基因定位常用的方法精选PPT.ppt

关于基因定位常用的方法1 1第1页，讲稿共34张，创作于星期日2 2 明确几个基本概念明确几个基本概念基基 因因：DNADNA的功能片段。的功能片段。基因组基因组：有机体全部：有机体全部DNADNA序列（它包括基因序列（它包括基因 外的非基因外的非基因DNADNA序列），它是基因和序列），它是基因和 非基因非基因DNADNA序列的总和。序列的总和。基因定位基因定位：是用一定的方法将基因确定到染是用一定的方法将基因确定到染 色体的实际位置。色体的实际位置。第2页，讲稿共34张，创作于星期日3 3l l遗传做图遗传做图遗传做图遗传做图：是以研究家族的减数分裂，以了解两个基因：是以研究家族的减数分裂，以了解两个基因：是以研究家族的减数分裂，以了解两个基因：是以研究家族的减数分裂，以了解两个基因分离趋势为基础来绘制基因座位间的距离，它表明基因之分离趋势为基础来绘制基因座位间的距离，它表明基因之分离趋势为基础来绘制基因座位间的距离，它表明基因之分离趋势为基础来绘制基因座位间的距离，它表明基因之间连锁关系和相对距离，并以重组率来计算和表示，以厘间连锁关系和相对距离，并以重组率来计算和表示，以厘间连锁关系和相对距离，并以重组率来计算和表示，以厘间连锁关系和相对距离，并以重组率来计算和表示，以厘摩（摩（摩（摩（cMcMcMcM）为单位。）为单位。）为单位。）为单位。l l染色体定位：染色体定位：染色体定位：染色体定位：只把基因定位到某条染色体上。只把基因定位到某条染色体上。只把基因定位到某条染色体上。只把基因定位到某条染色体上。细胞水平上的基因图又称细胞水平上的基因图又称细胞水平上的基因图又称细胞水平上的基因图又称细胞遗传图细胞遗传图细胞遗传图细胞遗传图l l区域定位：区域定位：从细胞遗传学水平，用染色体显带等技从细胞遗传学水平，用染色体显带等技术在光学显微镜下观察，将基因定位到染色体的具术在光学显微镜下观察，将基因定位到染色体的具体区带。体区带。第3页，讲稿共34张，创作于星期日4 4一、基因定位的方法一、基因定位的方法l l1、体细胞杂交法基因定位：、体细胞杂交法基因定位：体细胞体细胞：即生物体除生殖细胞外的任一细：即生物体除生殖细胞外的任一细 胞。胞。1 1）体细胞杂交）体细胞杂交的概念：的概念：也称细胞融合（也称细胞融合（cell infusioncell infusion），是将来），是将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。新产源不同的两种细胞融合成一个新细胞。新产生的细胞称杂种细胞（生的细胞称杂种细胞（hybrid cellhybrid cell），含双），含双亲不同的染色体。亲不同的染色体。第4页，讲稿共34张，创作于星期日5 5 2 2）对象）对象：人的细胞人的细胞 鼠类：大鼠、小鼠、仓鼠鼠类：大鼠、小鼠、仓鼠 3 3）杂种细胞的特点：）杂种细胞的特点：在繁殖传代过程中，人的染色体优先丢失，在繁殖传代过程中，人的染色体优先丢失，以至最后只剩几条或一条人的染色体，而啮齿以至最后只剩几条或一条人的染色体，而啮齿类的染色体被保留下来。类的染色体被保留下来。第5页，讲稿共34张，创作于星期日6 6l l4 4）原理：）原理：细胞进行融合时，培养液中只有部分细细胞进行融合时，培养液中只有部分细胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的双亲胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的双亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。为细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。为此要此要创造一种只让杂种细胞生长繁殖而亲本细胞创造一种只让杂种细胞生长繁殖而亲本细胞死亡的环境死亡的环境。这就要利用杂种细胞和亲本细胞对。这就要利用杂种细胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的差异来进行选择。其中生长条件的要求和代谢的差异来进行选择。其中最常用的是最常用的是HATHAT选择系统选择系统。