放射性核素标记化学物.ppt

放射性核素标记化学物现在学习的是第1页，共42页 一 基本概念一、放射性核素的选择：1 要不改变原化学物的理化和生物学特性；2 要与化学物结合牢固稳定；3 要有合适的物理半衰期；4 射线容易测量；5 其它要求二、几个重要参数：1 放射性浓度；2 放化纯度；3 放射性比活度三、同位素与非同位素标记四、定位标记与非定位标记现在学习的是第2页，共42页 二 放射性核素标记化合物制备方法简述1放射性核素标记物制备技术的特点：a 原料；b 标记物的稳定性；c 超微量技术；d 进行冷试验；2常用的基本方法：a 同位交换法；b 化学合成法；c 生物合成法三放射性碘标记化合物的制备四放射性碘制备分析试剂以125I应用最广，现90的放免试剂盒中的示踪剂都是用125I标记的，因为125I具有二个重要的优点，用125I标记的化合物有足够的稳定性。现在学习的是第3页，共42页1 碘的同位素及125I的特性碘的同位素有29种，其中23种是放射性同位素，它们具有很不同的物理特性，制备分析试剂以125I应用最广，因为125I具有二个重要的优点，一是半衰期（60天）允许标记化合物可贮存应用一段时间；二是它只发射28Kev能量的x射线和5Kev的射线，无粒子，因而辐射自分解少，标记化合物有足够的稳定性。现在学习的是第4页，共42页碘的同位素特性表现在学习的是第5页，共42页 2 蛋白质、多肽的125I标记技术 蛋白质、多肽碘化的基本反应式 Na125I+氧化剂 125I HO-CH2CH-COOH+125I2-HO-CH2CH-COOH-NH2 NH2 上式表示通过氧化剂使碘化物（125I）氧化成碘分子（125I 2）与蛋白质分子中的酪氨酸残基发生碘化作用，所以只要含有酪氨酸的化学物或人工地接上酪氨酸基团的化合物都可用放射性碘标记。蛋白质分子中除含酪氨酸外，还有组氨酸和色氨酸残基，有时也可生成碘化物，但它们的反应性远不及酪氨酸，因此影响蛋白质碘化效率的因素，主要取决于蛋白质分子中酪氨酸残基的数量及其在分子中的暴露程度，另一方面，碘化物的用量、反应条件（PH、温度、反应时间等）及氧化剂的性质等也有影响。现在学习的是第6页，共42页 3 常用标记方法 (1)氯胺-T法(2)乳过氧化物酶法(3)联接标记法(4)固相氧化法现在学习的是第7页，共42页(1)氯胺-T法 氯胺-T法具有标记效率高、重复性好、试剂便宜易得、是目前应用最多的标记方法。氯胺-T（Chloramine-T）是一种温和的氧化剂，它的化学名是 氯代对苯磺酰胺钠盐，在水溶液中产生次氯酸，可使碘阴离子氧化成碘分子，反应式如下：现在学习的是第8页，共42页氯胺-T法的标记过程以GH为例在反应试管中依次加入 GH 50g 50l 125I 2mCi 50l Ch-T 100g 50l 室温反应1分钟 SM 200g 100l 1KI 1mg 100l 标记反应完成后用凝胶过滤等方法将125I-GH与游离的125I离子分离。现在学习的是第9页，共42页在标记过程中应注意以下几个问题：a.氯胺-T水溶液遇光或暴露至空气中很不稳定，需要在临用时配制；b.氯胺-T的用量，按氧化2mCi无载体的Na125I只需要0.15g，而实际需要量大大超过此值，经验认为用2mCi新鲜无载体125I时，Ch-T用量约为100g。如用量过大，会明显降低标记化学物的免疫活性和生物活性，用量不足又降低标记率，甚至标记不上去，此外如碘溶液中含有保护剂（一般用Na2SO3等还原剂），因它需要消耗Ch-T，固用量就需要相应加大。c.加入Ch-T后必须迅速混匀，以防止标记不均匀，在0240C下，加入Ch-T 后的反应时间一般为一分钟左右，但也有延长至10分钟的。d.加入偏重亚硫酸钠（SM）终止碘化反应，SM的用量一般为Ch-T量的1.21.5倍就足够。e.反应体积要小，使微量的蛋白质保持高浓度，才能保证一定的碘化效率，含中等量酪氯酸的蛋白质其浓度为300mg/ml时，碘化效率一般为80 90，而如含50mg/ml时，则碘化效率可降至6070f.PH对碘化效率的影响：碘化反应最适的PH依据蛋白质的性质而定，一般蛋白质所需的PH为7.37.8，通常Na125I溶液中都含有相当量的NaOH（可高达0.1M），因此所用的缓冲液必须具有足够的缓冲容量，如常用0.20.5M磷酸盐缓冲液。