蛋白质的修饰和表达课件.pptx

蛋白质的修饰和表达第1页，此课件共136页哦u第一节蛋白质修饰的化学途径u第二节蛋白质改造的分子生物学途径u第三节重组蛋白质的表达一、功能基团的特异性修饰1.多位点取代2.单一的限制性取代3.次级取代二、基于蛋白质片段的嵌合修饰1.嵌合蛋白质非共价缔合系统2.二硫键与嵌合蛋白质的形成3.嵌合蛋白质通过化学激活形成肽键4.嵌合蛋白质通过酶连接反应形成肽键5.通过非肽键形成嵌合蛋白质第九讲 蛋白质的修饰和表达第2页，此课件共136页哦l虽然基因重组表达技术的应用对蛋白质结构功能的研究以及蛋白质分子的改造提供了一条非常有效的途径，然而用化学方法直接对蛋白质分子进行修饰有时仍然是很有用的方法，可以弥补正常生物表达体系的不足。例如，利用化学法和酶法相结合，可以从猪胰岛素制备人胰岛素；通过区段特异性取代制备适合于肿瘤定位的抗体；对用重组方法得到的多肽进行C末端酰化以及制备各种类型的蛋白质嵌合体等。因此化学法和重组方法的相互补充，使蛋白质工程的实施更有效。l蛋白质工程的化学方法通常是产生半合成的结构，在此结构中一个天然的多肽与一个人造（或化学修饰）的多肽相缔合。产生这种缔合的方法主要有4种：非共价缔合、产生二硫键、形成肽键以及产生非天然型的共价键连接。第一节蛋白质修饰的化学途径第3页，此课件共136页哦l在20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和的条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、巯基和羧基特别容易产生有用的取代。因为任何给定的氨基酸残基在蛋白质分子中可能出现不止一次，如果用化学的方法对氨基酸进行修饰时，正常情况下所有相关的氨基酸侧链都要被取代。l对于氨基和羧基基团，尽管处在侧链上和末端基团的pK值有差别，但在化学上很难将肽链的-氨基或-羧基基团与侧链上的氨基或羧基相区别。l很多在临床上重要的肽其C末端是被酰化的。但当用重组的方法得到这些产物时，其C末端是自由羧基。在自然界能进行这种酰化作用的氧化酶体系很难实用化。寻找一种有效的方法，使C末端的谷氨酸和天冬氨酸酰胺化，而不作用于处在肽链中的谷氨酸和天冬氨酸仍是努力的方向。一、功能基团的特异性修饰第一节蛋白质修饰的化学途径第4页，此课件共136页哦氨基可用取代基进行修饰。常用的取代基有两种：t-butyloxy-carbonyl(Boc)是典型的酸不稳定取代基，而Methanesulphonyl ethyloxy carbonyl(Msc)是典型的碱不稳定取代基。这两种基团常用于对氨基进行临时保护，以防止其他反应试剂对氨基的作用。当其他反应完成后，可分别用无水三氟乙酸和强碱将Boc和Msc基团去除，很多多肽或小分子蛋白质在这些基团去除后仍保持其活性。一、功能基团的特异性修饰第一节蛋白质修饰的化学途径1.多位点取代(1)常规的氨基保护 第5页，此课件共136页哦l绝大多数氨基取代反应至今尚无可靠方法将-氨基和-氨基区分，但亚氨代乙酰化反应是一特例，尽管对-氨基和-氨基的区分尚不完美。当-氨基几乎完全被亚氨代乙酰基取代时，-氨基在很大程度上可不被修饰。被亚氨代乙酰基取代的氨基仍可解离。完全亚氨代乙酰化的蛋白质仍保持其在水溶液中的可溶性，其性质与修饰前一样或相近，因此通常在修饰后这一基团可不必从蛋白质分子上去除。只有在处于与蛋白质活性相关的赖氨酸残基的侧链被修饰后，导致蛋白质活性丧失。l然 而，亚 氨 代 乙 酰 化 反 应 在 较 低pH值 下 可 形 成 烷 基 亚 胺，N-烷基亚胺可进一步与赖氨酸侧链产生交联，从而影响被修饰蛋白质的活性。因此，在对-氨基进行修饰时，要适当地控制反应条件，使反应向着形成N-乙酰亚胺化的反应进行。1.多位点取代(2)亚氨代乙酰基 第6页，此课件共136页哦l羧基的甲基酯化一般可以在室温下将蛋白质加入到含有乙酰氯的无水甲醇中来完成。由于反应产生盐酸，需将反应物及时地稀释到冰水中，小心地用碱中和盐酸以使多肽或小分子蛋白质活力得以保持。l半胱氨酸出现在蛋白质分子中的概率比其他氨基酸要小。相对于其他功能基团而言，巯基有着十分不同类型的化学反应，因此半胱氨酸残基是一个很好的靶位，利用这一靶位可以将少数的取代基团引入到蛋白质分子的确定位置。当一对半胱氨酸通过二硫键相连时，通常可加入二硫苏糖醇之类的还原剂或通过磺酸氧化将其打开。用磺酸氧化的方法往往比简单还原的方法要好，因为磺酸氧化形成的半胱氨酸的磺酸化残基对氧化作用很稳定，而且可以通过巯基将其还原成自由琉基。1.多位点取代(3)其他的侧链取代 第7页，此课件共136页哦l用化学方法对蛋白质分子上单一的特定功能基团（如-氨基）进行修饰而不对与其相类似的基团（如-氨基）产生作用是一件很困难的事。