血红蛋白提取和分离课件.ppt

血红蛋白提取和分离第1页，此课件共39页哦知识回顾知识回顾知识回顾知识回顾-有关蛋白质的几个问题：有关蛋白质的几个问题：有关蛋白质的几个问题：有关蛋白质的几个问题：1 1 1 1、含量、含量、含量、含量2 2 2 2、组成元素、组成元素、组成元素、组成元素3 3、相对分子质量、相对分子质量、相对分子质量、相对分子质量4 4、基本组成单位：、基本组成单位：结构简式：结构简式：结构简式：结构简式：种类：种类：种类：种类：5 5、氨基酸连接方式、氨基酸连接方式 占细胞干重的占细胞干重的5050以上，细胞中含量最多的有机物以上，细胞中含量最多的有机物C C、HH、OO、N N高分子化合物高分子化合物氨基酸氨基酸NHNH2 2R RH HC CCOCOOHOH脱水缩合脱水缩合第2页，此课件共39页哦知识回顾知识回顾-有关蛋白质的几个问题：有关蛋白质的几个问题：6 6 6 6、肽键、肽键、肽键、肽键7 7 7 7、分子结构、分子结构、分子结构、分子结构8 8、蛋白质多样性的原因：、蛋白质多样性的原因：(多样性的多样性的根本原因根本原因)9 9 9 9、蛋白质的鉴定方法、蛋白质的鉴定方法、蛋白质的鉴定方法、蛋白质的鉴定方法氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸肽链肽链肽链肽链蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质脱水缩合脱水缩合脱水缩合脱水缩合盘曲折叠盘曲折叠盘曲折叠盘曲折叠（n n n n条）条）条）条）COCONHNH 氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别端；多肽链的空间结构千差万别10101010、生理功能、生理功能、生理功能、生理功能 细细胞胞和和生生物物体体的的结结构构物物质质，是是人人体体发发育育和和组组织织更更新新的的主主要要原原料料，具具有有运运输输、调调节节、免免疫疫、催催化化等等作作用用，是是一一切切生生命命活活动动的主要承担者的主要承担者第3页，此课件共39页哦基础知识基础知识1.1.分离生物大分子的基本思路：分离生物大分子的基本思路：选用一定的选用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有的方法分离具有不不同物理或化学性质同物理或化学性质的的生物大分子。生物大分子。2.2.蛋白质分离和提取的原理：蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质根据蛋白质各种特性的差异各种特性的差异，如，如分子的形状分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来等等，可以用来分离分离不同种类不同种类的蛋白质。的蛋白质。第4页，此课件共39页哦阅读并回答（阅读并回答（P64P64）1 1、凝胶色谱法另一个名称；凝胶色谱法另一个名称；2 2、凝胶色谱法分离蛋白质的依据；凝胶色谱法分离蛋白质的依据；3 3、凝胶的实质；凝胶的实质；4 4、凝胶色谱法凝胶色谱法 5 5、凝胶色谱法的原理。、凝胶色谱法的原理。基础知识基础知识（一）（一）凝胶色谱法凝胶色谱法第5页，此课件共39页哦1 1、凝胶色谱法的凝胶色谱法的别名：别名：分配色谱法分配色谱法 是根据相对分予质量的大小分离蛋白质的有效方法。是根据相对分予质量的大小分离蛋白质的有效方法。4 4、凝胶、凝胶 性质：一些性质：一些微小的多孔球体微小的多孔球体，球球内含许多内含许多贯穿的通道；贯穿的通道；化学本质：化学本质：多糖类化合物：多糖类化合物：实例：实例：葡聚糖、琼脂糖：葡聚糖、琼脂糖：2 2、凝胶色谱法的凝胶色谱法的概念：概念：根据被分离物质的根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，蛋白质相对分子质量的大小，利用具利用具有网状结构的凝胶的有网状结构的凝胶的分子筛作用，分子筛作用，来进行分离。来进行分离。基础知识基础知识（一）（一）凝胶色谱法凝胶色谱法3 3、依据的特性、依据的特性蛋白质分子量的大小。蛋白质分子量的大小。第6页，此课件共39页哦基础知识基础知识（一）（一）凝胶色谱法凝胶色谱法5 5 5 5、具体过程、具体过程第7页，此课件共39页哦 原理：原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（胶内部的通道，路程（），移动速度），移动速度（），而（），而（）的）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（）移动，路程（），移动速度（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。离。相对分子质量较小相对分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快基础知识基础知识（一）（一）凝胶色谱法凝胶色谱法第8页，此课件共39页哦1、缓冲物质有哪些？、缓冲物质有哪些？2、缓冲溶液的作用是什么？、缓冲溶液的作用是什么？3、怎样配制缓冲溶液？、怎样配制缓冲溶液？基础知识基础知识（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液第9页，此课件共39页哦1 1、缓冲溶液缓冲溶液概念概念 在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液或稍加稀释不引起溶液PHPH发生明显变化的作用叫做发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。能够抵制外界的酸或碱的对溶液的能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PHPH值的影响，值的影响，维持维持PHPH基本不变。基本不变。2 2 2 2、缓冲溶液缓冲溶液作用作用作用作用基础知识基础知识（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液3 3、缓冲溶液缓冲溶液配制配制 通常由通常由1 12 2种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在不同就可以制得在不同PHPH范围内使用的范围内使用的缓冲液。