现在学习的是第10页，共42页(2)乳过氧化物酶法 利用乳过氧化物酶（LPO）有促进微量过氧化氢对125I-的氧化作用，生成125I+并标记在蛋白质酪胺酸分子上。标记方法如下：在反应试管中依次加入：蛋白质 10g 50l Na 125I 12mCi 50l LPO 20100ng 50l H2O2 80150ng 50l（可分二次加入间隔710分钟）室温下反应1020分钟 疏基乙醇 10mmol 500l 或PB 0.05M 1ml 终止反应后用凝胶过滤法分离125I-蛋白质与游离125I。现在学习的是第11页，共42页此法反应的特点是：a.乳过氧化物酶的用量应少于总蛋白质用量的1，以减少酶自身碘化而带入放射性杂质，b.过氧化氢应保持低浓度，如浓度高于0.1mM，则对酶的活性有抑制作用。c.该法的主要优点是反应条件温和，过氧化氢只需极低浓度（0.01mM），能保持标记化学物原有的生物活和免疫活性。不足之处是标记率较低，一般为2040。现在学习的是第12页，共42页(3)联接标记法 该法是先用Ch-T法将酰化剂（3-(对羟基苯)丙酸-N琥珀亚胺脂 Bolton-Hunter试剂）碘化，然后再用此酰化剂与蛋白质分子中游离氨基酸相缩合而引入蛋白质分子中，现在学习的是第13页，共42页联接标记方法方法如下：125I-酰化剂 510mol 吹干 蛋白质 510g 50l 缓冲液 PH88.5 100l 水浴反应1530分钟 加入过量的甘氨酸，使剩余的125I-酰化剂消耗掉而终止反应。现在学习的是第14页，共42页本法的优缺点优点是：避免了蛋白质与氧化剂直接接触，可防止碘源中的有害物质对蛋白质的损伤，适用于标记缺乏酪氨酸的蛋白质或因酪氨酸在蛋白质的活性中心，引入碘原子后会使其失活。缺点是：操作较麻烦，需要二步反应，125I的利用率较低，不宜标记短肽，只适用于标记分子量大于10000的蛋白质。现在学习的是第15页，共42页(4)固相氧化法 本法是将氯甘脲（Iodogen）制成固相氧化剂，氯甘脲的化学名为1,3,4,6-四氯3a,6a-二苯-甘脲。它与氯胺-T同属氯酰胺类化合物，二者使I-氧化的化学反应本质相同，但Iodogen在一定的PH及温度范围内在水溶液中的溶解度极低，固可制成固相催化剂，方法是取Iodogen 1mg用二氯甲烷1ml溶解后分装成50l/管，放置反应试管底部，微微加热，使溶剂挥发后，在反应试管底部就形成一层Iodogen薄膜，盖上塞子放入有干燥剂的塑料袋中于20c保存，可使用半年。现在学习的是第16页，共42页标记方法如下：取涂有Iodogen管 1支 0.5M PB PH7.6 100l Mc-Ab 50g 50l 125I 0.5mCi 10l 200C室温反应15分钟 0.5M PH7.9 PB 150l终止反应 反应液用Sephadex G-100分离纯化，现在学习的是第17页，共42页 Iodogen法的特点 Iodogen法是一种简便、高效、广谱的碘标记方法，由于Iodogen被固定在试管壁上，与溶液中的标记蛋白质不直接接触，这就减少了氧化剂对标记物的损伤，使反应更加温和，简化了操作步骤，每次标记前无需配制氧化剂溶液，省去了用还原剂终止反应一步，Iodogen法延长了反应时间（15分钟），这样使反应更容易控制。提高了标记结果的重复性。是一种很有生命力的标记方法。现在学习的是第18页，共42页 四 放射性标记物的纯化 不论用何种方法制备，要想得到合格的标记化学物，必须将反应物仔细纯化，标记化学物在保存过程中也会出现一些不纯的物质，同样需要再次纯化，因此要求标记化学物的放化纯度大于95%，而且在示踪过程中要稳定。否则所得的示踪结果不可靠。现在学习的是第19页，共42页1、标记率的测定标记率是指放射性核素被标记到待标记化学物上的量所占放射性核素总投入量的百分比：即标记率=标记物的放射性/投入的总放射性X100%标记率的测定方法1放射性纸层析；2薄层层析；3柱层析；4蛋白沉淀法现在学习的是第20页，共42页2、标记物的纯化 标记化学物的纯化方法：色谱法或叫层析法，包括纸层析、薄板层析、柱层析等，柱层析又可分为离子交换法、凝胶过滤法、亲和层析法，另外还有透析法、电泳法等等。