基因工程的酶学基础精选PPT.ppt

关于基因工程的酶学基础关于基因工程的酶学基础第1页，讲稿共122张，创作于星期日一一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 （restriction endonucleaserestriction endonuclease）这类酶又简称为这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶限制性内切酶或限制酶 是一类能够识别双链是一类能够识别双链DNADNA分子中的某种特定核分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割苷酸序列，并由此切割DNADNA双链结构的核苷酸内切双链结构的核苷酸内切酶酶第2页，讲稿共122张，创作于星期日寄主控制的限制（寄主控制的限制（restrictionrestriction）与修饰与修饰 (modification)(modification)现象现象 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍，即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉第3页，讲稿共122张，创作于星期日第4页，讲稿共122张，创作于星期日R/MR/M体系：体系：寄主是由两种酶活性配合完成的寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的一种是修饰的甲基转移酶甲基转移酶 另一种是另一种是核酸内切限制酶核酸内切限制酶第5页，讲稿共122张，创作于星期日E.E.colicoliB B含有含有EcoBEcoB核酸酶和核酸酶和EcoBEcoB甲基化酶甲基化酶 当当(k)(k)噬菌体侵染噬菌体侵染E.E.colicoliB B时，由于其时，由于其DNADNA中有中有EcoBEcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.E.colicoliB B的的DNADNA中虽然也存在这种特异序列，但可在中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoBEcoB甲基甲基化酶的作用下，催化化酶的作用下，催化S-S-腺苷甲硫氨酸（腺苷甲硫氨酸（SAMSAM）将甲基转移）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoBEcoB核酸核酸酶不能识别已甲基化的序列。酶不能识别已甲基化的序列。第6页，讲稿共122张，创作于星期日 R/MR/M体系的作用：体系的作用：保护自身的保护自身的DNADNA不受限制；不受限制；破坏外源破坏外源DNADNA使之迅速降解使之迅速降解第7页，讲稿共122张，创作于星期日限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源源DNADNA的一类酶，其功能是避免外源的一类酶，其功能是避免外源DNADNA的干扰或噬的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/MR/M现现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。酶。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNADNA的特的特点，可以将限制性内切酶分为三类：点，可以将限制性内切酶分为三类：型酶、型酶、型酶、型酶、型酶型酶限制性内切酶的分类限制性内切酶的分类第8页，讲稿共122张，创作于星期日型酶：型酶：19681968年，年，M.MeselsonM.Meselson和和R.YuanR.Yuan在在E.E.colicoliB B和和E.E.colicoliK K中分离出的核酸内切酶。中分离出的核酸内切酶。分子量较大，反应需分子量较大，反应需MgMg+、S-S-腺苷酰腺苷酰-L-L-甲硫氨酸甲硫氨酸（SAMSAM）、）、ATPATP等。这类酶有等。这类酶有特异的识别位点特异的识别位点但但没有特没有特异的切割位点异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。程中应用不大。第9页，讲稿共122张，创作于星期日型酶型酶 这这类类酶酶可可识识别别特特定定碱碱基基顺顺序序，并并在在这这一一顺顺序序的的33端端2426bp2426bp处处切切开开，所所以以它它的的切切割割位位点点也也是是没没有有特异性的。特异性的。第10页，讲稿共122张，创作于星期日型酶型酶 19701970年，年，H.O.SmithH.O.Smith和和K.W.WilcoxK.W.Wilcox在流感嗜血在流感嗜血RdRd株中分株中分离出来的限制酶。离出来的限制酶。分子量较小（分子量较小（10105 5DaDa），只有一种多肽，通常以同源二），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需聚体的形式存在。反应只需MgMg+的存在，并且具有以下的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。用。识别位点是一个识别位点是一个回文对称结构回文对称结构，并且切割位点也在这，并且切割位点也在这一回文对称结构上。一回文对称结构上。