微生物的实验室培养 (3).ppt

关于微生物的实验室培养(3)现在学习的是第1页，共37页微生物的类群微生物的类群原生生物原生生物原核生物原核生物真菌真菌病毒病毒如酵母菌如酵母菌单细胞的动植物单细胞的动植物如草履虫、单细胞藻类等如草履虫、单细胞藻类等微生物包含了除微生物包含了除植物界植物界和和动物界动物界以外的所有生物以外的所有生物无细胞结构无细胞结构真核细胞真核细胞细菌、蓝藻细菌、蓝藻 原核细胞原核细胞现在学习的是第2页，共37页专题专题2 2 微生物的培养与应用微生物的培养与应用现在学习的是第3页，共37页课题课题1微生物的实验室培养微生物的实验室培养微生物的实验微生物的实验室培养室培养条件条件：（1）为培养的微生物）为培养的微生物提供合提供合适的营养和环境适的营养和环境条件条件（2）确保其他微生物无法混确保其他微生物无法混入入研究和应用研究和应用微生物的微生物的前前提提防止杂菌入侵，获得纯净的培养物现在学习的是第4页，共37页一一.培养基培养基 1概念：人们按照微生物对概念：人们按照微生物对 的不同需求，的不同需求，配制出的供其配制出的供其 的营养基质。的营养基质。（1 1）按物理性质来分：培养基可分为）按物理性质来分：培养基可分为固体培养基、固体培养基、液体培养基和半固体培养基液体培养基和半固体培养基。（2 2）按成分来分，可分为）按成分来分，可分为天然培养基和合成培养天然培养基和合成培养基。基。（3 3）按功能来分，可分为）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。选择培养基和鉴别培养基。2.2.分类：分类：营养物质营养物质生长繁殖生长繁殖现在学习的是第5页，共37页加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基:不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基:不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基:加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基:几种选择培养基举例：几种选择培养基举例：分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌分离固氮菌分离固氮菌 分离自养型微生物分离自养型微生物加入唯一碳源为纤维素的加入唯一碳源为纤维素的培养基培养基分解纤维素的细菌分解纤维素的细菌分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌现在学习的是第6页，共37页几种菌落及其形态现在学习的是第7页，共37页几种菌落及其形态现在学习的是第8页，共37页微生物需要的四大类营养要素物质是：微生物需要的四大类营养要素物质是：3.3.培养基的构成培养基的构成1.1.碳源碳源 2.2.氮源氮源 3.3.无机盐无机盐 4.4.水水凡是能为微生物提供所需碳元素的营养物凡是能为微生物提供所需碳元素的营养物质。质。无机碳源：无机碳源：COCO2 2；NaHCONaHCO3 3等等有机碳源：有机碳源：糖类、脂肪酸、蛋白质、糖类、脂肪酸、蛋白质、花生粉饼、石油等花生粉饼、石油等概念概念来源：来源：不同微生物所利用的碳源不同：不同微生物所利用的碳源不同：1.1.微生物的碳源微生物的碳源a.异养型微生物的碳源为：异养型微生物的碳源为：含碳有机物（有机碳）含碳有机物（有机碳）b.自养型微生物的碳源为：自养型微生物的碳源为：含碳无机物（无机碳）含碳无机物（无机碳）现在学习的是第9页，共37页无机氮源：无机氮源：N N N N2 2、铵、铵、铵、铵盐盐、硝酸盐硝酸盐、NHNH3 3等等等等有机氮源：有机氮源：有机氮源：有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等等等等凡是能够为微生物提供凡是能够为微生物提供凡是能够为微生物提供凡是能够为微生物提供N N N N元素的营养物质。元素的营养物质。元素的营养物质。元素的营养物质。2.2.微生物的氮源微生物的氮源概念：概念：概念：概念：来源：来源：来源：来源：固氮微生物所利用的氮源是：固氮微生物所利用的氮源是：固氮微生物所利用的氮源是：固氮微生物所利用的氮源是：3.3.特殊要求特殊要求培养基还需要满足微生物生长对培养基还需要满足微生物生长对培养基还需要满足微生物生长对培养基还需要满足微生物生长对pHpH、特殊营养物质特殊营养物质,例如例如例如例如:生长因子生长因子生长因子生长因子(微生物生长不可缺少的微生物生长不可缺少的微量微量微量微量有机物）如维生素、有机物）如维生素、有机物）如维生素、有机物）如维生素、某些氨基酸、碱基某些氨基酸、碱基某些氨基酸、碱基某些氨基酸、碱基)以及以及以及以及氧气氧气氧气氧气、二氧化碳二氧化碳二氧化碳二氧化碳、渗透压渗透压渗透压渗透压等等等等的要求。的要求。的要求。的要求。