现在学习的是第21页，共42页标记物分离前后曲线现在学习的是第22页，共42页(1)、纸层析及薄层层析 纸层析是以层析纸作为固定相、以适当的展开液作为流动相，当流动相沿着纤维素分子上行时，待测样品（点在滤纸的下端）也随之移动，由于样品中各个组分的性质不同，在固相的吸附能力和在流动相中的溶解度不同，因而各组分随流动相移动的速度也就不同，也就是说各个组分在固定相上移动的距离不一样，从而样品中的各个组分能有效的分开现在学习的是第23页，共42页放射层析现在学习的是第24页，共42页(2)、柱层析法 1 凝胶过滤法 凝胶过滤是利用凝胶把分子大小不同的物质进行分离的一种方法，常用的有葡聚糖凝胶（Sephadex G）系列，分离标记蛋白与游离碘时常用Sephadex G-25或G-50，然后再用G-100进一步纯化；这种即有离子交换作用又有凝胶过滤作用，纯化效果较好，2 离子交换法 一般是制成离子交换层析柱，适于分离短肽标记物。3 亲和层析法 利用蛋白质与其特异抗体或受体的结合来分离纯化标记蛋白质，此法特异性强，保持生物活性好，但操作较复杂。现在学习的是第25页，共42页使用葡聚糖凝胶凝胶过滤法时的注意事项a.根据纯化物的分子量适当选用不同型号的葡聚糖凝胶或树脂葡聚糖凝胶，后者分离效果比前者好；b.粒子粗细的选择，一般选用中等大小（50150）颗粒，细颗粒比粗颗粒分离效果好；c.Sephadex G使用前用缓冲液浸泡24小时以上，使之充分膨胀，或在沸水中煮2小时；d.根据纯化要求适当选用层析柱，装好的凝胶不可有气泡、斜面及中间断裂，平衡缓冲液内应加入防腐剂，防止霉菌的生长；e.层析柱使用前要充分平衡，要求平衡液的用量是柱床体积的34倍；f.洗脱时流速不宜太快，每分钟不超过0.5ml，一般每分钟在0.20.3ml，太快可造成分离不纯；g.多数标记多肽或蛋白在上柱分离前，应先用蛋白（如BSA或兔血清等），以免标记物吸附于柱上而受损失。现在学习的是第26页，共42页(3)、透析法 根据标记物和放射性杂质的分子量的大小不同，选择孔隙合适的透析袋，将样品置于透析袋中，并将其悬浮在较大体积的缓冲液中，在搅拌条件下，每6小时更换一次透析液，经过24小时透析作用，较小分子的放射性杂质基本上扩散到透析袋之外，而大分子的标记物则存留在透析袋之内。能将标记蛋白与小分子化学物很好的分离。本法简便但较费时。现在学习的是第27页，共42页五、标记物的质量鉴定经纯化后的标记化学物，要对其化学、生物学性能、质量进行鉴定，鉴定包括：1.放射化学纯度鉴定；2.放射性浓度；3.放射性比活度测定；4.生物活性和免疫活性测定等5.其它指标：产品的总放射性活度、放射性浓度、以及测量的时间等。现在学习的是第28页，共42页1 放射化学纯度鉴定放射化学纯度（Radiochemical Purity）放射化学纯度（）特定化学形态的放射性活度/样品总放射性活度x100%放射化学纯度受制备方法及原料的化学纯度、产品存放条件等影响，一般放化纯度控制在95以上。放射化学纯度的检测方法有：a.放射性纸层析和放射性薄层层析；b.放射性高效液相层析；c.凝胶电泳法。现在学习的是第29页，共42页2 放射性浓度 放射性浓度：取1ml产品测其放射性活度，即为放射性浓度，单位为Bq/ml。现在学习的是第30页，共42页3 放射性比活度 放射性比活度（Specific Activity）过去也称比放射性。放射性比活度放射性活度/单位化学量现在学习的是第31页，共42页 放射性比活度测定方法有：a.直接测定计算法：将纯化后的标记物配成合适的溶液，测量其放射性浓度(Bq/L)及其化学浓度(mmol/L)。放射性比活度=放射性浓度/化学浓度(Bq/mmol)b.估算法：设标记时投入的待标记物的质量为W，投入的放射性核素的总活度为A，标记率(即标记原子的利用率)为Y，那么从理论上讲该标记化学物的比活度应=AY/W。c.自身取代计算法：本法是根据体外竟争结合的原理，间接地测定标记物的比活度。现在学习的是第32页，共42页自身取代计算法l基本方法：l1.作一条常规的RIA标准曲线即在一系列试管中加入一定量的标记抗原并加入不同量(由低向高)的非标记抗原和限量抗体进行竟争性免疫结合反应，然后将结合和游离*Ag分离，分别测量F和B的放射性，以B/F为纵座标，以不同量的非标记抗原为横座标作标准曲线A；l2.