分子生物学原核基因转录水平的调控讲稿.ppt

分子生物学原核基因转录水平的调控第一页，讲稿共八十一页哦组成型表达和调节型表达 在在细细胞胞中中，有有些些基基因因产产物物的的量量是是比比较较恒恒定定的的，它它们们是是细细胞胞维维持持代代谢谢必必需需的的物物质质，如如糖糖酵酵解解途途径径中中的的酶酶及及组组成成核核糖糖体体的的蛋蛋白白质质，这这类类基基因因的的表表达达称称为为组组成成型型表表达达（constitutive expression）；有有些些基基因因产产物物的的量量在在不不同同的的情情况况下下变变化化很很大大，需需要要这这类类产产物物时时基基因因表表达达，不不需需要要时时基基因因关关闭闭，这这类类基基因因的的表表达达称称为为调调节型表达（节型表达（regulated expression）。）。第二页，讲稿共八十一页哦真核与原核细胞转录与翻译调控特点的比较第三页，讲稿共八十一页哦转录水平上的调节方式 代谢产物对基因表达的调节代谢产物对基因表达的调节 衰减子对基因表达的调节衰减子对基因表达的调节 降解物对基因表达的调节降解物对基因表达的调节 细菌的应急反应细菌的应急反应 第四页，讲稿共八十一页哦1.1.代谢产物对基因表达的调节 在在降降解解代代谢谢途途径径中中，起起始始端端的的酶酶的的底底物物浓浓度度往往往往决决定定是是否否合合成成这这一一途途径径中中后后续续的的各各种种酶酶（诱诱导导）；而而在在合合成成代代谢谢中中，最最终终产产物物往往往往是是调调节节物物质质（阻阻遏遏）。这这些些调调节节物物质质必必须须与与反反式式作用因子结合才能起到调节基因表达的作用。作用因子结合才能起到调节基因表达的作用。第五页，讲稿共八十一页哦2.2.衰减子对基因表达的调节 在在这这种种调调节节方方式式中中，起起信信号号作作用用的的是是特特定定氨氨酰酰tRNA的的浓浓度度，如如对对色色氨氨酸酸操操纵纵子子来来说说，高高浓浓度度的的色色氨氨酰酰tRNA抑抑制制色色氨氨酸酸操操纵纵子子的的表表达达。具具有有这这种种调调节节方方式式的的有有大大肠肠杆杆菌菌中中的的色色氨氨酸酸操操纵纵子子、苯苯丙丙氨氨酸酸操操纵纵子子、苏苏氨氨酸酸操操纵纵子子、异异亮亮氨氨酸酸操操纵纵子子和和缬缬氨氨酸酸操操纵纵子子，以以及及沙沙门门氏氏菌菌的的组组氨氨酸酸操操纵纵子子和和亮亮氨氨酸酸操操纵纵子子、嘧啶合成操纵子等。嘧啶合成操纵子等。第六页，讲稿共八十一页哦3.3.降解物对基因表达的调节 在在有有葡葡萄萄糖糖存存在在的的情情况况下下，即即使使在在细细菌菌培培养养基基中中加加入入乳乳糖糖、半半乳乳糖糖、阿阿拉拉伯伯糖糖或或麦麦芽芽糖糖等等诱诱导导物物，与与其其对对应应的的操操纵纵子子也也不不会会启启动动，这这种种现现象象称称为为葡葡萄萄糖糖效效应应或或称称为为降降解解物物抑抑制制作作用用。这这时时，细细菌菌所所需需的的能能量量可可以以从从葡葡萄萄糖糖得得到到满满足足，而而无无须须启动一些不常用的基因去利用这些稀有的糖类。启动一些不常用的基因去利用这些稀有的糖类。第七页，讲稿共八十一页哦降解物对基因表达的调节 其其机机制制是是葡葡萄萄糖糖的的存存在在会会抑抑制制细细菌菌的的腺腺苷苷酸酸环环化化酶酶，减减少少cAMP的的合合成成，cAMP受受体体蛋蛋白白因因不不能能与与cAMP结结合合而而不不能能形形成成复复合合物物。这这种种复复合合物物是是一一个个正正调调节节物物质质，它它可可与与操操纵纵子子上上的的启启动动子子区区结结合合，促促进进基基因因转转录录的的启启动动。若若培培养养基基中中缺缺乏乏葡葡萄萄糖糖，而而有有其其它它种种类类的的糖糖，相应的操纵子就会启动。相应的操纵子就会启动。第八页，讲稿共八十一页哦4.4.细菌的应急反应 上上述述3个个方方面面是是细细菌菌处处于于正正常常生生活活条条件件下下的的基基因因表表达达调调节节方方式式，这这种种正正常常也也包包括括生生活活环环境境中中缺缺少少某某一一种种或或两两种种物物质质，但但能能找找到到代代用用物物。可可是是，细细菌菌有有时时会会遇遇到到十十分分恶恶劣劣的的环环境境，比比如如氨氨基基酸酸饥饥饿饿时时，就就不不是是缺缺少少一一两两种种氨氨基基酸酸，而而是是氨氨基基酸酸全全面面匮匮乏乏。为为了了紧紧缩缩开开支支，渡渡过过难难关关，细细菌菌会会产产生生应应急急反反应应，包包括括合合成成各各种种RNA、糖糖、脂脂肪肪和和蛋蛋白白质质在内的几乎全部生化反应过程均被停止。在内的几乎全部生化反应过程均被停止。