少数的化学试剂，如-异硫氰酸苯酯在严格控制的条件下可对-氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于-氨基。由于酶蛋白可以将两个极相似的基团区分开来，所以可利用酶蛋白的这一特异性对蛋白质分子的功能基团进行特异性修饰。l在天然状态下，蛋白水解酶是催化肽键的水解，其作用机制是酶的活性位点首先被一羧基酯化（此羧基来自于被切开的肽键），所产生的酰化-酶中间体随之通过水分子的亲核攻击而分解：2.单一的或限制性取代 第一节蛋白质修饰的化学途径第8页，此课件共136页哦l按照同样的机制，上面这个水解反应可以逆向进行，这样在蛋白水解酶的存在下肽键可以重新形成，即一个肽的氨基（或其他非肽的亲核物）攻击酰化-酶中间体，从而导致肽键的形成。这一逆反应（肽连接）的成立无论在科学理论上还是在实际应用上都具有重要的意义。因为在常规肽合成中对氨基酸侧链进行保护的操作可以省去，以这种可逆方式进行的酶连接反应至少可以达到每年100kg的生产规模。第一节蛋白质修饰的化学途径 2.单一的或限制性取代 第9页，此课件共136页哦l特异性的C 末端取代是另一类反应：第一节蛋白质修饰的化学途径l通常在水溶液中，由蛋白水解酶所催化的反应以压倒的优势向水解方向进行。因为在反应基质中水分子具有高活性；在相当宽的pH值范围内，新释放出的氨基和羧基具有解离倾向。如果要使式(3-3)或式(3-4)的反应逆向进行，通常要耗费大量的能量去抑制这些荷电的倾向。如果所生成的产物沉淀，根据质量作用的原则将推动此反应向着合成方向进行。但当产物是大分子时，产物与底物之间在溶解度上的差异很小，利用某些巧妙的生物学上特异亲和过程来捕捉回收产物的研究甚少。2.单一的或限制性取代 第10页，此课件共136页哦l围绕能量问题人们提出了一个很有吸引力的方法，即向反应混合物中加入未荷电且易与其融和的溶剂(共溶剂，cosolvent)。共溶剂不但减少了水的有效浓度，而且若加入量足够，还可使介电常数降得很低，结果使-氨基和羧基解离过程的pK值变得很接近，最终导致解离能对偶联反应的妨害大大降低，使反应向着合成方向进行。l常用的共溶剂有丁烷-1,4-二醇、甘油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等。这些溶剂的变性倾向大致上依序增加。因为在加入溶剂的同时要保持水解酶的活力，所以在实践中要找到水的最适含量。在可控的条件下，利用蛋白水解酶催化肽键的形成有着很高的应用价值。第一节蛋白质修饰的化学途径 2.单一的或限制性取代 第11页，此课件共136页哦第一节蛋白质修饰的化学途径需要指出的是：第一，对于成功的连接取代反应，原来肽键的断开和随后的偶联不必作为一个单一的浓缩过程。如果在肽键已经切开的情况下，合成反应要快很多倍，因而在正常水解条件下使肽键断开是最简单和最好的办法。然后在同一个反应管中，通过下列操作校正反应条件，使反应向着有利于肽键合成的方向进行。这些校正过程包括：对连接反应来说加入大大过量的氨基成分(式(3-5)；对于C末端取代来说加入大大过量的其他亲核化合物以及共溶剂，将pH值改变到所要的新pK值的中点，通常加入足够额外的酶去补偿由于pH值的变化和共溶剂的存在而导致的催化反应变慢。第二，此方法并不需要肽底物没有其他的侧链，而这些侧链通常在水解反应中来满足蛋白水解酶特异性的需要。2.单一的或限制性取代 第12页，此课件共136页哦第一节蛋白质修饰的化学途径相对于-氨基而言，-异硫氰酸苯酯对-氨基的修饰并非绝对特异，但当试剂限制在低浓度，特别是pH值保持在足够低而使-氨基和-氨基解离的程度出现最大差异时，此反应对-氨基而言有相当的特异性。严格地说，这个反应并不对-氨基形成一个可逆的保护，但经酸处理时能将-异硫氰酸苯酯和与其反应的N末端氨基酸残基去除。-异硫氰酸苯酯与-氨基反应如下 2.单一的或限制性取代(l)-异硫氰酸苯酯对-氨基的选择性第13页，此课件共136页哦第一节蛋白质修饰的化学途径 2.单一的或限制性取代(2)C末端取代蛋白质活性亲核成分的产生 将式(3-5)的R-NH2换成H2N-NH-CO-NH-NH2(1,1-羰基二酰肼)。这个化合物有若干方便之处：作为酰肼，其一NH2基的pK值比通常的-氨基要低几个单位，这样，-COOH和-NH2成分的pK值已很接近羰基酰肼，使得共溶剂不再必需；这种化合物分子对称，意味着-NH-NH2基团的有效浓度两倍于按mg/ml 的计算值；第14页，此课件共136页哦第一节蛋白质修饰的化学途径 2.单一的或限制性取代(2)C末端取代蛋白质活性亲核成分的产生 与蛋白质分子的羧基相互作用形成的产物是具有区域特异性的酰肼基团，这个强的亲核物的化学反应性与蛋白质分子中的任何天然功能基团很不像。