第6页，讲稿共34张，创作于星期日7 7HATHAT选择系统：选择系统：人的突变细胞株人的突变细胞株人的突变细胞株人的突变细胞株：缺乏：缺乏：缺乏：缺乏HGPRTHGPRTHGPRTHGPRT酶酶酶酶 小鼠细胞株小鼠细胞株：缺乏：缺乏：缺乏：缺乏TKTK酶酶酶酶 两者融合培养于两者融合培养于HATHATHATHAT培养基中培养基中培养基中培养基中 HATHAT培养基：培养基：H H为次黄嘌呤，是为次黄嘌呤，是HGPRTHGPRTHGPRTHGPRT的底物，为的底物，为的底物，为的底物，为DNADNA合成提供原合成提供原合成提供原合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）料（核苷酸旁路合成原料）料（核苷酸旁路合成原料）料（核苷酸旁路合成原料）A A A A可阻断正常的可阻断正常的DNADNADNADNA合成（嘌呤及合成（嘌呤及合成（嘌呤及合成（嘌呤及TMPTMPTMPTMP合成受抑制）合成受抑制）T T T T在胸苷激酶（在胸苷激酶（在胸苷激酶（在胸苷激酶（TKTK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为为DNADNA合成提供原料合成提供原料合成提供原料合成提供原料第7页，讲稿共34张，创作于星期日8 8因此在因此在HATHAT培养基上培养基上l l 人细胞：人细胞：由于由于A A的存在，正常的的存在，正常的DNA DNA 合成通路受阻合成通路受阻 。同时由于同时由于HGPRTHGPRT的缺乏，无法利用次黄嘌呤的缺乏，无法利用次黄嘌呤通过旁路合成通过旁路合成DNADNA（嘌呤合成障碍）嘌呤合成障碍）第8页，讲稿共34张，创作于星期日9 9l l鼠细胞鼠细胞：由于：由于A A的存在正常的的存在正常的DNADNA合成通道受合成通道受阻，有阻，有HGPRTHGPRT可以利用次黄嘌呤合成腺嘌呤，可以利用次黄嘌呤合成腺嘌呤，鸟嘌呤，但由于无鸟嘌呤，但由于无TKTK，无法合成胸腺嘧啶。，无法合成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障碍（嘧啶合成障碍 ）杂种细胞杂种细胞：有：有HGPRTHGPRT旁路合成腺嘌呤旁路合成腺嘌呤,鸟嘌呤；鸟嘌呤；并可以利用并可以利用TKTK合成胸腺嘧啶（嘌呤和嘧啶合成胸腺嘧啶（嘌呤和嘧啶都可以正常合成）都可以正常合成）第9页，讲稿共34张，创作于星期日1010l l 将筛选出来的杂种细胞转移到正常培养基继将筛选出来的杂种细胞转移到正常培养基继续培养，续培养，由于人和鼠都有各自不同的生化和免由于人和鼠都有各自不同的生化和免疫学特性疫学特性，MillerMiller等运用体细胞杂交并结合等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种细胞的存活需杂种细胞的特征，证明杂种细胞的存活需要胸苷激酶（要胸苷激酶（TKTK）。凡是含有人）。凡是含有人1717号染色体号染色体的杂种细胞都因有的杂种细胞都因有TKTK活性而存活，反之则死活性而存活，反之则死亡，从而推断亡，从而推断TKTK基因定位于基因定位于1717号染色体上，号染色体上，这是首例应用体细胞杂交法进行的基因定位。这是首例应用体细胞杂交法进行的基因定位。第10页，讲稿共34张，创作于星期日1111第11页，讲稿共34张，创作于星期日1212l l克隆嵌板法克隆嵌板法克隆嵌板法克隆嵌板法(clone panel method)(clone panel method)(clone panel method)(clone panel method)根据不同杂种细胞保留或丢失的人染色体有时是根据不同杂种细胞保留或丢失的人染色体有时是根据不同杂种细胞保留或丢失的人染色体有时是根据不同杂种细胞保留或丢失的人染色体有时是重叠的情况重叠的情况重叠的情况重叠的情况,设计的一种简便而实用的基因定位方法。设计的一种简便而实用的基因定位方法。设计的一种简便而实用的基因定位方法。设计的一种简便而实用的基因定位方法。克隆嵌板克隆嵌板克隆嵌板克隆嵌板 杂种克隆杂种克隆杂种克隆杂种克隆 保留的人染色体保留的人染色体保留的人染色体保留的人染色体 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 A +-A +-A +-A +-B +-+-B +-+-B +-+-B +-+-C +-+-+-+-C +-+-+-+-C +-+-+-+-C +-+-+-+-第12页，讲稿共34张，创作于星期日13132.2.