许多许多型酶切割型酶切割DNADNA后，可在后，可在DNADNA上形成上形成粘性末端粘性末端，有，有利于利于DNADNA片段的重组。片段的重组。第11页，讲稿共122张，创作于星期日主要特性主要特性I 型型II型型III 型型限制修饰限制修饰多功能多功能单功能单功能双功能双功能蛋白结构蛋白结构异源三聚体异源三聚体同源二聚体同源二聚体异源二聚体异源二聚体辅助因子辅助因子ATP Mg2+SAMMg2+Mg2+SAM ATP识别序列识别序列TGAN8TGCT AACN6GTGC旋转对称序列旋转对称序列 GAGCCCAGCAG切割位点距切割位点距距识别序列距识别序列1kb处随机性切割处随机性切割识别序列内或附近识别序列内或附近特异性切割特异性切割识别序列下游识别序列下游24-26bp处处第12页，讲稿共122张，创作于星期日第一个字母：大写，表示所来自的微生物属名的第一个字母 第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母 其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号 罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号 3.3.限制性核酸内切酶的命名原则：限制性核酸内切酶的命名原则：例：例：EcoR I:来自于来自于Escheria coli RY13的第一个限制酶的第一个限制酶第13页，讲稿共122张，创作于星期日同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶Haemophilus influenzae d属名种名株名嗜血流感杆菌d株HindIIH i n dIII19681968年，年，SmithSmith等人首先从流感嗜血杆菌等人首先从流感嗜血杆菌d d株中分离出株中分离出HindIIHindII和和HindIIIHindIII第14页，讲稿共122张，创作于星期日4限制酶的特性限制酶的特性a.a.限制酶识别靶序列同限制酶识别靶序列同DNADNA的来源无关；的来源无关；b.b.限制酶识别靶序列是唯一的（对某种限制酶只具一个限限制酶识别靶序列是唯一的（对某种限制酶只具一个限制位点的质粒）。制位点的质粒）。第15页，讲稿共122张，创作于星期日二、二、型酶型酶第16页，讲稿共122张，创作于星期日1.II 1.II 型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性 识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构旋转对称型回文结构EcoR I的切割位点 EcoR I的识别序列 5GCTGAATTCGAG33CGACTTAAGCTC5第17页，讲稿共122张，创作于星期日5G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C5EcoRI等产生的5 粘性末端5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C5退火4-7 OH P5G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C5POHEcoRI 37 第18页，讲稿共122张，创作于星期日PstI等产生的3粘性末端5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C55G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G33C-G-A-G-POH-A-C-G-T-C-C-T-C5PstI 37 退火4-7 OHP5G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G33C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C5POH第19页，讲稿共122张，创作于星期日PvuII等产生的平头末端5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G33C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C55G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G33C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C5PvuII 37 第20页，讲稿共122张，创作于星期日2.2.核酸内切酶作用后的断裂方式核酸内切酶作用后的断裂方式 （1 1）粘性末端粘性末端 ：两条链上的断裂位置是交错地、：两条链上的断裂位置是交错地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的结果形成具有粘性末端的DNADNA片断。片断。第21页，讲稿共122张，创作于星期日GGATCCCCTAGGGCCTAGGGATCC G+第22页，讲稿共122张，创作于星期日5-端突出端突出粘性末端粘性末端 3-端突出端突出5AATTC353ACGTC第23页，讲稿共122张，创作于星期日（2 2）平末端）平末端 两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNADNA片片断。断。不易重新环化。不易重新环化。