杂质杂质杂质杂质游离游离配体配体洗脱结合耦联作用机理作用机理现在学习的是第13页，共25页金属螯合亲和层析金属螯合亲和层析钙调蛋白的外形似哑铃,有两个球形的末端,中间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连,每个末端有两个Ca2+结构域,每个结构域可以结合一Ca2+,这样,一个钙调蛋白可以结合4个Ca2+,钙调蛋白与Ca2+结合后的构型相当稳定。现在学习的是第14页，共25页金属螯合色谱金属螯合色谱原理：利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基 与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相 上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱 氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合 作用而进行分离NHNH2 2NHNH2 2NiNiHisHisHisHisHisHisHisHisproteinprotein现在学习的是第15页，共25页步骤步骤1.制作金属螯合亲和色谱柱：用浓度为0.2 mol/L的CaCl2溶液上柱。将上清液PH调制6-8，加入蛋白质解离抑制剂。慢上样3.再用配体CaCl2溶液洗脱，下方流出为目的蛋白液，用大使管或者烧杯盛装之。2.上柱后依次用50ml bufferB、200ml含0.5mol/L NaCl的bufferB洗脱。下方用大试管或烧杯收集杂质液。现在学习的是第16页，共25页配体配体蛋白质蛋白质蛋白质和配蛋白质和配体复合物体复合物现在学习的是第17页，共25页步骤步骤目的：除去蛋白液中配体离子方法一：半透膜进行透析方法二：将上次获得目的蛋白液经凝胶过滤色谱柱下方首次接受的溶液即为高纯度的钙调蛋白溶液；第二次接受到的即为配体离子的溶液。现在学习的是第18页，共25页凝胶过滤色谱的洗脱现在学习的是第19页，共25页定性分析分析鉴定定量分析现在学习的是第20页，共25页定性分析定性分析现在学习的是第21页，共25页SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量用SDS-PAGE检测不同纯化阶段所获得的提取液样品中CaM的纯度与相对分子质量。电泳采用质量分数为15%的分离胶和质量分数为5%的浓缩胶，120V 电压条件下进行电泳，直至溴酚蓝达到凝胶底部，考马斯亮蓝染色，凝胶成像仪成像。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。现在学习的是第22页，共25页定量分析简单快速不破坏样品准确度低简单迅速干扰少灵敏度高(1g)灵敏度高常用现在学习的是第23页，共25页Folin-酚试剂法在碱性条件下蛋白质和铜作用生成蛋白质-铜络合物此络合物将Folin试剂还原，产生深蓝色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。step1step2现在学习的是第24页，共25页感谢大家观看现在学习的是第25页，共25页
