实验三蛋白质的等电点测定和沉淀反应精选PPT.ppt

关于实验三蛋白质的等电点测定和沉淀反应第1页，讲稿共15张，创作于星期日实验目的实验目的 1 1、了解蛋白质的两性解离性质。、了解蛋白质的两性解离性质。2 2、学习测定蛋白质等电点的一种方法。、学习测定蛋白质等电点的一种方法。3 3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。4 4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。5 5、了解蛋白质变性与沉淀的关系、了解蛋白质变性与沉淀的关系。第2页，讲稿共15张，创作于星期日实验原理实验原理（一）蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中（一）蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡：存在下列平衡：电场中移向阴极电场中移向阴极 不移动不移动 移向阳极移向阳极第3页，讲稿共15张，创作于星期日v蛋蛋白白质质的的等等电电点点:蛋蛋白白质质分分子子的的解解离离状状态态和和解解离离程程度度受受溶溶液液的的酸酸碱碱度度影影响响。当当溶溶液液的的pHpH达达到到一一定定数数值值时时，蛋蛋白白质质颗颗粒粒上上正正负负电电荷荷的的数数目目相相等等，在在电电场场中中，蛋蛋白白质质既既不不向向阴阴极极移移动动，也不向阳极移动，此时溶液的也不向阳极移动，此时溶液的pHpH值称为此种蛋白质的等电点。值称为此种蛋白质的等电点。不不同同蛋蛋白白质质各各有有特特异异的的等等电电点点。在在等等电电点点时时，蛋蛋白白质质的的理理化化性性质质都都有有变变化化，可可利利用用此此种种性性质质的的变变化化测测定定各各种种蛋蛋白白质质的的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pHpH值。值。第4页，讲稿共15张，创作于星期日 本本实实验验通通过过观观察察不不同同pHpH溶溶液液中中的的溶溶解解度度以以测测定定酪酪蛋蛋白白的的等等电电点点。用用醋醋酸酸与与醋醋酸酸钠钠（醋醋酸酸钠钠混混合合在在酪酪蛋蛋白白溶溶液液中中）配配制制各各种种不不同同pHpH值值的的缓缓冲冲液液。向向诸诸缓缓冲冲溶溶液液中中加加入入酪酪蛋蛋白白后后，沉沉淀淀出出现现最最多多的的缓缓冲冲液液的的pHpH值值即即为为酪酪蛋蛋白白的的等等电电点。点。第5页，讲稿共15张，创作于星期日（二）蛋白质的沉淀（二）蛋白质的沉淀 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类。蛋白质的沉淀反应可分为两类。（1 1）可逆的沉淀反应）可逆的沉淀反应 此时蛋白质分子的结构尚未发此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来溶剂中，并保持其天然性质而不变性。能溶解于原来溶剂中，并保持其天然性质而不变性。第6页，讲稿共15张，创作于星期日 （2 2）不可逆沉淀反应）不可逆沉淀反应 此时蛋白质分子内部结构发生重大此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固。蛋白质与重金属离子或某些有引起的蛋白质沉淀与凝固。蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。机酸的反应都属于此类。蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。第7页，讲稿共15张，创作于星期日 操作步骤操作步骤（一）酪蛋白等电点的测定（一）酪蛋白等电点的测定 1 1 取取同同样样规规格格的的试试管管4 4支支，按按下下表表顺顺序序分分别别精精确确地地加入各试剂，然后混匀加入各试剂，然后混匀;2 2 向向以以上上试试管管中中各各加加酪酪蛋蛋白白的的醋醋酸酸钠钠溶溶液液1mL1mL，加加一一管管，摇摇匀匀一一管管。此此时时1 1、2 2、3 3、4 4管管的的pHpH依依次次为为5.95.9、5.55.5、4.74.7、3.53.5。观观察察其其混混浊浊度度。静静置置1010分分钟钟后后，再再观观察其混浊度。最混浊的一管察其混浊度。最混浊的一管pHpH即为酪蛋白的等电点。即为酪蛋白的等电点。第8页，讲稿共15张，创作于星期日管号管号 蒸馏水蒸馏水（mLmL）0.01 mol/L0.01 mol/L醋酸醋酸(mL(mL）0.1 mol/L0.1 mol/L醋酸醋酸(mL)(mL)1.0 mol/L1.0 mol/L醋酸醋酸(mL)(mL)18.40.628.70.338.01.047.41.6第9页，讲稿共15张，创作于星期日（二）蛋白质的盐析（二）蛋白质的盐析 无机盐无机盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等)的浓溶液能析的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。由盐析获得的蛋白质则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。盐析作用是可逆过程。第10页，讲稿共15张，创作于星期日 加加蛋蛋白白质质溶溶液液5 5 mL于于试试管管中中，再再加加等等量量的的饱饱和和硫硫酸酸铵铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒倒出出少少量量混混浊浊沉沉淀淀，加加少少量量水水，观观察察是是否否溶溶解解，为什么？为什么？将将管管内内容容物物过过滤滤，向向滤滤液液中中添添加加硫硫酸酸铵铵粉粉末末到到不不再溶解为止。此时析出沉淀为清蛋白。再溶解为止。此时析出沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。第11页，讲稿共15张，创作于星期日（三）重金属离子沉淀蛋白质（三）重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。取合物。取1 1支试管，加入蛋白质溶液支试管，加入蛋白质溶液2 mL2 mL，再加，再加3%3%硝酸银溶液硝酸银溶液1212滴，振荡试管，有沉淀产生。滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？沉淀是否溶解？为什么？第12页，讲稿共15张，创作于星期日（四）某些有机酸沉淀蛋白质（四）某些有机酸沉淀蛋白质 取取1 1支试管，加入蛋白质溶液支试管，加入蛋白质溶液2mL2mL，再加，再加入入1 ml 5%1 ml 5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放淀的生成。放 置片刻倾出清液，向沉淀中加置片刻倾出清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。入少量水，观察沉淀是否溶解。第13页，讲稿共15张，创作于星期日（五）有机溶剂沉淀蛋白质（五）有机溶剂沉淀蛋白质 取取1 1支支试试管管，加加入入2mL2mL蛋蛋白白质质溶溶液液,再再加加入入2 2 mL95%mL95%乙乙醇醇。观观察察沉沉淀淀的的生生成成(如如果果沉沉淀不明显，加点淀不明显，加点NaClNaCl，混匀，混匀)。第14页，讲稿共15张，创作于星期日感谢大家观看第15页，讲稿共15张，创作于星期日