原位杂交和荧光原位杂交原位杂交和荧光原位杂交 1 1 1 1）原位杂交（）原位杂交（）原位杂交（）原位杂交（in situ hybridizationin situ hybridizationin situ hybridizationin situ hybridization）：是最直接）：是最直接）：是最直接）：是最直接的基因定位方法之一，是分子生物学技术在基因定位中的的基因定位方法之一，是分子生物学技术在基因定位中的的基因定位方法之一，是分子生物学技术在基因定位中的的基因定位方法之一，是分子生物学技术在基因定位中的应用，胰岛素基因用此方法定位于应用，胰岛素基因用此方法定位于应用，胰岛素基因用此方法定位于应用，胰岛素基因用此方法定位于11p1511p1511p1511p15。2 2 2 2）原理：碱基的互补配对，同源的）原理：碱基的互补配对，同源的）原理：碱基的互补配对，同源的）原理：碱基的互补配对，同源的DNA-DNADNA-DNADNA-DNADNA-DNA双链或双链或双链或双链或DNA-DNA-DNA-DNA-RNARNARNARNA双链在一定条件下能结合成双链。用放射性或非放双链在一定条件下能结合成双链。用放射性或非放双链在一定条件下能结合成双链。用放射性或非放双链在一定条件下能结合成双链。用放射性或非放射性物质标记的射性物质标记的射性物质标记的射性物质标记的DNADNADNADNA、RNARNA或与或与或与或与mRNAmRNAmRNAmRNA互补的互补的互补的互补的cDNAcDNA作探针，作探针，可检测细胞基因组中的同源部分。可检测细胞基因组中的同源部分。第13页，讲稿共34张，创作于星期日14143 3）原位杂交的特点：）原位杂交的特点：杂交在载玻片上的中期染色体上进行，杂交在载玻片上的中期染色体上进行，而不是在溶液和膜上进行。所谓原位是指在而不是在溶液和膜上进行。所谓原位是指在标本上标本上DNADNA原位变性，再与放射性或非放射原位变性，再与放射性或非放射性物质（通常用性物质（通常用3H3H）标记的已知核酸探针杂交，）标记的已知核酸探针杂交，通过放射自显影来检测染色体上特异通过放射自显影来检测染色体上特异DNADNA或或RNARNA顺顺序，用放射性颗粒在某条染色体的区带出现的序，用放射性颗粒在某条染色体的区带出现的最高频率或荧光的强度来确定探针的位置，从最高频率或荧光的强度来确定探针的位置，从而准确地进行基因定位。而准确地进行基因定位。第14页，讲稿共34张，创作于星期日15154 4）原位杂交的步骤）原位杂交的步骤 制备中期染色体制备中期染色体制备中期染色体制备中期染色体 DNADNADNADNA原位变性原位变性原位变性原位变性 变性变性变性变性 放射性或非放射性标记探针放射性或非放射性标记探针放射性或非放射性标记探针放射性或非放射性标记探针 杂交（在载玻片上）杂交（在载玻片上）杂交（在载玻片上）杂交（在载玻片上）洗膜洗膜洗膜洗膜 放射性标记：放射自显影放射性标记：放射自显影放射性标记：放射自显影放射性标记：放射自显影 检测检测检测检测 非放射性标记：荧光染料与抗体或蛋白结合非放射性标记：荧光染料与抗体或蛋白结合非放射性标记：荧光染料与抗体或蛋白结合非放射性标记：荧光染料与抗体或蛋白结合 记录杂交信号记录杂交信号记录杂交信号记录杂交信号 结合染色体形态进行基因定位结合染色体形态进行基因定位结合染色体形态进行基因定位结合染色体形态进行基因定位第15页，讲稿共34张，创作于星期日16165 5）荧光原位杂交）荧光原位杂交（florescence in situ hybridizationflorescence in situ hybridization，FISHFISHFISHFISH）l l 用用特特殊殊荧荧光光素素（digdigdigdig或或BiotinBiotin）标标标标记记记记探探探探针针针针DNADNA（Nick Nick Nick Nick translation translation translation translation 标标标标记记记记法法法法），变变变变性性性性成成成成单单单单链链链链后后后后与与与与变变变变性性性性后后后后的的的的染染染染色色色色体体体体或或或或细细细细胞胞胞胞核核核核靶靶靶靶DNADNADNADNA杂杂杂杂交交交交。在在在在荧荧荧荧光光光光显显显显微微微微镜镜镜镜下下下下观察并记录结果。观察并记录结果。观察并记录结果。观察并记录结果。FISHFISH优点：优点：优点：优点：可用来作基因或特定可用来作基因或特定可用来作基因或特定可用来作基因或特定DNADNA片段的染色体区片段的染色体区 域定位。