第24页，讲稿共122张，创作于星期日Hind GTCGACCAGCTGGTCCAGGACCTG+第25页，讲稿共122张，创作于星期日第26页，讲稿共122张，创作于星期日3 3同裂酶（同裂酶（isoschizomers)isoschizomers)指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶，同裂酶进指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶，同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化对甲基化位点的敏感性不同位点的敏感性不同。Example:Example:限制酶限制酶HpaHpa和和MspMsp是一对同裂酶是一对同裂酶 (C CC CGGGG)，当靶，当靶序列中有一个序列中有一个5-5-甲基胞嘧啶时甲基胞嘧啶时HpaHpa不能进行切割，不能进行切割，而而MspMsp可以。可以。第27页，讲稿共122张，创作于星期日4 4同尾酶（同尾酶（isocaudamerisocaudamer）指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。择余地更大。第28页，讲稿共122张，创作于星期日 杂种位点（杂种位点（hybrid sitehybrid site）由一对同尾酶分别产生的）由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。BamHBamH G G GATC GATC C C BclBcl T T GATCGATC A A C C CTAGCTAG G G A A CTAGCTAG T T 杂种位点杂种位点 ：T T GATCGATC C C（BamHBamH ）（Bcl）A ACTAG CTAG G G 第29页，讲稿共122张，创作于星期日5 5限制片断的末端连接作用限制片断的末端连接作用 （）分子间的连接：不同的（）分子间的连接：不同的DNADNA片断通过互补的粘性片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。末端之间的碱基配对而彼此连接起来。第30页，讲稿共122张，创作于星期日（2）分子内的连接：由同一片断的两个互补末端）分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子之间的碱基配对而形成的环形分子第31页，讲稿共122张，创作于星期日6.II 6.II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件Tris-HCl 50 mM pH 7.5MgCl210 mM 0-50 mM 低盐酶NaCl 0-150 mM 100 mM 中盐酶DTT 1 mM 150 mM 高盐酶Volume 20-100 lT 37 1-1.5 h1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1 小时，完全水解1 g 标准DNA所需的酶量第32页，讲稿共122张，创作于星期日对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：BamHI SmaI5GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT33CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：5GCTACATGGATTCCCGGGTTCGCAT33CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA55GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT33CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5第33页，讲稿共122张，创作于星期日II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切0.1倍体积的5 M NaAc pH 5.42.5倍体积的冰冷乙醇冰浴5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥第34页，讲稿共122张，创作于星期日6 6影响核酸内切酶活性的因素：影响核酸内切酶活性的因素：（）（）DNADNA的纯度：的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTTAEDTTA、SDSSDS、NaClNaCl等等DNaseDNase的污染的污染(Mg+)(Mg+)a.a.增加核酸内切限制酶的用量；增加核酸内切限制酶的用量；b.b.扩大酶催化反应的体系（扩大酶催化反应的体系（稀释稀释）；）；c.c.延长酶催化反应的保温时间。延长酶催化反应的保温时间。d.d.