分子生物学实验原理与常见问题解答讲稿.ppt
分子生物学实验原理与常见问题解答第一页，讲稿共五十二页哦nRNA提取原理与注意事项nPCR原理与常见问题nReal-time PCR介绍内容第二页，讲稿共五十二页哦商品化提取试剂盒原理：异硫氰酸胍（GIT）-酚法 GIT与 十二烷基肌氨酸钠（Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；GIT与巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；一一定条件下定条件下（各家试剂条件不同），RNA不溶于乙醇，而DNA和蛋白质溶于乙醇溶液，通过滤柱时，RNA挂柱，DNA和蛋白质溶于滤液；在逐步洗脱的过程中，RNA不断被纯化；最后用水洗脱。第三页，讲稿共五十二页哦 杜绝外源酶的污染：n严格戴好帽子，口罩，手套。n实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。n实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。RNA提取的注意事项（外界环境中多含Rnase，且RNA极不稳定）RNase freeDNase free第四页，讲稿共五十二页哦 阻止内源酶的活性：n选择合适的匀浆方法。n选择合适的裂解液。n控制好样品的起始量。第五页，讲稿共五十二页哦nRNA提取原理与注意事项nPCR原理与常见问题nReal-time PCR第六页，讲稿共五十二页哦PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理q 模板模板DNA的变性：的变性：93-95左右，左右，q 模板模板DNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：Ta=Tm-35 q 引物的延伸：引物的延伸：Taq DNA聚合酶之聚合酶之5-3DNA聚合酶活性聚合酶活性变性变性-退火退火-延伸三个步骤延伸三个步骤 第七页，讲稿共五十二页哦引物的复性温度引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：通过以下公式帮助选择合适的温度：nTm值（解链温度）值（解链温度）=4（G+C）2（A+T）n复性温度复性温度=Tm值值-（510）在在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性反应的特异性n复性时间一般为复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间，足以使引物与模板之间完全结合完全结合第八页，讲稿共五十二页哦1234522557294时间（min）温度（）PCRPCR的基本原理的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍第九页，讲稿共五十二页哦模板DNA95第十页，讲稿共五十二页哦PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50引物1引物2DNA引物第十一页，讲稿共五十二页哦PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶第十二页，讲稿共五十二页哦PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第1轮结束第2轮开始第十三页，讲稿共五十二页哦PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点955072TaqTaqTaqTaq第十四页，讲稿共五十二页哦PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第2轮结束第十五页，讲稿共五十二页哦PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点重复重复3030轮后轮后2 23030=1,073,741,824=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增 第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 第十六页，讲稿共五十二页哦标准的标准的PCRPCR反应体系（反应体系（100ul100ul体系）体系）10扩增缓冲液扩增缓冲液 10ul 4种种dNTP混合物混合物 各各200umol/L 引物引物 10100pmol 模板模板 0.12ug Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5u Mg2+1.5mmol/L 加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ul第十七页，讲稿共五十二页哦PCRPCR反应五要素反应五要素n模板模板（template）n引物（引物（primer）n酶酶（Taq DNA polymerase）n dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）nMg2+（magnesium）第十八页，讲稿共五十二页哦（1 1）模板）模板 单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng DNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。第十九页，讲稿共五十二页哦（2 2）引物浓度）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。第二十页，讲稿共五十二页哦（4 4）dNTPdNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。第二十一页，讲稿共五十二页哦（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。第二十二页，讲稿共五十二页哦EB染色原理：EB插入DNA碱基对之间的结合第二十三页，讲稿共五十二页哦PCR常见问题n无扩增产物n非特异性扩增n拖尾n假阳性第二十四页，讲稿共五十二页哦 无扩增产物现象现象：阳对照有条带，而样品则无：阳对照有条带，而样品则无M样品样品A样品样品B阳性对照阳性对照第二十五页，讲稿共五十二页哦1.1.纯度：含有抑制物纯度：含有抑制物2.2.浓度：含量低浓度：含量低3.3.质量：质量：RNARNA被降解被降解4.4.操作：体系配制有误，模操作：体系配制有误，模板加入有误板加入有误 原因原因1.1.纯化模板或者使用优质试剂纯化模板或者使用优质试剂盒提取模板盒提取模板RNARNA2.2.加大模板的用量加大模板的用量3.3.重新提取重新提取RNARNA，并做好无，并做好无RnaseRnase前处理前处理4.4.重新配置扩增体系，重新重新配置扩增体系，重新PCRPCR对策对策第二十六页，讲稿共五十二页哦 非特异性扩增非特异性扩增 现现象象：PCRPCR扩扩增增后后出出现现的的条条带带与与预预计计的的大大小小不不一一致致，或或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。第二十七页，讲稿共五十二页哦1.1.引物特异性差引物特异性差2.2.模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高3.3.酶量过多酶量过多4.4.MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高5.5.退火温度偏低退火温度偏低6.6.循环次数过多循环次数过多 原因原因1.1.重新设计引物或者使用巢式重新设计引物或者使用巢式PCRPCR2.2.适当降低模板或引物浓度适当降低模板或引物浓度3.3.适当减少酶量适当减少酶量4.4.降低镁离子浓度降低镁离子浓度5.5.适当提高退火温度或使用二适当提高退火温度或使用二阶段温度法阶段温度法6.6.减少循环次数减少循环次数 对策对策第二十八页，讲稿共五十二页哦 现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈Smear状态状态。M 1 2第二十九页，讲稿共五十二页哦1.1.模板不纯模板不纯2.2.BufferBuffer不合适不合适3.3.退火温度偏低退火温度偏低4.4.酶量过多酶量过多5.5.dNTPdNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高6.6.循环次数过多循环次数过多 原因原因1.1.纯化模板纯化模板2.2.更换更换BufferBuffer3.3.适当提高退火温度适当提高退火温度4.4.适量用酶适量用酶5.5.适当降低适当降低dNTPdNTP和和镁离子镁离子的浓的浓度度6.6.减少循环次数减少循环次数 对策对策第三十页，讲稿共五十二页哦靶序列或扩增产物靶序列或扩增产物 的交叉污染的交叉污染 原因原因1.1.