同1，每管加入同量的标记抗原和同量的抗体，但分别再加放不同量的标记抗原，按1同样的方法分离B、F并分别测量，绘制一条B/F对标记抗原的自身取代曲线B，l3.由于两条曲线所用的抗体的质量完全相同，在B/F相同的情况下，曲线A所对应的抗原量和曲线B所对应的标记抗原量的放射性是等效的。现在学习的是第33页，共42页自身取代计算法现在学习的是第34页，共42页 4 生物活性与免疫活性 特异结合试验：a观察标记物与抗体的结合率，方法是用过量抗体与标记抗原结合。结合率高说明标记物的免疫活性好，b观察标记抗原与非标记抗原对抗体的亲和力。方法是用不同稀释度的抗体分别与标记抗原及与标记抗原加非标记抗原的混合物进行特异结合，其中混合抗原的总浓度要和单独使用标记抗原的浓度相同，(如单独用标记抗原为1.0ng，而混合抗原的总浓度亦为1.0ng，其中标记抗原为0.1ng，非标记抗原为0.9ng)，比较两者的结合率，如基本相同说明标记抗原保持了原来亲和力，在标记过程中末受到明显损伤。现在学习的是第35页，共42页免疫活性测定：特异结合试验A为标记抗原与抗血清的滴度曲线B为非标记抗原(加入少量标记抗原)的滴度曲线C与A相同，但标记抗原免疫活性已有降低现在学习的是第36页，共42页 5 5 影响标记物生物活性、免疫活性及稳定性的因素影响标记物生物活性、免疫活性及稳定性的因素 1 蛋白质、多肽分子上碘原子的参入量，由于将碘原子参入到蛋白质的酪氨酸残基中去，是非同位素标记，对多数蛋白质来说，碘化程度对其生物学性质的保持有决定性的影响，每分子中引入的碘原子越少活性的改变也越小。2 与酪氨酸残基在蛋白质分子中的地位有关，随着蛋白质碘化程度的提高，关键氨基酸残基被碘化的可能性增加，因而失活的可能性也增加，对放免所用的分析试剂最好实现单碘标记，这个比活度已能满足灵敏度的需要。3 氧化损伤 主要由氧化剂直接造成，也可由氧化生成的I2造成，氧化损伤主要涉及蛋白质分子中的蛋氨酸、色氨酸残基及二硫键，使用温和的氧化剂及合理选用氧化剂的用量可减少氧化损伤，标记物分离纯化后加入适量的BSA 能有效的防止氧化损伤及放射线引起的辐射损伤。4 辐射自分解 放射线可使标记物自身发生电离辐射分解，这种辐射自分解可引起化学键的断裂，其裂解产物还可通过结合、加成、聚合、取代等方式生成一些付产品，从而形成一此化学杂质和放化杂质。现在学习的是第37页，共42页六 放射性标记化学物的辐射自分解l由于放射性核素电离辐射作用至使标记化学物本身产生电离、激发或化学键断裂，或者作用于相邻的分子，使其产生激活物质，例如自由基等，这种现象称为辐射自分解(autoradiolysis)。l辐射自分解的结果可能使标记化合物本身及相邻的分子受到破坏现在学习的是第38页，共42页1 辐射自分解的方式1初级内分解：是指标记核素本身的衰变，例如3H每年有5%衰变成氦，14C每年有 0.01%衰变成氮。2 初级外分解：标记核素所发出射线直接作用于标记化合物分子，使其电离、激发或化学键断裂。3 次级分解：射线首先作用于标记化合物邻近的分子(如水分子)使其产生激活物质或自由基，如H、HO、HO2等，它们也会使标记化合物分解。现在学习的是第39页，共42页2 影响辐射自分解的因素：a 与标记化学物吸收射线的效率有关，吸收效率与射线的类型及能量有关；b 与标记化合物的比活度有关，一般来说比活度越高辐射自分解越严重；c 与标记化合物的纯度有关，杂质的存在可加速辐射自分解。现在学习的是第40页，共42页3 控制辐射自分解的方法a 控制标记化合物的比活度在一个适当的水平，因辐射自分解的速度与比活度成正比，如比活度过高可加入同种化合物稀释到所需的比活度，以减低辐射自分解；b 选择适当的溶剂，标记化合物以固体的形式贮存时，则由于标记分子密集辐射自分解最严重，以溶液状态贮存时，分子较分散，可降低辐射自分解的速度；c 加入自由基消除剂d 低温贮存也可降低辐射自分解的速度。现在学习的是第41页，共42页4 氚在标记化合物分子内的稳定性l氚标记化合物除有严重的辐射自分解外其本身容易和周围溶液中的氢原子发生交换作用，在示踪实验中由于生物催化作用而加快这种交换作用，这可能是除了CH不如CC稳定，3H的同位素效应比较严重也是一个重要因素。现在学习的是第42页，共42页