加入加入亚精胺亚精胺提高酶的消化作用，需提高酶的消化作用，需适当适当的温度的温度第35页，讲稿共122张，创作于星期日（2 2）DNADNA的甲基化程度的甲基化程度l大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6 6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响l大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5 5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等l哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5 5位上引入甲基第36页，讲稿共122张，创作于星期日 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Staractivity现象。EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC 3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5PuPuATTPyPy3或者5AATT 3（3 3）核酸内切酶的缓冲液性质）核酸内切酶的缓冲液性质嘧啶碱基嘧啶碱基T/C嘌呤碱基嘌呤碱基A/G第37页，讲稿共122张，创作于星期日（4 4）酶切消化反应的温度：酶切消化反应的温度：大多数酶的标准反应温度大多数酶的标准反应温度37度度（5 5）DNADNA的分子结构：的分子结构：某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所所需要的酶量要比消化线性的需要的酶量要比消化线性的DNA高高29倍倍第38页，讲稿共122张，创作于星期日7 7核酸内切限制酶标准的缓冲液核酸内切限制酶标准的缓冲液（1 1）.氯化镁、氯化钠或氯化钾：氯化镁、氯化钠或氯化钾：不正确的不正确的NaClNaCl或或Mg+Mg+浓度，会降低限制酶的活性，还可能导致浓度，会降低限制酶的活性，还可能导致识别序列的改变识别序列的改变 （2 2）.Tris-HCl.Tris-HCl：维持最适的维持最适的pHpH值（值（pH pH 7.47.4）（3 3）.-.-巯基乙醇或二硫苏糖醇（巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTTDTT）：维持酶的稳定性维持酶的稳定性（4 4）.牛血清蛋白（牛血清蛋白（BSABSA）：维持酶的稳定性维持酶的稳定性第39页，讲稿共122张，创作于星期日8 8核酸内切限制酶对核酸内切限制酶对DNADNA的消化作用的消化作用（1 1）核酸内切限制酶以）核酸内切限制酶以同型二聚体同型二聚体形式与靶序列发生形式与靶序列发生作用作用（2 2）核酸内切限制酶对）核酸内切限制酶对DNADNA的局部消化的局部消化 完全的酶切消化：识别序列完全的酶切消化：识别序列n n个碱基的核酸内切限制酶，个碱基的核酸内切限制酶，对对DNADNA的切割能达到每隔的切割能达到每隔4 4n n切割一次的水平切割一次的水平第40页，讲稿共122张，创作于星期日（3 3）核酸内切限制酶对真核生物基因组的消化作用）核酸内切限制酶对真核生物基因组的消化作用小分子量的片断小分子量的片断-少少 （电泳（电泳-容易分离目的片断）容易分离目的片断）大分子量的片断大分子量的片断-多（基因文库）多（基因文库）第41页，讲稿共122张，创作于星期日1连接酶2体外连接1 1连接酶连接酶2 2体外连接体外连接第42页，讲稿共122张，创作于星期日1.1 1.1 连接酶的作用机理连接酶的作用机理 能够将能够将DNADNA链上彼此相邻的链上彼此相邻的3-3-羟基（羟基（OHOH）和）和5-5-磷酸基团（磷酸基团（-P-P），在），在NAD+NAD+或或ATPATP供能的作用下，供能的作用下，形成磷酸二酯键。形成磷酸二酯键。只能连接只能连接缺口缺口（nicknick），不能连接），不能连接裂口裂口（gapgap）。）。而且被连接的而且被连接的DNADNA链必须是双螺旋链必须是双螺旋DNADNA分子的一部分。分子的一部分。第43页，讲稿共122张，创作于星期日第44页，讲稿共122张，创作于星期日第45页，讲稿共122张，创作于星期日 酶酶AMPAMP（腺苷磷酸）（腺苷磷酸）磷酸酰胺键磷酸酰胺键DNADNA的腺苷酸复合物的腺苷酸复合物3-OH3-OH对对P P原子作亲核攻击原子作亲核攻击 形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键连接酶的作用机理连接酶的作用机理此反应是由焦磷酸此反应是由焦磷酸 (ppi)(ppi)的水解作用激发的的水解作用激发的需要花费两个高能磷酸键需要花费两个高能磷酸键（赖氨酸残基赖氨酸残基）第46页，讲稿共122张，创作于星期日 1.2连接酶的来源连接酶的来源 .DNA.DNA连接酶：连接酶：大肠杆菌染色体编码的大肠杆菌染色体编码的 .T.T4 4 DNA DNA连接酶：大肠杆菌连接酶：大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体DNADNA编码的编码的 DNADNA连接酶连接酶 NAD+NAD+T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶 ATPATP第47页，讲稿共122张，创作于星期日连接酶（连接酶（DNA ligaseDNA ligase）该酶常从噬菌体的受体细胞中提取，是由该酶常从噬菌体的受体细胞中提取，是由噬菌体基因组所编码的噬菌体基因组所编码的，基因工程中常用的连接酶是，基因工程中常用的连接酶是连接酶。它可催化中磷酸二脂键的形成，从而使两连接酶。