第九页，讲稿共八十一页哦细菌的应急反应 当当氨氨基基酸酸饥饥饿饿时时，细细胞胞中中便便存存在在大大量量的的不不带带氨氨基基酸酸的的tRNA，这这种种空空载载tRNA会会激激活活焦焦磷磷酸酸转转移移酶酶，使使ppGpp大大量量合合成成，其其浓浓度度可可增增加加10倍倍以以上上，ppGpp的的出出现现会会关关闭闭许许多多基基因因，当当然然也也会会打打开开一一些些合合成成氨氨基基酸酸的的基基因因。ppGpp的的作作用用原原理理还还不不清清楚楚，它它不不只只影影响响一一个个或或几几个个操操纵纵子子，而而是是影影响响一一大大批批操操纵子，所以纵子，所以它是超级调控因子。它是超级调控因子。第十页，讲稿共八十一页哦原核基因启动子的一般结构 原原核核生生物物基基因因的的启启动动子子有有两两个个保保守守的的区区域域，一一个个位位于于10处处，称称为为Pribnow box，另另一一个个位位于于35处处，称称为为Sextama box。它们的保守性为。它们的保守性为Sextama box Pribnow box T82T84G78A65C54A45 T80A95T45A60A50T96 通通过过缺缺失失分分析析发发现现，强强启启动动子子Pribnow box和和Sextama box之之间间的的间间隔隔为为171bp，增增大大或或减减小小这这个个间间距距能能明显影响启动子的强度。明显影响启动子的强度。第十一页，讲稿共八十一页哦几种原核基因的启动子第十二页，讲稿共八十一页哦原核生物的RNA聚合酶 原原核核细细胞胞中中只只有有一一种种RNA聚聚合合酶酶，它它催催化化所所有有种种类类RNA的的合合成成。真真核核细细胞胞中中有有三三种种RNA聚聚合合酶酶，分分别别称称为为RNA聚聚合合酶酶、，它它们们催催化合成的化合成的RNA种类不同。种类不同。第十三页，讲稿共八十一页哦大肠杆菌RNA聚合酶 大大肠肠杆杆菌菌RNA聚聚合合酶酶通通常常认认为为由由5个个亚亚基基组组成成，即即2、及及，这这5个个亚亚基基组组成成的的酶酶叫叫全全酶酶，而而只只由由2、4个个亚亚基基组组成成的的酶酶叫叫做做核核心心酶酶。此此外外，还还可可以以看看到到一一个个相相对对分分子子量量在在10000左左右右的的亚亚基基，其其功功能能尚尚不不清清楚楚；后后来来又又发发现现一一个个分分子子量量为为69000的的酸酸性性蛋蛋白白，称称为为NusA蛋蛋白白，现现在在又又称称为为转转录录延延伸伸因因子子，其功能可能与其功能可能与RNA转录的延伸和终止有关。转录的延伸和终止有关。第十四页，讲稿共八十一页哦大肠杆菌RNA聚合酶各亚基的功能 亚亚基基的的主主要要功功能能是是识识别别启启动动子子；亚亚基基的的主主要要功功能能是是参参与与和和启启动动子子的的结结合合、DNA双双链链的的解解链链和和恢恢复复双双螺螺旋旋；亚亚基基可可能能参参与与底底物物的的结结合合及及RNA合合成成时时磷磷酸酸二二酯酯键键的的形形成成；亚亚基基的的碱碱性性最最强，可能起到与强，可能起到与DNA模板结合的作用。模板结合的作用。第十五页，讲稿共八十一页哦RNA的转录过程 原原核核RNA聚聚合合酶酶通通过过亚亚基基发发现现启启动动子子35区区识识别别位位点点后后，首首先先与与35区区序序列列结结合合成成一一个个封封闭闭的的启启动动子子复复合合体体，几几乎乎与与此此同同时时，全全酶酶向向10序序列列转转移移并并与与之之紧紧密密结结合合，使使10区区及及转转录录起起始始区区发发生局部解链而形成开放型复合体。生局部解链而形成开放型复合体。转录起始转录起始第十六页，讲稿共八十一页哦RNA的转录过程 在在开开放放型型复复合合体体中中，RNA聚聚合合酶酶上上的的起起始始位位点点和和延延伸伸位位点点分分别别被被两两个个相相应应的的核核苷苷三三磷磷酸酸按按碱碱基基配配对对原原则则占占据据（起起始始位位点点只只允允许许嘌嘌呤呤核核苷苷三三磷磷酸酸进进入入），在在亚亚基基催催化化下下形形成成第第一一个个磷磷酸酸二二酯酯键键，这这样样就就形形成成了了一一个个RNA聚聚合合酶酶DNA新新生生RNA的的三三元元复复合合体体。三三元元复复合合体体一一旦旦形形成成，亚亚基基就就从从全全酶酶上上解解离离下下来来，此此时时转录起始完成，进入延伸阶段。转录起始完成，进入延伸阶段。转录起始转录起始第十七页，讲稿共八十一页哦转录起始过程第十八页，讲稿共八十一页哦RNA的转录过程RNA合成的速度大约每秒合成的速度大约每秒3050个核苷酸。个核苷酸。