缓冲液。第10页，此课件共39页哦思考：思考：你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的目的是利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境，环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色红色)和科学研究和科学研究(活性活性)。基础知识基础知识（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液第11页，此课件共39页哦阅读阅读第第65页的相关内容，页的相关内容，回答回答以下问题：以下问题：1、电泳的概念；、电泳的概念；2、电泳的原理；、电泳的原理；3、电泳的种类；、电泳的种类；4、SDS的作用。的作用。基础知识基础知识（三）电泳（三）电泳第12页，此课件共39页哦1 1、概念、概念带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。基础知识基础知识（三）电泳（三）电泳 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。反的电极移动。反的电极移动。反的电极移动。第13页，此课件共39页哦基础知识基础知识（三）电泳（三）电泳 2、原理：许多重要的生物大分子，如（、原理：许多重要的生物大分子，如（）等都具有）等都具有()在在()下，这些基团会带上（下，这些基团会带上（）。在电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（场的作用下，这些带电分子会向着与其（）移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（）以及分子本身（）以及分子本身（）、（）、（）的不）的不同使带电分子产生不同的（同使带电分子产生不同的（），从），从而实现样品中各种分子的分离。而实现样品中各种分子的分离。多肽、核酸多肽、核酸可解离的基团可解离的基团正电或负电正电或负电所带电荷相反的电极所带电荷相反的电极带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度一定的一定的PH第14页，此课件共39页哦.常见电泳类型：常见电泳类型：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳SDSSDS聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳 迁移率取决于它所迁移率取决于它所迁移率取决于它所迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分带净电荷的多少以及分带净电荷的多少以及分带净电荷的多少以及分子的大小、形状。子的大小、形状。子的大小、形状。子的大小、形状。电泳迁移电泳迁移率完全取决于率完全取决于分子的大小。分子的大小。基础知识基础知识（三）电泳（三）电泳第15页，此课件共39页哦为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入入()。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成的作用下会解聚成单条肽链，单条肽链，因此测定的结果只是因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，复合物，SDS所所带负电荷带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于电泳迁移率完全取决于()。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS单条肽链的分子量单条肽链的分子量分子的大小分子的大小第16页，此课件共39页哦实验操作实验操作阅读阅读课本相关内容，课本相关内容，思考思考以下问题：以下问题：1、蛋白质的提取和分离一般分成几步？、蛋白质的提取和分离一般分成几步？2、样品怎样处理？、样品怎样处理？3、蛋白质怎样分离？、蛋白质怎样分离？第17页，此课件共39页哦实验操作实验操作（一）样品处理（一）样品处理问：问：蛋白质提取和分离步骤？蛋白质提取和分离步骤？（1）样品处理：包括洗涤红细胞；）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白的释放；血红蛋白的释放；离心等操作收集血红蛋白溶液。离心等操作收集血红蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。）粗分离：透析除去分子较小的杂质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。质除去。（4）纯度鉴定：通过）纯度鉴定：通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。第18页，此课件共39页哦血血液液血血 浆浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白（9090）2 2个个a a肽链肽链2 2个个一肽链一肽链4 4个亚铁红素基团个亚铁红素基团血液组成血液组成实验操作实验操作 （一）样品处理（一）样品处理第19页，此课件共39页哦 血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的组血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的组成中，约成中，约9090是血红蛋白。血红蛋白由四个肽链组成是血红蛋白。