这种反应性使得其可在温和的水溶液条件下与各种试剂进行特异性反应，而这些试剂通常不能与蛋白质分子上的功能基团相反应。这样，可用酰肼对胰岛素、抗体片段、完整抗体等的C末端进行特异性修饰。第15页，此课件共136页哦第一节蛋白质修饰的化学途径 2.单一的或限制性取代(3)C末端取代蛋白醛的产生 醛基是另一种符合下列两个条件的反应基团：其反应性与蛋白质天然功能基团不同；可在温和的水溶液条件下进行反应。在上述反应中，H2NCH2-CHOH-CH2NH2作为亲核化合物，高碘酸作为氧化剂。由于H2NCH2-CHOH-CH2NH2结构对称，因此其有效工作浓度加倍。但这种化合物与羰酰肼不同，它是一类初级胺，其具有通常的pK值并且与蛋白质C末端进行反应需要共溶剂存在。通过这些反应所形成的蛋白醛可与其他试剂进行特异性反应。第16页，此课件共136页哦第一节蛋白质修饰的化学途径如果将式(3-5)中的R-NH2改成NH3，就可以得到一个特异性C末端被酰胺化的产物。虽然此反应的产率不是很高，但仍可用。如果R-NH2是一个氨基酸酰胺，则可得到特异性地酰胺化的产物，且产率非常高。这一方法很有希望代替天然酰胺化系统而用于大规模生产中。2.单一的或限制性取代(4)通过蛋白质水解的逆反应产生蛋白和肽的-酰胺第17页，此课件共136页哦第一节蛋白质修饰的化学途径l此方法只适用于糖蛋白，所发生的化学反应更似在高碘酸和邻位二醇之间的反应。如果糖蛋白是研究主体，在蛋白质分子上最好是只有单一的糖基元或少数几个位点被糖基化。太多的糖基化区会使氧化反应产生太多的醛基位点。所生成的蛋白醛可以进一步同其他分子产生特异性的反应。l绝大多数糖二醇并没有像1-氨、2-羟基化合物那样对高碘酸的反应性，因此要用较高浓度的高碘酸，又不可能用二醇作为原位清除剂，所以在这样条件下，蛋白质分子中的一些敏感残基如半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸可能遭到某种程度的氧化。2.单一的或限制性取代(5)蛋白醛由糖的化学氧化产生 第18页，此课件共136页哦第一节蛋白质修饰的化学途径 3.次级取代(1)与蛋白醛偶联亲核取代物 l上面所说的方法是位点或区域特异性地产生蛋白质活性亲核物和蛋白醛，在正常反应条件下这些衍生物可以保持其活性。因此，可以利用这些在自然界不存在的化学反应性与具有适当互补反应性的分子进一步反应，从而形成非常有用的接合体。氨基-氧化合物(羟胺衍生物)很容易同蛋白醛形成肟键：肟键在生理条件或近生理条件下相当稳定，因而很少需要通过还原来稳定和蛋白之间形成的连接。另一方面腙健随着时间慢慢地被破坏，因而与蛋白质分子之间所形成的腙键在临床上常用于需要将所连接的分子慢慢释放的情况。为了使通过腙键连接的分子完全稳定，腙键可通过用氢硼化腈的还原来稳定：第19页，此课件共136页哦第一节蛋白质修饰的化学途径 3.次级取代(2)与蛋白质活性亲核物偶联醛取代物 l具有自由-氨基的丝氨酰和苏氨酰基化合物可极快地被高碘酸氧化，所产生的化合物易与蛋白质亲核物偶联。这种反应不但可用于产生小的，非蛋白分子的丝氨酰或苏氨酰衍生物，也可以用于整个蛋白质或蛋白片段，其前提条件是丝氨酰或苏氨酰残基必须处于蛋白质或蛋白片段的N末端，因为对链内的丝氨酰或苏氨酰残基不能产生作用。l另外预先存在的氨-氧化合物能被转化成醛基化合物。这是一个非常有用的方法，因为只要保存足够的氨-氧化合物，就可以随时将其转变成醛的形式。第20页，此课件共136页哦一个蛋白质的三维结构在最大程度上依赖于侧链间的非共价相互作用。在多肽链中如果出现一个切口并不必然使多肽链的两部分分开（在少数情况下，在多肽链中出现多于一个切口，蛋白质分子的结构仍可维待），而且经常甚至能保持其生物活性。如果在某些变性系统中，这种非共价的相互作用被破坏，可导致两个多肽链分开。如果将两个片段再混合到一起，在非变性的基质中仍可形成原来的构型，活力也可以随之恢复。这一现象可用来产生半合成的类似物。进一步发现充分利用非共价缔合的方法研究蛋白质功能构象的形成和功能表达的关系，将是非常有意义的。二、基于蛋白质片段的嵌合修饰 第一节蛋白质修饰的化学途径1.嵌合蛋白质非共价缔合系统 通过非共价键相互作用、二硫键、常规肽键（通过化学法或酶法产生）或其他非肽共价键，可以将较小的肽段连在一起，这就是通过半合成对蛋白质进行工程操作的原则。第21页，此课件共136页哦彼此分开的多肽链片段可以通过二硫键连接起来，这是产生半合成类似物的另一种方法。如果这些键桥用还原剂（如DTT二硫苏糖醇）处理被打开，则多肽片段彼此分开。这些片段中的一个片段可以与适当的被修饰的或合成的另一肽段相混合，通过重新形成二硫键而形成新的嵌合分子。通过这种方法使人们对胰岛素和抗体的结构功能有了很清楚的了解。二、基于蛋白质片段的嵌合修饰 第一节蛋白质修饰的化学途径2.