转录延伸转录延伸第十九页，讲稿共八十一页哦RNA的转录过程 原原核核基基因因转转录录的的终终止止机机制制比比较较清清楚楚。以以大大肠肠杆杆菌菌为为例例，转转录录的的终终止止需需要要一一个个信信号号，这这个个信信号号就就是是一一个个叫叫做做转转录录终终止止区区或或终终止止子子（terminator）的的DNA序序列列。终终止子序列存在于已被止子序列存在于已被RNA聚合酶转录过的序列中。聚合酶转录过的序列中。转录终止转录终止第二十页，讲稿共八十一页哦终止子的类型 已已知知有有两两类类终终止止子子：一一类类是是不不依依赖赖蛋蛋白白辅辅助助因因子子而而能能实实现现转转录录终终止止的的终终止止子子，叫叫做做-非非依依赖赖性性终终止止子子；另另一一类类是是依依赖赖蛋蛋白白辅辅助助因因子子才才能能实实现转录终止的终止子，叫做现转录终止的终止子，叫做-依赖性终止子。依赖性终止子。第二十一页，讲稿共八十一页哦-非依赖性终止子第二十二页，讲稿共八十一页哦-非依赖性终止机制 -非非依依赖赖性性终终止止子子不不是是在在DNA水水平平上上终终止止转转录录的的，而而是是在在已已转转录录产产生生的的RNA水水平平上上发发生生作作用用的的。终终止止子子序序列列从从DNA模模板板上上转转录录后后，在在新新生生RNA链链中中产产生生发发卡卡结结构构，在在发发卡卡结结构构后后面面跟跟着着大大约约由由6个个U组组成成的的序序列列。这这两两种种结结构构都都为为转转录录终终止止所所必必需需。如如果果在在发发卡卡区区产产生生突突变变，破破坏坏其其发发卡卡结结构构，会会妨妨碍碍转转录录终终止止。RNA聚聚合合酶酶在在发发卡卡处处通通过过相相互互作作用用使使RNA转转录录停停滞滞，而而一一连连串串的的U提提供供了了使使RNA聚聚合合酶酶从从模模板板上上解解离离下下来来的的信信号号而而使使转录终止。转录终止。第二十三页，讲稿共八十一页哦-依赖性终止子 在在-依依赖赖性性终终止止子子中中，转转录录终终止止点点前前也也有有发发卡卡结结构构，但但发发卡卡结结构构中中GC对对含含量量较较少少，发发卡卡结结构构的的下下游游序序列列没没有有固固定定的的特特征征，其其AT对对含含量量比比-非非依依赖赖性性转转录录终终止止子子低低。-因因子子利利用用其其NTP酶酶活活性性产产生生的的能能量量，结结合合到到RNA链链上上，然然后后沿沿着着RNA链链滑滑向向RNA聚聚合合酶酶，当当RNA聚聚合合酶酶在在发发卡卡结结构构处处停停滞滞时时，-因子与因子与RNA聚合酶相互作用而终止转录。聚合酶相互作用而终止转录。第二十四页，讲稿共八十一页哦依赖性终止机制RNA聚合酶正在转录聚合酶正在转录因子附着到因子附着到RNA的识的识别位点上别位点上因子沿因子沿RNA移动，移动，追赶追赶RNA聚合酶聚合酶在终止子处，在终止子处，因子与因子与RNA聚合酶相互作用聚合酶相互作用在转录泡处，在转录泡处，因子使因子使DNA-RNA杂交双链解旋杂交双链解旋转录终止转录终止第二十五页，讲稿共八十一页哦终止子的终止效率 -非非依依赖赖性性转转录录终终止止在在有有-因因子子参参与与时时，终终止止效效率率提提高；终止子序列发卡结构中高；终止子序列发卡结构中GC含量高时，终止效率高。含量高时，终止效率高。The sequences required for rho-dependent termination(sometimes called rut sites)are 50-90 bases long and lie upstream of the actual termination site.Their common feature is that the RNA is rich in C residues and poor in G residues.C is by far the most common base(41%)and G is the least common base(14%).As a general rule the efficiency of a rut site increases with the length of the C-rich/G-poor region.第二十六页，讲稿共八十一页哦Rut 位点的序列特征A rut site has a sequence rich in C and poor in G preceding the actual site(s)of termination.The sequence correspodns to the 3 end of the RNA.