氮气氮气现在学习的是第10页，共37页例例1 1、下列物质可作为培养硝化细菌碳源、氮源和、下列物质可作为培养硝化细菌碳源、氮源和能源的依次是能源的依次是 （）A A含碳无机物、氨、氨含碳无机物、氨、氨B B含碳无机物、氮、硝酸盐含碳无机物、氮、硝酸盐C C含碳有机物、氨、光含碳有机物、氨、光D D含碳有机物、硝酸盐、氨含碳有机物、硝酸盐、氨例例2 2、要将土壤中的自生固氮菌（如原褐固氮菌）、要将土壤中的自生固氮菌（如原褐固氮菌）与其它细菌分离出来，应将它们接种到（与其它细菌分离出来，应将它们接种到（）A A加入指示剂的鉴别培养基加入指示剂的鉴别培养基 B B含有蛋白胨的固体培养基含有蛋白胨的固体培养基C C没有有机氮的选择培养基没有有机氮的选择培养基 D D营养要素全面的液体培养基营养要素全面的液体培养基练一练练一练现在学习的是第11页，共37页牛肉膏当中含有牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类。类、矿物质类及维生素类。的水溶性物质。的水溶性物质。牛肉膏为微生物提供碳牛肉膏为微生物提供碳源源、氮源、氮源、磷酸盐和维生素磷酸盐和维生素.蛋白胨主要提供蛋白胨主要提供氮源氮源和和维生素维生素。现在学习的是第12页，共37页1.1.无菌范围：无菌范围：实验操作空间实验操作空间,操作者的手、衣着操作者的手、衣着消毒消毒.将用于微生物培养的将用于微生物培养的器皿、接种用具器皿、接种用具和培养基和培养基等器具进行灭菌。等器具进行灭菌。为避免周围环境中微生物的污染，实为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在验操作应在酒精灯火焰附近酒精灯火焰附近进行进行.实验操作时应避免已经实验操作时应避免已经灭菌处理的灭菌处理的材料用具材料用具与周围的物品相接触与周围的物品相接触.超净工作台超净工作台二二.无菌技术：无菌技术：防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染现在学习的是第13页，共37页耐高温需保持干燥的耐高温需保持干燥的 物品，物品，160170 12小时小时接种环、接种针等接种环、接种针等 金属用具金属用具7075、30min 80、15min100、56min消毒消毒灭菌灭菌定义定义方法方法较为较为温和温和理化方法，理化方法，杀死杀死部分微生物部分微生物（不不包括芽孢、孢子）包括芽孢、孢子）强烈强烈的理化因素，的理化因素，杀死杀死所有微生物所有微生物（包括（包括芽孢、孢子芽孢、孢子）煮沸消毒法煮沸消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法化学药剂化学药剂紫外线紫外线灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌干热灭菌酒精、氯气、石炭酸或煤酚皂溶液等酒精、氯气、石炭酸或煤酚皂溶液等高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌培养基，培养基，100KPa、121、1530min2.2.消毒与灭菌：消毒与灭菌：现在学习的是第14页，共37页灼烧灼烧灭菌灭菌干热灭菌箱干热灭菌箱高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅现在学习的是第15页，共37页煮沸煮沸消毒消毒法法巴氏消毒法巴氏消毒法化学药剂（化学药剂（70%酒精等）酒精等）紫外线紫外线针对不耐高温的液体针对不耐高温的液体接种室、超净工作台接种室、超净工作台能耐高温的，需要保持干燥的物品能耐高温的，需要保持干燥的物品灼烧法灼烧法干热灭菌干热灭菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌接种工具（接种环等）接种工具（接种环等）吸管吸管实验操作者的双手实验操作者的双手培养皿等玻璃器皿培养皿等玻璃器皿培养基培养基1 1、消毒方法、消毒方法2、灭菌方法、灭菌方法干热灭菌干热灭菌现在学习的是第16页，共37页1.1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？他外来微生物污染外，还有什么目的？2.2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。菌。如果需要，请选择合适的方法。（1 1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3）实验操作者的双手实验操作者的双手 答：无菌技术还能有效避免操作者自身答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。被微生物感染。答：（答：（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒）需要消毒。现在学习的是第17页，共37页1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O 定容至定容至1000mlNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g琼脂琼脂20.0g三三.大肠杆菌的大肠杆菌的纯化纯化培养：培养：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.1.计算：计算：培养基用量培养基用量依配方计算各成分的用量依配方计算各成分的用量2.2.称量：称量：3.3.溶化：溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，称取时？牛肉膏、蛋白胨易吸潮，称取时？