它可催化中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来个片段以共价键的形式结合起来 DNADNA连连接接酶酶对对具具有有粘粘性性末末端端的的DNADNA分分子子经经退退火火后后能能很很好好地地连连接接，对对平平末末端端的的DNADNA分分子子也也可可以以进进行行连连接接，但但连连接效率较低，必须加大酶的用量接效率较低，必须加大酶的用量。第48页，讲稿共122张，创作于星期日第49页，讲稿共122张，创作于星期日 1.3 影响连接酶作用的因素影响连接酶作用的因素（1 1）反应温度：）反应温度：连接缺口的温度：连接缺口的温度：3737度度 连接连接粘性末端粘性末端的最佳温度：的最佳温度：4 41515度度（2 2）连接酶的用量：连接酶的用量：平末端平末端DNADNA分子的连接反应中，最适分子的连接反应中，最适1 12 2个单位。个单位。粘性末端粘性末端DNADNA片断之间的连接，酶浓度片断之间的连接，酶浓度0.10.1个单位。个单位。ATPATP的用量的用量10mol10mol1mmol/L1mmol/L之间之间（3 3）提高外源片断与载体的浓度的比值，（）提高外源片断与载体的浓度的比值，（10102020倍）倍）第50页，讲稿共122张，创作于星期日2.2.体外连接体外连接第51页，讲稿共122张，创作于星期日体外连接的三种方式体外连接的三种方式a.a.用用DNADNA连接酶连接具有互补连接酶连接具有互补粘性末端粘性末端的的DNADNA片断片断b.b.用用T T4 4DNADNA连接酶将平末端的连接酶将平末端的DNADNA片断连接；或是用片断连接；或是用末端末端脱氧核苷酸转移酶脱氧核苷酸转移酶给具平末端的给具平末端的DNADNA片断加上片断加上poly(A)-poly(T)poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用尾巴之后，再用DNADNA连接酶连接。连接酶连接。c.c.先在先在DNADNA片断末端加上化学合成的片断末端加上化学合成的衔接物或接头衔接物或接头，形，形成粘性末端后，再用成粘性末端后，再用DNADNA连接酶连接连接酶连接 第52页，讲稿共122张，创作于星期日2.1 粘性末端粘性末端DANDAN片断的连接片断的连接 由于具粘性末端的载体易发生自连，对载体的由于具粘性末端的载体易发生自连，对载体的55末末端进行处理，用细菌的或小牛肠的端进行处理，用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶碱性磷酸酶移去磷酸移去磷酸基团，使载体不能自连。基团，使载体不能自连。而外源片断的而外源片断的5-P5-P能与载体的能与载体的3-OH3-OH进行共价键的进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中载体载体DNADNA只有一条链与外源片断相连，失去只有一条链与外源片断相连，失去5-P5-P的的链不能进行连接，形成链不能进行连接，形成3-OH 3-OH 和和5-OH 5-OH 的缺口。的缺口。第53页，讲稿共122张，创作于星期日第54页，讲稿共122张，创作于星期日第55页，讲稿共122张，创作于星期日 2.2 平末端平末端DNADNA片断的连接片断的连接 （1 1）T T4 4DNADNA连接酶连接酶 （2)2)用用末端核苷酸转移酶末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之给平末端加上同聚物尾巴之后，再用后，再用DNADNA连接酶连接。连接酶连接。常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法接法第56页，讲稿共122张，创作于星期日 同聚物加尾法同聚物加尾法用用5 5 末端特异的核酸外切酶处理末端特异的核酸外切酶处理DNADNA片断片断在在A A和和B B分别中加入分别中加入dATPdATP和和dTTPdTTP同聚物尾巴同聚物尾巴10104040个碱基个碱基第57页，讲稿共122张，创作于星期日 同聚物加尾法或同聚物加尾法或T4T4连接酶的平末端连接法，连接酶的平末端连接法，无法用原来的限制酶作特异性的切割，对获无法用原来的限制酶作特异性的切割，对获得插入片断进行进一步的研究。得插入片断进行进一步的研究。第58页，讲稿共122张，创作于星期日衔接物连接法衔接物连接法 平末端的另一种处理方式是利用衔接物平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linkerlinker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子一种人工合成的小分子DNADNA，约，约10201020个核苷酸，其结构个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。如：构。如：CCGGATCCGG CCGGATCCGG GGCCTAGGCC GGCCTAGGCC 将衔接物分子与平末端将衔接物分子与平末端DNADNA分子连接，再用限制性核酸分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点HpaIIHpaIIBamHI或或Sau3A第59页，讲稿共122张，创作于星期日 衔接物（衔接物（linkerlinker）：是指用化学方法合成的一：是指用化学方法合成的一段由段由10101212个核苷酸组成、具有一个或数个限制个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。