第二十七页，讲稿共八十一页哦乳糖操纵子 乳乳糖糖操操纵纵子子控控制制3个个酶酶的的表表达达。即即lac Z、lac Y、lac A，它它们们分分别别编编码码半半乳乳糖糖苷苷酶酶、半半乳乳糖糖苷苷透透过过酶酶和和半半乳乳糖糖苷苷乙乙酰酰基基转转移移酶酶。由由于于多多顺顺反反子子mRNA中中各各基基因因翻翻译译效效率率的的不不同同，-半半乳乳糖糖苷苷酶酶：半半乳乳糖糖苷苷透透过过酶酶：半半乳乳糖糖苷乙酰基转移酶合成的比例为苷乙酰基转移酶合成的比例为1：0.5：0.2。大大肠肠杆杆菌菌如如果果以以乳乳糖糖为为唯唯一一碳碳源源和和能能源源的的话话，前前两两种种酶酶是是必需的。必需的。lac operon第二十八页，讲稿共八十一页哦lac A 的可能作用No defect is identifiable in lacA-cells,which is puzzling.It is possible that the acetylation reaction gives an advantage when the bacteria grow in the presence of certain analogs of b-galactosides that cannot be metabolized,because the modification results in detoxification and excretion.第二十九页，讲稿共八十一页哦乳糖操纵子的表达调控 在在不不含含乳乳糖糖及及半半乳乳糖糖苷苷的的培培养养基基中中，lac+基基因因型型大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞内内半半乳乳糖糖苷苷酶酶和和透透过过酶酶的的浓浓度度很很低低，每每个个细细胞胞内内大大约约只只有有12个个酶酶分分子子，这这称称为为本本底底表表达达。但但是是，如如果果在在无无葡葡萄萄糖糖的的培培养养基基中中加加入入乳乳糖糖，酶酶的的浓浓度度很很快快达达到到细细胞胞总总蛋蛋白白量量的的67%，每每个个细细胞胞中中可可有有超超过过105个酶分子。个酶分子。第三十页，讲稿共八十一页哦乳糖操纵子的表达调控半衰期长半衰期长半衰期长半衰期长第三十一页，讲稿共八十一页哦乳糖操纵子的人工诱导物和底物 实实际际研研究究中中，很很少少使使用用乳乳糖糖作作为为诱诱导导剂剂，因因为为培培养养基基中中的的乳乳糖糖会会被被诱诱导导产产生生的的半半乳乳糖糖苷苷酶酶降降解解，使使乳乳糖糖的的浓浓度度不不断断下下降降。实实验验室室里里常常常常使使用用两两种种含含硫硫的的乳乳糖糖类类似似物物异异丙丙基基硫硫代代半半乳乳糖糖苷苷（IPTG）或或甲甲基基硫硫代代半半乳乳糖糖苷苷（TMG）作作为为诱诱导导剂剂。在在酶酶活活性性分分析析中中常常用用O硝基苯半乳糖苷（硝基苯半乳糖苷（ONPG）作为生色底物。）作为生色底物。第三十二页，讲稿共八十一页哦乳糖操纵子的人工诱导物和活性测定底物 诱导物诱导物 诱导物诱导物 生色底物生色底物O-硝基苯半乳糖苷硝基苯半乳糖苷(ONPG)第三十三页，讲稿共八十一页哦乳糖操纵子的发现 1940年年，Jacques Monod 等等开开始始研研究究大大肠肠杆杆菌菌中中乳乳糖糖代代谢谢的的可可诱诱导导性性。他他们们发发现现乳乳糖糖或或其其他他半半乳乳糖糖苷苷能能够够诱诱导导半半乳乳糖糖苷苷酶酶（galactosidase）的的表表达达。可可是是，有有些些突突变变体体能能够够被被诱诱导导出出半半乳乳糖糖苷苷酶酶，但但仍仍不不能能在在仅仅含含乳乳糖糖的的培培养养基基中中生生长长。他他们们将将放放射射性性标标记记的的半半乳乳糖糖苷苷加加到到野野生生型型和和突突变变型型的的大大肠肠杆杆菌菌中中，并并分分别别进进行行诱诱导导和和非非诱诱导导，发发现现在在诱诱导导条条件件下下，野野生生型型可可以以吸吸收收半半乳乳糖糖苷苷，而而突突变变型型（Y）不能吸收半乳糖苷。）不能吸收半乳糖苷。第三十四页，讲稿共八十一页哦Effect of Cryptic Mutant（lzcY）on Accumulation of GalactosideGenotypeInducerAccumulation of GalactosideZ+Y+Z+Y+Z+YZ+Y第三十五页，讲稿共八十一页哦对突变体的生物化学研究 Monod认认为为有有一一种种物物质质负负责责将将半半乳乳糖糖苷苷运运入入细细胞胞，Y突突变变型型产产生生这这种种物物质质的的基基因因有有缺缺陷陷。