二硫键与嵌合蛋白质的形成 第22页，此课件共136页哦l很多方法可以形成肽键，这可以在有关肽合成的有关文献中查到。在此只介绍利用活性酯的方法将单一氨基酸残基加到一个肽链的N末端的方法。其主要方式是利用活性酯实现化学偶联，反应过程如式(3-12)。l在这个反应中，对除了-氨基以外的所有氨基首先要进行保护，当然这种保护是可逆的。人们曾利用这一方法成功地产生细胞色素C 的类似物。二、基于蛋白质片段的嵌合修饰 第一节蛋白质修饰的化学途径3.嵌合蛋白质通过化学激活形成肽键 第23页，此课件共136页哦 二、基于蛋白质片段的嵌合修饰 第一节蛋白质修饰的化学途径4.嵌合蛋白质通过酶连接反应形成肽健 l蛋白水解酶有能力进行与水解可逆的反应。在此我们更加关注一些非自然界的氨基酸或肽的新的亲核物。(1)从猪胰岛素生产人胰岛素 猪胰岛素与人胰岛素分子在一级结构上的惟一差异是在B链的C末端氨基酸残基，猪胰岛素的B30是Ala残基，而人的是Thr残基。猪胰岛素来源丰富，如能将猪胰岛素改造成人胰岛素，在临床应用上将是非常有意义的。Thr(But)-OBut是苏氨酸的侧链-OH和-COOH用叔丁基保护，与猪胰岛素混合，在胰蛋白酶的催化下，使Thr(But)-OBut取代猪胰岛素B30位的丙氨酸(Ala)，在Lys和Thr之间形成肽键，叔丁基随后用三氟乙酸处理去除，这样就使猪胰岛素转变成人胰岛素。目前用与此相似的方法可以每年从猪胰岛素生产100kg 水平的人胰岛素用于人类糖尿病的治疗。第24页，此课件共136页哦 二、基于蛋白质片段的嵌合修饰 第一节蛋白质修饰的化学途径4.嵌合蛋白质通过酶连接反应形成肽健(2)片段的缩合 新的亲核物不必须像单个氨基酸衍生物那样小，较大的肽也可以作为亲核物与半合成的肽缩合形成嵌合蛋白质。然而随着肽亲核物分子量的增加，其缩合效率就受很大影响。产生这种缩合效率下降的原因中，反应物的浓度限制比空间障碍还要大。(3)通过酶法与活性酯偶联 活性酯偶联所用的亲核物是活性酯，其-氨基不需要保护。以二氯苯酯为例，其反应是：羟基琥珀酰亚胺酯也可以作为活性酯通过酶进行偶联。第25页，此课件共136页哦 二、基于蛋白质片段的嵌合修饰 第一节蛋白质修饰的化学途径5.通过非肽键形成嵌合蛋白质 利用双功能试剂可以将不同的蛋白质分子连到一起。常用的方法是将双功能的接头与两个蛋白质分子中的赖氨酸残基侧链相连接。蛋白质-蛋白质分子间的连接可以更可控和具位点特异性，如可以用主链肟键产生尾-尾相连二聚体。这类二聚体可用于进行多方面的研究，比如，若单体是适于活化的抗体的Fab片段的话，就可以利用这种方法制备具不同功能的F(ab)2 类似物。同样，通过将一个C末端活化的蛋白质亲核物与一个特异性N末端醛衍生物之间相连，也可以产生头尾相连的蛋白质嵌合体。第26页，此课件共136页哦u第一节蛋白质修饰的化学途径u第二节蛋白质改造的分子生物学途径u第三节重组蛋白质的表达一、编码基因的专一性位点和区域性定向突变1.编码基因的专一性位点突变2.区域性定向突变二、基因融合与基因剪接1.利用基因融合技术表达外源基因的缘由2.基因融合的策略3.产生蛋白质分子嵌合体的方法4.蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接第九讲 蛋白质的修饰和表达三、tRNA介导定点搀入非天然氨基酸第27页，此课件共136页哦基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。这一技术的出现使蛋白质结构功能关系的研究产生了革命性的变化，可以使人们随心所欲地研究特定氨基酸残基、特定结构元件在蛋白质结构形成和功能表达中的作用。根据其特点，可将基因突变分为两大类：位点特异性突变和随机突变。位点特异性突变又可大体分为三种类型：一类是通过寡核苷酸介导的基因突变；第二类是盒式突变或片段取代突变；第三类是利用聚合酶链反应(PCR)，以双链DNA为模板进行的基因突变。无论哪种方法都可以在为蛋白质编码的基因序列上产生插入、缺失、取代等突变。第二节蛋白质改造的分子生物学途径第28页，此课件共136页哦 一、编码基因的专一性位点和区域性定向突变1.编码基因的专一性位点突变专一性位点突变又称特异性位点突变。这类突变都是在含有突变序列的寡核苷酸引物介导下进行的，因此又称为寡核苷酸介导的位点特异性突变。这种突变的方法从问世至今不断更新，特别是PCR 技术出现后变得更高效。第二节蛋白质改造的分子生物学途径(l)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 第29页，此课件共136页哦 一、编码基因的专一性位点和区域性定向突变1.