第60页，讲稿共122张，创作于星期日衔接物连接法衔接物连接法第61页，讲稿共122张，创作于星期日双衔接物：双衔接物：可以实现定向克隆，防可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断的再止发生自连，同时对克隆片断的再删除也比较方便。删除也比较方便。第62页，讲稿共122张，创作于星期日双衔接物连接法双衔接物连接法的基本程序的基本程序cDNAcDNA链的合成链的合成通过通过DNADNA聚合酶合成第二链聚合酶合成第二链加入加入Sal ISal I衔接物衔接物S IS I核酸酶作用后的末端单链突出序列，核酸酶作用后的末端单链突出序列，由由KlenowKlenow补齐，加入第二衔接物补齐，加入第二衔接物Ecol IEcol I第63页，讲稿共122张，创作于星期日 在用在用DNADNA衔接物连接法时，如果待克衔接物连接法时，如果待克隆隆DNADNA的片断或基因的片断或基因内部内部，含有与所加衔，含有与所加衔接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因切断。切断。第64页，讲稿共122张，创作于星期日（）（）DNADNA接头（接头（adapteradapter）连接法：）连接法：19781978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的。授吴瑞博士发明的。它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对体分子。对DNADNA接头分子末端，进行必要的修饰。移接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端走粘性末端5-P5-P，暴露出，暴露出5-OH5-OH，不能产生稳定的二，不能产生稳定的二聚体分子。聚体分子。第65页，讲稿共122张，创作于星期日第66页，讲稿共122张，创作于星期日DNA接头连接法接头连接法第67页，讲稿共122张，创作于星期日（）热稳定的连接热稳定的连接 从嗜热高温方线菌的菌株中分离出来的。能在从嗜热高温方线菌的菌株中分离出来的。能在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接用的一种高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接用的一种核酸酶。可明显的降低形成非特异性连接产物的核酸酶。可明显的降低形成非特异性连接产物的几率，在几率，在8585度下具有酶活性。重复升温度下具有酶活性。重复升温9494度之度之后仍具有酶活性。后仍具有酶活性。第68页，讲稿共122张，创作于星期日1.1.寡核苷酸连接测定寡核苷酸连接测定2.2.（oligonucletide ligation assay,OLAoligonucletide ligation assay,OLA）3.3.用两个寡核苷酸探针，同已知序列的靶用两个寡核苷酸探针，同已知序列的靶DNADNA杂交，杂交，探针在靶探针在靶DNADNA分子的位置是相邻的。分子的位置是相邻的。4.4.探针长度是探针长度是202025bp25bp2.2.连接酶链式反应（连接酶链式反应（lingase chain reaction,LCRlingase chain reaction,LCR）连接扩增连接扩增反应（反应（lingase amplication reactionlingase amplication reaction）3.3.用寡核苷酸探针通过用寡核苷酸探针通过DNADNA连接酶的作用扩增已知序连接酶的作用扩增已知序列的靶列的靶DNADNA的方法。需要的方法。需要4 4种引物。种引物。第69页，讲稿共122张，创作于星期日LCR：ligasechainreaction，连接酶链，连接酶链式反应。式反应。样品样品DNA、探针、探针(4)94度变性、度变性、NAD55度退火第71页，讲稿共122张，创作于星期日三、三、DNA聚合酶第72页，讲稿共122张，创作于星期日 常用的常用的DNADNA聚合酶：聚合酶：大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶、聚合酶、大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶的聚合酶的KlenowKlenow大片断酶、大片断酶、T4DNAT4DNA聚合酶、聚合酶、T7DNAT7DNA聚合酶、聚合酶、反转录酶等。反转录酶等。第73页，讲稿共122张，创作于星期日共同点：共同点：把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNADNA分子引分子引物链的物链的3-OH3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。不发生从引物模板上解离的情况。第74页，讲稿共122张，创作于星期日1.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶（聚合酶（PolPol）、）、DNADNA聚合酶聚合酶（Pol Pol ）、）、DNADNA聚合酶聚合酶 （Pol Pol ）、）、PolPol和和Pol Pol 的主要功能参与的主要功能参与DNADNA的合成；的合成；Pol Pol 的功能同的功能同DNADNA的复制有关；的复制有关；PolPol同同DNADNA分子克隆的关系最为密切。