他他将将这这种种物物质质命命名名为为半半乳乳糖糖苷苷透透过过酶酶（galactoside permease）。在在纯纯化化半半乳乳糖糖苷苷透透过过酶酶时时，Monod等等又又发发现现了了半半乳乳糖糖苷苷转转乙乙酰酰基基酶酶（galactoside transacetylase）到到上上世世纪纪50年年代代末末期期，Monod 发发现现这这三三种种酶酶被被半半乳乳糖糖苷苷同同时时诱诱导导出出来来，因因此此至至少少有有三三个个基基因因被被同同时时诱诱导导表表达。达。他他还还发发现现了了一一些些突突变变体体，这这些些突突变变体体不不需需要要诱诱导导就就能能持持续续表表达达这这三三种种酶酶。这这些些突突变变体体称称为为组组成成型型突突变变体（体（constitutive mutants）。）。第三十六页，讲稿共八十一页哦对突变体的遗传学研究 Monod认认识识到到，遗遗传传学学分分析析可可以以大大大大促促进进研研究究的的进进展展，于于是是他他请请同同在在巴巴斯斯德德研研究究所所的的Francois Jacob参参加加到到他他的的团团队中。队中。在在Arthur Pardee的的协协助助下下，Jacob和和Monod制制作作了了大大肠肠杆杆菌菌部部分分二二倍倍体体（merodiploids），这这些些部部分分二二倍倍体体携携带带了了野野生生型型基基因因（可可诱诱导导的的）和和组组成成型型突突变变体体的的等等位位基基因因。实实验验表表明明野野生生型型基基因因是是显显性性的的(即即组组成成型型突突变变基基因因也也不不表表达达)，说说明明野野生生型型细细胞胞可可以以产产生生一一种种物物质质，它它使使得得基基因因关关闭闭，除除非非被被诱诱导导。这这种种物物质质被被称称为为阻阻遏遏蛋蛋白白（repressor），组组成成型型突突变变体体不不能能产产生生这这种种阻阻遏遏蛋蛋白白，野野生生型型基基因因产产生生的的阻阻遏遏蛋蛋白白可可以以抑抑制制组组成成型型突突变变基基因因的的表表达达。这这些些组组成成型型突突变变体体记记为为lacI。第三十七页，讲稿共八十一页哦Mutant repressor gene（I）No lac products in absence of lactoseNo lac products in absence of lactoseBoth lac operons repressible；mutation is recessive.（In merodiploid cells）第三十八页，讲稿共八十一页哦对突变体的遗传学研究 阻阻遏遏蛋蛋白白要要发发挥挥作作用用，应应该该结结合合到到DNA的的特特殊殊序序列列上上，Jacob和和Monod将将这这种种特特殊殊序序列列称称为为操操纵纵区区（operator）。可可以以想想象象，即即使使有有阻阻遏遏蛋蛋白白，操操纵纵区区突突变变，阻阻遏遏蛋蛋白白无无法法与与操纵区结合，也会使得三种酶组成型表达。操纵区结合，也会使得三种酶组成型表达。区区分分这这两两种种突突变变的的方方法法是是：在在部部分分二二倍倍体体细细胞胞中中，如如果果是是阻阻遏遏蛋蛋白白基基因因突突变变（I），不不产产生生阻阻遏遏蛋蛋白白，表表型型是是隐隐性性的的（recessive）；如如果果是是操操纵纵区区突突变变（Oc），突突变变基基因因成成为为组组成成型型表表达达，表表型型是是显显性性的的，这这种种显显性性称称为为顺顺式式显显性性（cis-dominant），而野生型基因仍须诱导才能表达。），而野生型基因仍须诱导才能表达。第三十九页，讲稿共八十一页哦Mutant operator（O c）No lac products in absence of lactoselac products in absence of lactoseOne lac operon nonrepressible；mutation is cis-dominant.（In merodiploid cells）第四十页，讲稿共八十一页哦对突变体的遗传学研究 有有一一种种阻阻遏遏蛋蛋白白突突变变，突突变变的的阻阻遏遏蛋蛋白白不不能能与与诱诱导导物物结结合合，因因此此结结构构基基因因经经诱诱导导也也不不能能表表达达。这这种种突突变变称称为为I s，这种突变是顺反都显性的，这种突变是顺反都显性的。