编码基因的专一性位点突变第二节蛋白质改造的分子生物学途径(l)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 关于DNA模板的制备：根据所用的方法，用于进行位点特异性突变的DNA模板可以是单链DNA或双链DNA。对于双链DNA而言，一般制备质粒DNA的方法都可以满足其需要；而对于单链DNA而言，可以直接从M13噬菌体载体或通过噬菌粒来制备单链DNA，用于突变的单链DNA模板要足够纯净，即使有小的RNA分子（来源于裂解细胞）污染，也可能造成随机延伸起始。第30页，此课件共136页哦 一、编码基因的专一性位点和区域性定向突变1.编码基因的专一性位点突变第二节蛋白质改造的分子生物学途径(l)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 关于寡核苷酸突变引物的设计和选择：用于突变的引物必须具备如下特性：(a)它们必须与在模板链上的目标DNA序列有必要的互补区；(b)它们必须足够长，以便特异地与目标DNA序列退火；(c)突变引物应尽可能避免形成稳定二级结构的回文序列、重复序列或自身互补序列；第31页，此课件共136页哦 一、编码基因的专一性位点和区域性定向突变1.编码基因的专一性位点突变第二节蛋白质改造的分子生物学途径(l)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 关于寡核苷酸突变引物的设计和选择：(d)所选用的突变引物不能同目标基因其他区域和载体DNA形成稳定的杂交体。这可以用计算机软件同源性分析程序来确定。如果它们之间的序列有连续8个以上的碱基完全配对，就需对寡核苷酸突变引物同模板DNA的杂交特异性进行分析，以确定突变引物的可用性。第32页，此课件共136页哦 一、编码基因的专一性位点和区域性定向突变1.编码基因的专一性位点突变第二节蛋白质改造的分子生物学途径(l)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 突变寡核苷酸序列的设计取决于所要产生的突变类型：(a)对用于取代、插入、缺失单个核苷酸的寡核苷酸突变引物，一般的长度为17-19个核苷酸，其突变位点距其5端为8-10个核苷酸，距其3端为7-9个核昔酸。这种设计可保证寡核苷酸引物的5端和3端同模板形成完全稳定的杂交体，使突变效率提高。第33页，此课件共136页哦 一、编码基因的专一性位点和区域性定向突变1.编码基因的专一性位点突变突变寡核苷酸序列的设计取决于所要产生的突变类型：(b)对用于产生多处缺失、插入或取代两个以上毗邻核苷酸突变引物，一般长度为25个核苷酸以上，其突变区的两侧至少要有12-15个同模板DNA完全配对的核苷酸，以确保在引物延伸的温度下，突变寡核苷酸引物的两边都能稳定地与模板DNA退火，进行碱基配对，可根据公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)，推算引物两侧冀区之一的热稳定性。当错配碱基侧冀或待删除的环圈序列侧翼的双链区的Tm值大约为35-40时，引物介导的突变将卓有成效。为了得到正确的突变体，在突变工作完成后，要对目标DNA的全长进行序列分析，以排除引物延伸过程中在其他位点出现错误搀入，而使目的基因产生不必要的新突变位点。第34页，此课件共136页哦 一、编码基因的专一性位点和区域性定向突变1.编码基因的专一性位点突变第二节蛋白质改造的分子生物学途径(l)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 关于寡核苷酸突变引物与模板DNA的退火和引物延伸条件：(a)对于突变引物与模板DNA的比率。在标准的双引物方法中，两个寡核苷酸引物与模板DNA的摩尔比为10-50。引物同模板DNA之间的退火通常将二者的混合物加热到推算的Tm值以上20，以使二级结构区变性，然后慢慢冷却到室温，当反应混合物的温度降低到相应Tm值以下时，即可形成突变引物与DNA模板的杂交体。(b)引物延伸。退火完成后，再加入4种脱氧核苷三磷酸、三磷酸腺苷、DNA聚合酶、DNA连接酶等，在适当的温度下进行2-15h的延伸反应。第35页，此课件共136页哦 一、编码基因的专一性位点和区域性定向突变1.编码基因的专一性位点突变第二节蛋白质改造的分子生物学途径(l)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 关于DNA聚合酶的选择：目前一般选择T4 DNA聚合酶和T7 DNA聚合酶。Klenow酶由于其在较低温度下(5-10)表现出较高的聚合酶活性，有利于引物和模板DNA的退火，但Klenow酶在单引物的延伸反应中，容易引起突变引物置换，特别是当突变引物的5端富含A/T时产生引物置换的可能性更大，所以在用单突变引物的延伸反应中要用T4或T7的DNA 聚合酶。