开开管管轻轻柔柔，防防止止形形成成气气溶溶胶胶；防防止止靶靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外序列吸入加样枪内或溅出离心管外2.2.更换试剂、耗材更换试剂、耗材3.3.试剂分装，贮存适当。试剂分装，贮存适当。4.4.更换实验室和所有试剂耗材。更换实验室和所有试剂耗材。假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物对策对策第三十一页，讲稿共五十二页哦 PCR PCR中应注意的事项中应注意的事项（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照：阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板试剂对照：除模板外的所有组分第三十二页，讲稿共五十二页哦Real-time PCR技术介绍第三十三页，讲稿共五十二页哦实时荧光定量实时荧光定量PCR定义定义 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧光信，利用荧光信号累积号累积实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，最后通过标准进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法曲线对未知模板进行定量分析的方法 第三十四页，讲稿共五十二页哦实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 实时原理实时原理 常常 规规 PCRPCR技术：技术：对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终点产物终点产物进行定量和定性分析进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量实时定量PCRPCR技术：技术：利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增反应中扩增反应中每一每一个循环扩增产物量的变化个循环扩增产物量的变化，通过，通过CtCt值值和标准曲线的和标准曲线的分析对分析对起始模板起始模板进行进行定量分析定量分析第三十五页，讲稿共五十二页哦实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 定量原理定量原理介绍三个概念：介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、CtCt值值如何对起始模板定量？如何对起始模板定量？通过通过Ct值和标准曲线对值和标准曲线对起始模板起始模板进行定量分析进行定量分析第三十六页，讲稿共五十二页哦实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -扩增曲线扩增曲线扩增曲线图：扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件第三十七页，讲稿共五十二页哦实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -荧光荧光阈阈值值荧光信号荧光信号阈阈值值 （threshold threshold）：q 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值q 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍q 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99q 真正的信号:荧光信号超过域值第三十八页，讲稿共五十二页哦实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct-Ct值值CtCt值的定义值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)value 第三十九页，讲稿共五十二页哦实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct-Ct值的重现性值的重现性横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵纵轴轴：荧荧光光信信号号量量n相同模板在同一台相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图次扩增的扩增曲线图n终点处检测产物量不恒定，误差大；终点处检测产物量不恒定，误差大；Ct值则极具重现性值则极具重现性 n起点量是样本中原来的起点量是样本中原来的DNA量，更有意义；终点量经过量，更有意义；终点量经过PCR 放大，放大，并非研究所期望的数据并非研究所期望的数据第四十页，讲稿共五十二页哦非特异性荧光标记：非特异性荧光标记：1、SYBR Green 特异性荧光标记：特异性荧光标记：2、TaqMan 3、Molecular Beacon实时荧光定量实时荧光定量PCR的几种方法介绍的几种方法介绍第四十一页，讲稿共五十二页哦SYBR Green 法第四十二页，讲稿共五十二页哦SYBR Green 法q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位q SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光q 变性时，DNA双链分开，无荧光q 复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号（一般设置在复性阶段）。SYBR Green 第四十三页，讲稿共五十二页哦实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理5353SGNo EmissionSGSGSGExcitationExcitationSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitationExcitation第四十四页，讲稿共五十二页哦实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I SYBR Green I SYBR Green I 熔解曲线分析熔解曲线分析温度温度荧光强度荧光强度TmTm值：DNA解链一半时的温度第四十五页，讲稿共五十二页哦-TaqMan-TaqMan法法第四十六页，讲稿共五十二页哦与目标序列互补TaqMan-TaqMan-水解型杂交探针水解型杂交探针v 55端标记有报告基团端标记有报告基团(Reporter,R)(Reporter,R)，如，如FAMFAM、VICVIC等等 v 33端标记有荧光淬灭基团端标记有荧光淬灭基团 (Quencher,Q)(Quencher,Q)v 探针完整，探针完整，R R所发射的荧光能量被所发射的荧光能量被QQ基团吸收基团吸收 ，无荧光，无荧光，R R与与QQ分开，发荧光分开，发荧光 （荧光共振能量转移原理，（荧光共振能量转移原理，FRETFRET）v TaqTaq酶有酶有 5353外切核酸酶活性，可水解探针外切核酸酶活性，可水解探针第四十七页，讲稿共五十二页哦TaqManTaqMan法法 工作原理工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光第四十八页，讲稿共五十二页哦Texas Red,ROXTexas Red,ROXCY3.5,Redmond RedCY3.5,Redmond Red常用的荧光基团常用的荧光基团FAMFAMTET,VICTET,VICCY5CY5CY5.5,LC705CY5.5,LC705LC640LC640HEXHEXJOEJOECY3CY3TAMRATAMRA第四十九页，讲稿共五十二页哦实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 3 3 -Molecular beacon -Molecular beacon 法法(分子信标分子信标)第五十页，讲稿共五十二页哦标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素 淬灭剂发夹型杂交探针发夹型杂交探针第五十一页，讲稿共五十二页哦Molecular beacon(Molecular beacon(分子信标分子信标)工作原理工作原理q 荧光共振能量转移（荧光共振能量转移（FRETFRET）q 探针与探针与DNADNA杂交时产生荧光杂交时产生荧光 -延伸过程：不产生荧光延伸过程：不产生荧光 -退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号号第五十二页，讲稿共五十二页哦