No lac products in presence or absence of lactoseNo lac products in presence or absence of lactose Both lac operons uninducible；mutation is cis-and trans-dominant.第四十一页，讲稿共八十一页哦对突变体的遗传学研究 还还有有一一种种阻阻遏遏蛋蛋白白突突变变，突突变变的的阻阻遏遏蛋蛋白白不不能能与与操操纵纵区区结结合合，结结构构基基因因组组成成型型表表达达，这这种种突突变变称称为为I Id d，这这种种突变叫显性阴性（突变叫显性阴性（dominant negative）。）。lac products in absence of lactoselac products in absence of lactose Both operons nonrepressible；mutation is dominant negative.第四十二页，讲稿共八十一页哦乳糖操纵子概念的提出 通通过过熟熟练练的的遗遗传传学学分分析析，Jacob和和Monod提提出出了了操操纵纵子子的的概概念念。他他们们预预言言有有两两个个关关键键的的控控制制元元件件存存在在：阻阻遏遏蛋蛋白白基基因因和和操操纵纵区区。缺缺失失突突变变揭揭示示了了第第三三个个元元件件启启动动子子，它它对对三三个个结结构构基基因因的的表表达达是是必必需需的的。他他们们得得出出结结论论，三三个个结结构构基基因因是是成成簇簇排排列列，并并处处于于一一个个控控制制单单位位的的控控制制之之下下，即即乳乳糖糖操操纵纵子子。随随后后的的生生化化研研究究证实了他们完美的假说。证实了他们完美的假说。第四十三页，讲稿共八十一页哦lac repressor的纯化 20世世纪纪60年年代代，Gilbert和和Muller-Hill成成功功地地部部分分纯纯化化了了lac阻阻遏遏蛋蛋白白。开开始始时时采采用用标标记记的的IPTG与与阻阻遏遏蛋蛋白白结结合合的的方方法法来来检检测测阻阻遏遏蛋蛋白白，但但因因Lac阻阻遏遏蛋蛋白白含含量量非非常常低低，无无法法检检测测到到。后后来来从从一一个个突突变变体体lacI t中中纯纯化化出出了了阻阻遏遏蛋蛋白白，这这种种阻阻遏遏蛋蛋白白与与IPTG结结合合非非常常紧紧密密，这这样就能从粗提物中检测到阻遏蛋白。样就能从粗提物中检测到阻遏蛋白。第四十四页，讲稿共八十一页哦lac repressor与operator的结合 Cohn和和他他的的同同事事用用纯纯化化的的阻阻遏遏蛋蛋白白进进行行与与operator的的结结合合实实验验。他他们们将将含含有有lac operator的的标标记记DNA片片段段加加到到固固定定有有不不同同量量的的repressor的的硝硝酸酸纤纤维维素素滤滤膜膜上上，然然后后测测定定滤滤膜膜上上结结合合的的DNA的的量量，并并在在加加和和不不加加IPTG两两种种情情况下实验，得到如下结果：况下实验，得到如下结果：第四十五页，讲稿共八十一页哦 Assaying the binding between lac operator and lac repressor不加不加IPTG加加IPTG第四十六页，讲稿共八十一页哦The Oc lac operator binds repressor with lower affinity than does the wild-type operator含正常含正常 operator 的的DNA片段片段含含Oc 突变突变 operator 的的DNA片段片段80 DNA片段（对照）片段（对照）第四十七页，讲稿共八十一页哦Pastan等的实验 早早在在1971年年，Pastan及及其其同同事事就就通通过过实实验验证证明明：即即使使repressor存存在在，RNA聚聚合合酶酶也也能能够够紧紧密密地地结结合合到到promoter上上。他他们们的的实实验验是是：在在repressor存存在在下下，将将含含有有operator的的DNA片片段段与与RNA聚聚合合酶酶保保温温，然然后后同同时时加加入入诱诱导导剂剂IPTG和和利利福福平平。利利福福平平能能够够抑抑制制转转录录，除除非非已已经经形形成成了了开开放放的的启启动动子子复复合合物物。结结果果转转录录发发生生了了，说说明明repressor没没有有阻阻止止开开放放启启动动子子复复合合物物的的形形成成。