牛肉膏、称量纸牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解、少量水加热溶解取纸取纸蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl琼脂琼脂补水定容补水定容4.4.调调pHpH、分装、封口：、分装、封口：1mol1mollNaoH调制微碱调制微碱5.5.灭菌：灭菌：6.6.倒平板：倒平板：培养基、培养皿培养基、培养皿现在学习的是第18页，共37页思考思考1溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热热?加琼脂的目的是什么加琼脂的目的是什么?可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中溶于水中,减少误差减少误差作为凝固剂作为凝固剂现在学习的是第19页，共37页思考思考2 在灭菌前在灭菌前,用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是什么？的锥形瓶的目的是什么？培养皿能否用高压蒸汽灭菌？培养皿能否用高压蒸汽灭菌？在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞；在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞；在取出培养基锥形瓶时也能起到隔绝空气中杂菌在取出培养基锥形瓶时也能起到隔绝空气中杂菌污染的作用污染的作用不能不能,因为培养皿要保持干燥因为培养皿要保持干燥,应该用干热灭菌应该用干热灭菌现在学习的是第20页，共37页倒平板倒平板约约50防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染灼烧灭菌，灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基防止瓶口的微生物污染培养基现在学习的是第21页，共37页1.1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 50 左右时，才左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。了。2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。染培养基。现在学习的是第22页，共37页3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。物。现在学习的是第23页，共37页（二）纯化大肠杆菌（二）纯化大肠杆菌 微生物接种方法常见的有微生物接种方法常见的有平板划线法平板划线法和和稀释涂布平板稀释涂布平板法。法。1.1.平板划线法平板划线法 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后可以分离到由在数次划线后可以分离到由一个细胞一个细胞繁殖而来的繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称肉眼可见的子细胞群体称菌落菌落。现在学习的是第24页，共37页将接种环放在火焰将接种环放在火焰上灼烧，直到接种上灼烧，直到接种环环_在在_旁冷旁冷却接种环，并打开却接种环，并打开棉塞棉塞 将试管口通过火焰将试管口通过火焰 .将已将已_的接种环伸入的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液菌液中蘸取一环菌液 左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，菌种的接种环迅速伸入平板内，划划_条平行线，盖上皿盖。注条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。意不要划破培养基。.将试管通过火焰，将试管通过火焰，并塞上棉塞并塞上棉塞 火焰火焰冷却冷却三至五三至五灼烧接种环，待其冷却后，从灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的第一区域划线的_开始往第开始往第二区域内划线。重复以上操作，二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。在三、四、五区域内划线。注意注意不要将最后一区的划线与第一不要将最后一区的划线与第一区相连。区相连。末端末端烧红烧红将平板将平板_放入放入培养箱中培养。培养箱中培养。倒置倒置现在学习的是第25页，共37页划划3 3个平板个平板1 1个不划线个不划线（空白对照）（空白对照）现在学习的是第26页，共37页1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？吗？为什么？答：操作的答：操作的第一步第一步灼烧接种环是为了避免接种环上灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；可能存在的微生物污染培养物；每次划线前每次划线前灼烧接灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束划线结束后灼烧接种环后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。细菌污染环境和感染操作者。