第36页，此课件共136页哦 一、编码基因的专一性位点和区域性定向突变1.编码基因的专一性位点突变第二节蛋白质改造的分子生物学途径(l)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 关于存在于dNTP(脱氧核苷三磷酸)中的dUTP(脱氧尿苷三磷酸)对离体DNA合成反应的影响：dCTP氧化脱氨可以产生微量的dUTP，当其在DNA合成时搀入进新生DNA链的脱氧胸苷酸的位置。在多核苷酸链中搀入UMP时，受体菌中的尿嘧啶-N-糖基化酶可在U的位置切断DNA链，而细胞内的DNA聚合酶可以产生切口平移，从而降低突变体的产率。利用经HPLC纯化的高质量的dNTP，可以减轻U碱基的错误搀入，提高突变体产生的比率。第37页，此课件共136页哦 一、编码基因的专一性位点和区域性定向突变1.编码基因的专一性位点突变第二节蛋白质改造的分子生物学途径(l)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 受体细胞对突变体产率的影响：异源双链DNA被转入大肠杆菌受体细胞后，几个因素可以影响到突变体的产率。(a)大肠杆菌细胞内存在着几个错配修复系统，其中之一是被GATC位点甲基化所指导的错配修复系统。当含有突变的异源双链DNA转染大肠杆菌后dam甲基化酶将指导错配修复反应，使产生的突变被去除。(b)当用M13作为克隆载体时，由于M13 DNA可能出现不对称复制，如果突变链复制的效率较低，则最终影响突变体的产率。为了提高突变体的回收率，利用在点错配修复缺失的菌株作为受体菌可使突变产率提高近10 倍。第38页，此课件共136页哦 一、编码基因的专一性位点和区域性定向突变1.编码基因的专一性位点突变第二节蛋白质改造的分子生物学途径(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法 Kunkel 突变法 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 基于去除特定限制酶切位点的突变 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变 第39页，此课件共136页哦(a)原理 当大肠杆菌发生dUTP酶缺陷突变时(dut-)，不能把dUTP 转变为dUMP，细胞内的dUTP库大为增加，其中一些dUTP可搀入DNA正常情况下由胸腺嘧啶占据的位置。在正常的情况下，大肠杆菌可以合成一种尿嘧啶-N-糖基化酶，它可以去除搀入到DNA中去的尿嘧啶残基。然而在尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷型的菌中(ung-)，此酶失活，故尿嘧啶不能从DNA链中剔除，使细菌DNA中一小部分胸腺嘧啶残基被尿嘧啶所取代。在dut-ing-F菌株中，这一比例有所提高，以致生长于这一菌株的M13噬菌体，其DNA中将含有20-30个尿嘧啶残基。用这些噬菌体转染ung+菌株，尿嘧啶将被迅速除去，并产生一些可阻断DNA合成且对特定核酸酶敏感的位点。病毒(+)链DNA的破坏，导致其感染力下降约5 个数量级。(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法 Kunkel 突变法 第40页，此课件共136页哦Kunkel定点突变法正是利用上述机制，首先在dut-ung-的大肠杆菌菌株中培养适当的重组M13噬菌体，制备出带U的单链DNA模板；然后以含U模板的DNA为模板与突变引物退火、引物延伸，然后将延伸反应混合物转染ung+受体菌，结果模板链因有U位点的存在而被破坏，野生型噬菌体的产生受到抑制。因此，大部分(80%)的后代噬菌体是由所转染的不带U的负链复制而来的。由于该链是由突变引物延伸而来的，因此后代噬菌体多带有突变的目标基因。这样，用Kunkel法所产生的突变体不必利用标记的寡核苷酸探针来筛选阳性噬菌斑，可直接通过序列分析来确定突变体。(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法 Kunkel 突变法 第41页，此课件共136页哦(b)利用Kunkel法以 M13噬 菌 体DNA为载体进行寡核苷酸介导的位点特异性突变。(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法 Kunkel 突变法 第42页，此课件共136页哦以Promega公司Altered Sife in vitro突变体系为例，利用pALTER-1噬菌粒为突变载体，它有如下特点：(a)多克隆位点，用以对目标基因的克隆。