即即使使有有了了这这个个实实验验结结果果，人人们们还还是是认认为为repressor与与operator的的结结合合阻阻碍碍了了RNA聚聚合合酶酶与与启启动子结合，从而抑制转录。动子结合，从而抑制转录。第四十八页，讲稿共八十一页哦转录起始开放复合物的形成第四十九页，讲稿共八十一页哦Straney和Crothers的实验 1987年年，Straney和和Crothers用用实实验验强强化化了了这这个个观观点点：RNA聚聚合合酶酶和和阻阻遏遏蛋蛋白白可可以以同同时时结结合合到到lac启启动动子子上上。他他们们提提出出，尽尽管管阻阻遏遏蛋蛋白白不不影影响响RNA聚聚合合酶酶与与启启动子的结合，但阻止开放复合物的形成。动子的结合，但阻止开放复合物的形成。这个观点与这个观点与Pastan等人的实验结果不符。等人的实验结果不符。第五十页，讲稿共八十一页哦Krummel和Chamberlin的观点 Krummel 和和Chamberlin提提出出另另外外一一种种解解释释：阻阻遏遏蛋蛋白白阻阻止止从从起起始始转转录录复复合合物物状状态态转转变变成成延延伸伸状状态态。换换句句话话说说，阻阻遏遏蛋蛋白白可可以以合合成成短短的的RNA，但但不不能能继继续续合合成成RNA。第五十一页，讲稿共八十一页哦Lee和Goldfarb的实验 Lee和和Goldfarb提提出出了了实实验验证证据据支支持持了了Krummel和和Chamberlin的的观观点点。他他们们用用run-off转转录录分分析析法法证证明明，即即使使在在阻阻遏遏蛋蛋白白存存在在下下，RNA聚聚合合酶酶也也已已经经与与DNA模模板板发发生了相互作用。实验方法如下：生了相互作用。实验方法如下：将将阻阻遏遏蛋蛋白白与与含含有有lac控控制制区区域域及及lacZ N端端部部分分序序列列的的123bp的的DNA片片段段保保温温10分分钟钟，使使阻阻遏遏蛋蛋白白与与operator结结合合，然然后后加加入入RNA聚聚合合酶酶，再再加加入入肝肝素素及及RNA聚聚合合酶酶反反应应所所需需的的其其他他全全部部成成分分（除除CTP外外）。肝肝素素结结合合到到游游离离的的或或与与DNA松松散散结结合合的的RNA聚聚合合酶酶上上，阻阻止止这这些些RNA聚聚合合酶酶与与DNA紧紧密密结结合合，但但并并不不影影响响已已经经与与DNA紧紧密密结结合合的的RNA聚合酶。最后加入标记的聚合酶。最后加入标记的CTP，同时，同时加加和和不加不加IPTG。第五十二页，讲稿共八十一页哦Lee和Goldfarb的实验结果-run offrun offlacR +IPTG +Run-off：合成一小段合成一小段结构基因的结构基因的RNA 结结果果表表明明，阻阻遏遏蛋蛋白白不不能能阻阻止止RNA聚聚合合酶酶与与启启动动子子形形成成开开放放复复合合物物。Lee和和Goldfarb还还注注意意到到，在在阻阻遏遏蛋蛋白白存存在在时时，有有一一个个仅仅6个个核核苷苷酸酸长长的的不不全全转转录录物物（abortive transcripts）产产生生。这这说说明明阻阻遏遏蛋蛋白白实实际际上上是是抑抑制制了了从从产产生生不不全全转转录录物物的的无无效效转转录录到到连连续转录续转录这个转变过程。这个转变过程。第五十三页，讲稿共八十一页哦The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1965for their discoveries concerning genetic control of enzyme and virus synthesisFranois JacobAndr LwoffJacques MonodInstitut Pasteur,Paris,France第五十四页，讲稿共八十一页哦乳糖操纵子的阻遏调控 lacI的的 表表 达达 产产 物物 是是 四四 聚聚 体体 的的 阻阻 遏遏 蛋蛋 白白（repressor），它它结结合合到到乳乳糖糖操操纵纵子子的的操操纵纵区区（operator），使使 转转 录录 不不 能能 进进 行行。当当 有有 诱诱 导导 物物（inducer）存存在在时时，诱诱导导物物与与阻阻遏遏蛋蛋白白结结合合，结结合合的复合物不能与操纵区结合，转录得以进行。的复合物不能与操纵区结合，转录得以进行。