现在学习的是第27页，共37页2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。单个细菌繁殖而来的菌落。现在学习的是第28页，共37页 2.2.稀释涂布平板法稀释涂布平板法 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。落。稀释涂布平板法操作过程分稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。释操作和涂布平板操作。现在学习的是第29页，共37页系列稀释操作系列稀释操作101102103104105106 (1)(1)将分别盛有将分别盛有9mL9mL水的试管灭菌并编号。水的试管灭菌并编号。(2)(2)用移液管吸取用移液管吸取1mL1mL培养的菌液，注入第二支试管中，培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。(3)(3)从从10101 1倍稀释的试管中吸取倍稀释的试管中吸取1mL1mL稀释液，注入第三稀释液，注入第三支试管中，重复步骤支试管中，重复步骤2 2，直至到第六支试管。，直至到第六支试管。现在学习的是第30页，共37页涂布平板操作涂布平板操作(1)(1)将涂布器浸在盛有将涂布器浸在盛有7070的酒精的烧杯中。的酒精的烧杯中。(2)(2)取少量菌液（不超取少量菌液（不超0.1mL0.1mL），滴加到培养基表面。），滴加到培养基表面。(3)(3)将沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷却将沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷却8 810s10s。(4)(4)用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。现在学习的是第31页，共37页b.b.涂布平板：涂布平板：不超过不超过0.1ml0.1ml各梯度分别涂布各梯度分别涂布3个平板个平板1 1个不涂布作空白对照个不涂布作空白对照滴滴灼灼试试涂涂稀稀释释10103 3倍倍稀稀释释10104 4倍倍稀稀释释10105 5倍倍现在学习的是第32页，共37页2.2.菌种培养菌种培养：3.3.实验结果观察实验结果观察将将接种后接种后的培养基和一个的培养基和一个未接种未接种的培养基的培养基放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养12h12h24h24h后，后，观察并记录观察并记录现在学习的是第33页，共37页涂布平板操作讨论涂布平板操作讨论 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2 2步应步应如何进行无菌操作？如何进行无菌操作？应从操作的各个细节保证应从操作的各个细节保证“无菌无菌”。例如，酒精灯。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。吸管要在酒精灯火焰周围等等。将接种后和未接种（作为对照组）的培养基均放到将接种后和未接种（作为对照组）的培养基均放到37370 0C C的恒温箱中，培养的恒温箱中，培养121224h24h后进行观察并记录结果。后进行观察并记录结果。现在学习的是第34页，共37页 1.1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？有菌落生长，说明了什么？未接种的培养基在恒温箱中保温未接种的培养基在恒温箱中保温1 12 d2 d后无菌落后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。制备。2.2.在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似吗？的菌落？它们的大小、形状、颜色相似吗？如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、形状、颜色相似的菌落。形状、颜色相似的菌落。四、结果分析与评价四、结果分析与评价现在学习的是第35页，共37页 3.3.培养培养12h12h和和24h24h后，观察到的实验结果相同吗？后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？如果不同，请分析产生差异的原因？培养培养12 h12 h与与24 h24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增不同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。大。4.4.如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析其可能的原因。析其可能的原因。无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可能是接种时发生了污染；也可能是在培养的底；可能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了污染。过程中受到了污染。现在学习的是第36页，共37页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第37页，共37页