血红蛋白由四个肽链组成(如图如图)，包括两，包括两个个-肽链和两个肽链和两个-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分了二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而此基团可携带一分子氧或一分了二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈现红色。呈现红色。血血血血红红红红蛋蛋蛋蛋白白白白2 2个个a a肽链肽链2 2个个一肽链一肽链4 4个亚铁红素基团个亚铁红素基团实验操作实验操作 （一）样品处理（一）样品处理第20页，此课件共39页哦 每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团可携此基团可携带带一分子氧或一分子二氧化碳，一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红血红素素而呈红色而呈红色血红蛋白组成及作用血红蛋白组成及作用选材选材 本课题可选用猪、牛、羊或其他本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物脊椎动物的血液的血液来分离血红蛋白。来分离血红蛋白。实验操作实验操作 （一）样品处理（一）样品处理第21页，此课件共39页哦1 1、红细胞的洗涤、红细胞的洗涤 阅读阅读课本内容，课本内容，回答回答以下问题：以下问题：1、洗涤的目的？、洗涤的目的？2、怎样洗涤？、怎样洗涤？3、洗涤干净的标志是什么？、洗涤干净的标志是什么？除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。分离纯化。采样分离吸浆倒红加液搅拌重洗三次采样分离吸浆倒红加液搅拌重洗三次 直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。实验操作实验操作 （一）样品处理（一）样品处理第22页，此课件共39页哦 速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果。等一同沉淀达不到分离的效果。问：问：1 1、洗涤操作过程中，为什么要、洗涤操作过程中，为什么要低速短时间低速短时间离心？离心？2 2、为了使红细胞洗涤干净，需如何处理？、为了使红细胞洗涤干净，需如何处理？1 1、红细胞的洗涤、红细胞的洗涤重复洗涤三次重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。红细胞已洗涤干净。实验操作实验操作 （一）样品处理（一）样品处理第23页，此课件共39页哦2.2.血红蛋白的释放血红蛋白的释放 血红蛋白的释放血红蛋白的释放 将洗涤好的红细胞倒入将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。释放出血红蛋白。说出：说出：蒸馏水和甲苯的作用。蒸馏水和甲苯的作用。实验操作实验操作 （一）样品处理（一）样品处理第24页，此课件共39页哦3.3.分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液问：问：1 1、采用什么方法、采用什么方法分离血红蛋白？分离血红蛋白？2 2、离心分层后，各层的成分各是什么？、离心分层后，各层的成分各是什么？3 3、用滤纸过滤，去掉什么成分？、用滤纸过滤，去掉什么成分？实验操作实验操作 （一）样品处理（一）样品处理第25页，此课件共39页哦 取取1mL1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有透析袋放入盛有300mL300mL的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/L20mmol/L的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透），透析析12h12h。4.4.透析透析问：问：透析过程及透析过程及透析目的？透析目的？透析目的：透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。除去样品中分子量较小的杂质。实验操作实验操作 （一）样品处理（一）样品处理第26页，此课件共39页哦4.4.透析透析实验操作实验操作 （一）样品处理（一）样品处理第27页，此课件共39页哦 阅读课本相关内容，了解凝胶色谱的操作过程。阅读课本相关内容，了解凝胶色谱的操作过程。实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作第28页，此课件共39页哦实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作（1）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端需用砂两端需用砂纸磨平。纸磨平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔-挖穴挖穴-安管安管-覆网覆网-纱包纱包-插管插管 注意事项注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管。组装：组装：将上述三者按相应位置组装成一个将上述三者按相应位置组装成一个整体。整体。安装其他附属结构。安装其他附属结构。第29页，此课件共39页哦2.2.凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填问问:1 1、凝胶的选择材料、凝胶的选择材料?G?G代表意义代表意义?2 2、简单步骤、简单步骤?3 3、注意点：、注意点：实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作选择交联葡聚糖凝胶（选择交联葡聚糖凝胶（G-75G-75）“G G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围,7575表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.57.5克。克。第30页，此课件共39页哦2.2.凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填问问:1 1、凝胶的选择材料、凝胶的选择材料?G?G代表意义代表意义?2 2、简单步骤、简单步骤?3 3、注意点：、注意点：实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作步骤操作要求立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液装填悬浮液凝胶颗粒洗脱液凝胶颗粒洗脱液沸水浴沸水浴 凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液配制悬浮液计算称量凝胶计算称量凝胶固定色谱柱固定色谱柱第31页，此课件共39页哦3.3.凝胶装填时尽量紧密，以降低凝凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙；胶颗粒之间的空隙；装填凝胶柱时装填凝胶柱时不得气泡存在。（不得气泡存在。（因为气泡会搅乱因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。）低分离效果。）2.2.凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作问问:1 1、凝胶的选择材料、凝胶的选择材料?G?G代表意义代表意义?2 2、简单步骤、简单步骤?3 3、注意点：、注意点：第32页，此课件共39页哦 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm50cm高的操作压下，用高的操作压下，用300mL300mL的的20mmol/L20mmol/L的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗涤平衡）充分洗涤平衡12h12h。问：问：洗涤平衡的溶液？洗涤平衡的溶液？注意什么？注意什么？1 1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果；液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果；2 2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作2.2.凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填第33页，此课件共39页哦3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱 实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作第34页，此课件共39页哦3.3.样品加入与洗脱样品加入与洗脱调节缓冲液面调节缓冲液面滴加透析样品滴加透析样品 吸管吸吸管吸1mL1mL样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作样品渗入凝胶床样品渗入凝胶床 加样后，加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。进入凝胶层后，关闭下端出口。第35页，此课件共39页哦收集：收集：待待红色的蛋白质红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每每5ml5ml一试管，连续收集。（一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）。）。洗脱洗脱 小心加入物质的量浓度为小心加入物质的量浓度为20 mmol20 mmolL L的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液(pH(pH为为7.0)7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。洗脱。3.3.样品加入与洗脱样品加入与洗脱实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作问：问：正确的加样操作，注意什么？正确的加样操作，注意什么？1 1、不要触及破坏凝胶面、不要触及破坏凝胶面2 2、贴壁加样、贴壁加样3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动、使吸管管口沿管壁环绕移动第36页，此课件共39页哦答：让血红蛋白处在稳定的答：让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持结构和功能。范围内，维持结构和功能。讨论：讨论：1 1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？的目的是什么？实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作讨论：讨论：2 2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？点对你进行蛋白质得分离有什么意义？答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。过程非常直观，大大简化了实验操作。第37页，此课件共39页哦 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的纯化；即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。讨论：讨论：3 3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作第38页，此课件共39页哦课题课题3 3 血红蛋白的提取与分离血红蛋白的提取与分离知识总结知识总结血血红红蛋蛋白白的的提提取取和和分分离离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法凝胶色谱法原原 理理分离过程分离过程凝胶电泳法凝胶电泳法缓冲溶液缓冲溶液组组 成成作作 用用蛋白质的蛋白质的提取分离提取分离样品处理样品处理粗粗 分分 离离纯纯 化化纯度鉴定纯度鉴定第39页，此课件共39页哦