第五十五页，讲稿共八十一页哦乳糖操纵子的阻遏调控 实实际际上上，以以乳乳糖糖为为诱诱导导物物时时，并并不不是是乳乳糖糖和和阻阻遏遏蛋蛋白白结结合合，而而是是由由乳乳糖糖（半半乳乳糖糖1,4葡葡萄萄糖糖）的的异异构构体体异异构构乳乳糖糖（半半乳乳糖糖 1,6葡葡萄萄糖糖）与与阻阻遏遏蛋蛋白白结结合合。由由乳乳糖糖转转变变成成异异构构乳乳糖糖是是由由半半乳乳糖糖苷苷酶酶催催化化的的。在在半半乳乳糖糖苷苷酶酶催催化化下下，多多数数乳乳糖糖降降解解成成葡葡萄萄糖糖和和半半乳乳糖糖，也也生生成成一一些些异异构构乳乳糖糖，使使得得操操纵纵子子处处于于开开放状态。放状态。第五十六页，讲稿共八十一页哦乳糖操纵子的阻遏调控第五十七页，讲稿共八十一页哦Operator 的结构-5 +21第五十八页，讲稿共八十一页哦乳糖操纵子的三个OperatorMajor operatorAuxiliary operatorAuxiliary operator第五十九页，讲稿共八十一页哦乳糖操纵子的三个Operator缺失对基因表达的影响右边的数字是加右边的数字是加inducer与不加与不加inducer时时半半乳糖苷酶活性之乳糖苷酶活性之比比第六十页，讲稿共八十一页哦阻遏蛋白四聚体结合到两个operator上使DNA成环DNA弯曲成环提高了阻遏的效率弯曲成环提高了阻遏的效率第六十一页，讲稿共八十一页哦乳糖操纵子表达中的葡萄糖效应 当当培培养养基基中中有有葡葡萄萄糖糖存存在在时时，细细胞胞吸吸收收葡葡萄萄糖糖，葡葡萄萄糖糖与与半半乳乳糖糖苷苷透透过过酶酶结结合合，阻阻止止乳乳糖糖吸吸收收。这这叫叫诱导物排斥（诱导物排斥（inducer exclusion）。）。第六十二页，讲稿共八十一页哦Inducer ExclusionThe key molecular component in inducer exclusion is the PTS(phosphoenolpyruvate:glucose phosphotransfer-ase system),a complex of proteins in the bacterial membrane,which simultaneously phosphorylates and transports sugars into the cell.One of the proteins of this complex(II AGlc,which is code d by the crr gene)becomes dephosphorylated as a result of glucose transport.It then binds to the Lac permease and prevents it from importing lactose into the cell.第六十三页，讲稿共八十一页哦葡萄糖抑制乳糖输入第六十四页，讲稿共八十一页哦乳糖操纵子表达中的葡萄糖效应 除除了了抑抑制制乳乳糖糖吸吸收收外外，葡葡萄萄糖糖还还通通过过另另一一种种机机制制阻阻止止乳乳糖糖操操纵纵子子表表达达。PTS中中的的II AGlc在在磷磷酸酸化化状状态态时时刺刺激激腺腺苷苷酸酸环环化化酶酶的的活活性性，使使ATP转转变变成成cAMP，当当介介质质中中有有葡葡萄萄糖糖时时，II AGlc在在输输入入葡葡萄萄糖糖的的过过程程中中，本本身身被被脱脱磷磷酸酸化化，脱脱磷磷酸酸化化的的II AGlc降降低低腺腺苷苷酸酸环环化化酶酶的的活活性性，使使cAMP减减少少。而而cAMP也也是是乳乳糖糖操操纵纵子子表表达达的的必必需需因因子子。这这是是乳乳糖糖操纵子表达的另一种调控机制。操纵子表达的另一种调控机制。第六十五页，讲稿共八十一页哦乳糖操纵子表达中的葡萄糖效应 cAMP可可与与其其受受体体蛋蛋白白CAP（catabolite activator protein，也也叫叫cyclic AMP receptor protein，CRP）结结合合，形形成成复复合合物物，结结合合到到乳乳糖糖操操纵纵子子的的启启动动子子区区域域，从从而而使使得得RNA聚聚合合酶酶能能够够与与启启动动子子结结合合，转转录录得得以以进进行行。没没有有cAMPCAP复复合合物物与与启启动动子子的的结结合合，RNA聚聚合合酶酶不不能能结结合到启动子上。合到启动子上。很很多多操操纵纵子子的的转转录录需需要要cAMPCAP复复合合物物的的参参与与，尤其是那些尤其是那些10和和35序列保守性不强的启动子。序列保守性不强的启动子。第六十六页，讲稿