(b)含有四环素(Tetr)和氨苄青霉素(Amps)的抗性基因，在 突 变 反 应 中，用 氨 苄 青 霉 素 抗 性 修 复 寡 核 苷 酸 使AmpsAmpr，用于对阳性克隆的筛选。(c)利用辅助噬菌体超感染(Helper phage)，制备含目标基因的单链DNA作为突变模板DNA。突变的过程如图3-2所示。通过这样的操作，突变引物完成了位点特异性突变，而氨苄抗性修复寡核苷酸引物使氨苄抗性得以回复。(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法 基于抗生素抗性“回复”的突变方法第43页，此课件共136页哦利用含四环素和氨苄青霉素培养基对转化体进行筛选，大约85%-90%以上的菌落含有突变的目的基因，这样可以对阳性克隆所含的噬菌粒直接测序而最后确证是否得到突变的目标基因。(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法 基于抗生素抗性“回复”的突变方法第44页，此课件共136页哦此方法的原理是在突变载体DNA上除了有克隆外源基因的克隆位点外，还有一个独特的限制酶切位点，这个位点也不存在于目标基因上。在进行突变反应时用两个引物，一是突变引物，二是使那个独特限制酶位点去除的选择性引物。两个引物通过与模板DNA退火、延伸后，首先用与独特的限制酶位点相对应的酶对反应混合物进行酶解，使野生型的质粒线性化，然后转入如E.coli mutS的受体菌。从转化菌中制备质粒，再用相同限制酶酶解，以使残存的野生型质粒线性化，然后再转化入受体菌。具体操作见图3-3(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法 基于去除特定限制酶切位点的突变第45页，此课件共136页哦由于线性化质粒的转化效率仅为环化质粒转化效率的1%，所以经过两次酶切、转化后所得到的质粒DNA 70-90以上是突变质粒。从两次转化菌中提取质粒DNA，用于测序确定正确突变体。此方法的优点是不需制备单链DNA；不需辅助噬菌体超感染；不需进行亚克隆。(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法 基于去除特定限制酶切位点的突变第46页，此课件共136页哦PCR为基因序列的突变和重组提供了一个非常有用的方法，其优点是快捷、不受限制性内切酶识别位点的限制。(a)利用PCR 方法在基因的5末端区或3末端区产生突变。此方法是利用在PCR反应中，寡核苷酸引物序列被搀入到所产生的DNA分子的末端，这些引物的5端可以含有任何所想要的核苷酸序列，只要引物的3端核苷酸序列能足够好地与模板序列相匹配去引发PCR反应即可。所以可以通过改变引物5端的核苷酸(或碱基)组成，就可使基因的5末端区或3末端区通过PCR产生所要的突变。(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变 第47页，此课件共136页哦然而对于基因的中心区段，不能用简单地改变PCR引物有关序列的方法直接产生各种突变，因为如果这样，需要用非常长的引物才能达到基因中心区。重叠延伸(overlap extension)的方法为在目标基因的中心区段产生突变提供了有力的手段。(b)重叠延伸和基因突变。重叠延伸的概念使得人们可以利用PCR技术在目标基因的中心区段引入位点特异性突变和产生重组DNA分子。当将重叠延伸方法用于将不同的基因进行剪接和组合在一起时，人们就将这一过程称为“gene SOEing”，即通过重叠延伸进行剪接(splicing by overlap extension)(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变 第48页，此课件共136页哦重叠延伸过程的依据是：加到PCR引物5端的核苷酸序列搀入到PCR产物的末端。通过加上适当的序列，一个PCR的扩增片段可与另一个PCR扩增片段上的序列相重叠。这样，在其后的反应中，这段重叠序列可以作为引物被DNA聚合酶所延伸，由此而产生一个新的重组分子，其过程如图3-4 所示。(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变 第49页，此课件共136页哦利用上述原理，可以通过重叠延伸PCR技术对基因的中心区段进行取代、插入、缺失的突变。(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变 取代突变。如图3-5所示，为在基因中部区段产生取代突变，可利用所谓双侧重叠延伸法，需要a,b,c,d四个引物，其中b,c引物序列相重叠并含有突变碱基。首先分别用a,b和c,d为一对引物进行PCR 反应，产生AB和CD扩增片段。