分子克隆的关系最为密切。第75页，讲稿共122张，创作于星期日1.1 1.1 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶：聚合酶：19571957年，美国的生物学家年，美国的生物学家A.KornbergA.Kornberg首次证实，在大肠杆首次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种菌提取物中存在一种DNADNA聚合酶，即现在所说的聚合酶，即现在所说的DNADNA聚合酶。聚合酶。由由polpol基因编码的一种单链多肽蛋白质，分子量为基因编码的一种单链多肽蛋白质，分子量为10910910103 3daldal。DNADNA聚合酶，可以被蛋白酶切割成两个片断，一个具聚合酶，可以被蛋白酶切割成两个片断，一个具有全部的有全部的3 53 5的外切酶活性和的外切酶活性和5 3 5 3 的聚合的聚合酶活性，另一个具有全部酶活性，另一个具有全部5 35 3的外切酶活性。的外切酶活性。第76页，讲稿共122张，创作于星期日 DNADNA聚合酶的酶活性：聚合酶的酶活性：1.5 31.5 3的聚合酶活性；的聚合酶活性；2.5 32.5 3的外切酶活性；的外切酶活性；3.3 53.3 5的外切酶活性（较低）。的外切酶活性（较低）。第77页，讲稿共122张，创作于星期日 1.2 DNADNA聚合酶发挥作用的条件：聚合酶发挥作用的条件：1 1、底物：四种脱氧核苷、底物：四种脱氧核苷5-5-三磷酸（三磷酸（dNTPdNTP）；）；2 2、MgMg离子；离子；3 3、带有、带有3-OH3-OH游离基团的引物链；游离基团的引物链；4 4、DNADNA模板：单链，双链（糖模板：单链，双链（糖-磷酸主键上有一个或多个断磷酸主键上有一个或多个断裂）。裂）。第78页，讲稿共122张，创作于星期日第79页，讲稿共122张，创作于星期日 PolPol第80页，讲稿共122张，创作于星期日 1.3 DNA1.3 DNA聚合酶聚合酶5 35 3的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性 1 1、5 35 3的外切酶活性，所切割的的外切酶活性，所切割的DNADNA链必须是位于链必须是位于双螺旋双螺旋的的区段上；区段上；2 2、切割部位可以是末端磷酸二酯键，也可以是在距、切割部位可以是末端磷酸二酯键，也可以是在距55末端数末端数个核苷酸远的一个键上发生；个核苷酸远的一个键上发生；3 3、DNADNA的合成可以增强的合成可以增强5 35 3的核酸外切酶活性；的核酸外切酶活性；4 4、5 35 3核酸外切酶的活性位点同聚合作用的活性位点以核酸外切酶的活性位点同聚合作用的活性位点以及及3 53 5的水解作用位点是分开的。的水解作用位点是分开的。第81页，讲稿共122张，创作于星期日第82页，讲稿共122张，创作于星期日 1.4 DNADNA聚合酶的聚合酶的3 53 5核酸外切酶活性核酸外切酶活性 能催化能催化DNADNA链发生水解作用，从链发生水解作用，从DNADNA链链3-OH3-OH末端开始向末端开始向55的方的方向水解向水解DNADNA，并释放出单核苷酸分子。，并释放出单核苷酸分子。对酶活的影响：对酶活的影响：反应物中缺乏反应物中缺乏dNTPsdNTPs时，大肠杆菌时，大肠杆菌DNADNA聚合酶的聚合酶的3 53 5核酸外核酸外切酶活性，将会发挥作用。但对于底物是双链的切酶活性，将会发挥作用。但对于底物是双链的DNADNA，在具有，在具有dNTPsdNTPs时，这种降解活性将会被时，这种降解活性将会被5 35 3的聚合酶活性所抑制的聚合酶活性所抑制。第83页，讲稿共122张，创作于星期日 第84页，讲稿共122张，创作于星期日 1.5 DNADNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：聚合酶在分子克隆中的主要用途：通过通过DNADNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNADNA探针探针 DNADNA缺口转移（缺口转移（nick translationnick translation）在在DNADNA分子的单链缺口上，分子的单链缺口上，DNADNA聚合酶的聚合酶的5 35 3核酸外切酶活核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的55一一侧移去一个侧移去一个55核苷酸之后，聚合酶作用就会在缺口的核苷酸之后，聚合酶作用就会在缺口的33一侧补一侧补上一个新的核苷酸，但上一个新的核苷酸，但polpol不能在不能在3-OH3-OH和和5-P5-P之间形成一之间形成一个键，随着个键，随着55一侧的核苷酸不断移去，一侧的核苷酸不断移去，33一侧的核苷酸又按序一侧的核苷酸又按序列增补，缺口便沿着列增补，缺口便沿着DNADNA分子合成的方向移动分子合成的方向移动 第85页，讲稿共122张，创作于星期日 DNADNA杂交探针的制备杂交探针的制备 典型的反应体系是。在典型的反应体系是。在25l25l总体积中含有总体积中含有1g1g纯化的特纯化的特定定DNADNA片断，并加入适量的片断，并加入适量的DnaseDnase、PolPol、-32p-dNTPs-32p-dNTPs和未标记的和未标记的dNTPsdNTPs。DnaseDnase：造成造成DNADNA分子的断裂或缺口；分子的断裂或缺口；PolPol ：进行缺口转移，使反应混合物中的进行缺口转移，使反应混合物中的3