然后，将制备出的AB、CD片段混合、变性、退火、通过二者之间的同源序列相重叠产生重叠延伸结构E，再经PCR 进行扩增产生突变基因。第50页，此课件共136页哦插入突变。如图3-6所示，引物b和c的5端含有要插入的序列和重叠序列(插入序列可以等于重叠序列或大于重叠序列)。(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变 分别用a,b和c,d为一对引物进行PCR 反应，产生了包括插入的核苷酸序列在内的两组DNA片段AB和CD，最后通过AB和CD 片段之间的重叠序列进行PCR延伸、扩增，得到具有插入序列的产物AD。第51页，此课件共136页哦缺失突变。利用双侧重叠延伸PCR 同样可以进行缺失突变。图3-7给出了产生缺失突变的过程。对用于重叠延伸进行基因剪接的寡核苷酸片段，其不同部位在反应中执行不同的功能。(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变 寡核苷酸的3端必须含有使它在其模板上作为引物的序列，这通常被称为引导区(priming region)；在寡核昔酸的5端应含有将两个基因片段结合到一起的重叠序列，称为重叠区(overlap region)(如图3-7所示)。在重叠区和引导区之间，可包括用作插入突变的插入区 第52页，此课件共136页哦 一、编码基因的专一性位点和区域性定向突变2.区域性定向突变 基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区域性的突变。常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis)，又称片段取代法(DNA fragment replacement)。这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列。这样，人们不仅可以通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构功能之间的关系，也可以通过盒式突变法产生嵌合蛋白质。在这个嵌合蛋白质中，蛋白质分子中的整个结构域都可以用完全不同的氨基酸序列来置换。第二节蛋白质改造的分子生物学途径第53页，此课件共136页哦 一、编码基因的专一性位点和区域性定向突变2.区域性定向突变 盒式突变最有用武之地是产生各种特异性的突变或突变家族，在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标基因的一个特定区域，从而为研究蛋白质特定结构区段或特定结构域的结构和功能提供了一个切实可行的方法。第二节蛋白质改造的分子生物学途径要进行盒式突变，需要解决两个关键问题。一个是在目标基因序列中，要有适当的限制性内切酶识别位点，使得用以取代天然DNA序列的盒式突变序列可以有效地插入到目标基因中。可以利用遗传密码的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，通过改变某些核苷酸的序列，产生合适的限制性内切酶位点。PCR方法以及寡核苷酸的化学合成方法都可以有效地解决这一问题。第54页，此课件共136页哦 一、编码基因的专一性位点和区域性定向突变2.区域性定向突变 另一个是，如何得到各种合适的、用以取代目标基因中特定DNA片段的突变DNA片段。利用PCR技术产生具有特定限制性内切酶位点的、具有各种突变位点的盒式突变DNA片段的技术已经成熟。此外，利用DNA的化学合成、引物介导的DNA合成技术等都可以得到用于盒式突变的DNA片段。值得指出的是，为确保盒式突变序列能按正确的方向插入，突变序列的两端必须分别具有与目标基因上相匹配的、但彼此之间不相容的限制性内切酶识别位点。实际上对于目标基因进行区域性的定向突变，除了上述的盒式突变技术外，也完全可以通过PCR方法对给定基因序列进行融合和剪接，这样基因内、基因间或人工修饰基因片段之间的重组、改造就不受特定限制性内切酶识别位点的存在与否的限制。第二节蛋白质改造的分子生物学途径第55页，此课件共136页哦 二、基因融合和基因剪接 1.利用基因融合技术表达外源基因的缘由 重组DNA 技术允许在体外产生不同基因或基因片段之间的融合，并通过融合基因产生融合蛋白。用基因融合表达外源蛋白有以下缘由 外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解，有时可以通过产生融合蛋白避免目标基因产物被快速降解，从而稳定表达产物的产率。特别是表 达 一 些 小 肽 基 因 时，这 是 一 个 好 的 策 略。通过与一特异性蛋白质或其特异的结构域形成融合蛋白，可使表达产物得到快速、有效的回收、纯化。如将外源蛋白基因同金葡蛋