域定位。域定位。域定位。缺点：缺点：缺点：缺点：必须在已知探针的情况下方可进行。必须在已知探针的情况下方可进行。必须在已知探针的情况下方可进行。必须在已知探针的情况下方可进行。第16页，讲稿共34张，创作于星期日1717单色单色FISHFISH第17页，讲稿共34张，创作于星期日1818 多色多色FISHFISH第18页，讲稿共34张，创作于星期日19193.3.连锁分析（连锁分析（Linkage analysisLinkage analysis）1 1）概念：）概念：基因定位的连锁分析是根据基因在染色体基因定位的连锁分析是根据基因在染色体上呈直线排列，不同基因相互连锁成连锁群的上呈直线排列，不同基因相互连锁成连锁群的原理，即应用被定位的基因与同一染色体上另原理，即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位。一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位。第19页，讲稿共34张，创作于星期日20202 2）重组值（重组值（recombination fractionrecombination fraction）是基因定位时两个基因间遗传图距的量度，是基因定位时两个基因间遗传图距的量度，即基因间的遗传距离。如果两个基因间有即基因间的遗传距离。如果两个基因间有1%1%的重的重组值，其遗传图的距离为组值，其遗传图的距离为1 1厘摩。厘摩。（centimorgancentimorgan，cMcM）3 3）遗传标记（遗传标记（genetic markergenetic marker）用连锁分析发法进行基因定位需要已知的记用连锁分析发法进行基因定位需要已知的记忆内作为遗传标记，这些标记按孟德尔方式遗传，忆内作为遗传标记，这些标记按孟德尔方式遗传，标记位点应是多态的。标记位点应是多态的。第20页，讲稿共34张，创作于星期日2121第21页，讲稿共34张，创作于星期日2222致病基因和标记座的连锁致病基因和标记座的连锁第22页，讲稿共34张，创作于星期日2323l l遗传多态性：遗传多态性：遗传多态性：遗传多态性：是指在一个遗传座位上具有一个以上的是指在一个遗传座位上具有一个以上的是指在一个遗传座位上具有一个以上的是指在一个遗传座位上具有一个以上的等位基因，且各个等位基因在群体中出现的频率皆高于等位基因，且各个等位基因在群体中出现的频率皆高于等位基因，且各个等位基因在群体中出现的频率皆高于等位基因，且各个等位基因在群体中出现的频率皆高于1%1%1%1%。l l常用的遗传标记：常用的遗传标记：常用的遗传标记：常用的遗传标记：ABOABOABOABO血型血型血型血型蛋白多态蛋白多态蛋白多态蛋白多态 血清蛋白泳动学改变血清蛋白泳动学改变血清蛋白泳动学改变血清蛋白泳动学改变 HLAHLAHLAHLA RFLP RFLP 小卫星小卫星小卫星小卫星DNADNADNADNA：VNTR 6-12VNTR 6-12VNTR 6-12VNTR 6-12个核苷酸个核苷酸个核苷酸个核苷酸DNADNADNADNA多态多态多态多态 VNTR VNTR VNTR VNTR 微卫星微卫星微卫星微卫星DNADNADNADNA：STR2-6STR2-6STR2-6STR2-6个的个的个的个的VNTRVNTRVNTRVNTR SNPs SNPs SNPs SNPs第23页，讲稿共34张，创作于星期日2424 二、基因克隆二、基因克隆 致病基因克隆有两种基本策略致病基因克隆有两种基本策略致病基因克隆有两种基本策略致病基因克隆有两种基本策略 功能克隆功能克隆功能克隆功能克隆 定位克隆定位克隆定位克隆定位克隆 1 1、功能克隆、功能克隆、功能克隆、功能克隆(functional cloning)(functional cloning)(functional cloning)(functional cloning)是利用疾病已知的遗传损伤而引起的生化功能如蛋是利用疾病已知的遗传损伤而引起的生化功能如蛋是利用疾病已知的遗传损伤而引起的生化功能如蛋是利用疾病已知的遗传损伤而引起的生化功能如蛋白质氨基酸缺陷的信息白质氨基酸缺陷的信息白质氨基酸缺陷的信息白质氨基酸缺陷的信息,进行基因定位进行基因定位进行基因定位进行基因定位,进而克隆该基进而克隆该基进而克隆该基进而克隆该基因因因因.第24页，讲稿共34张，创作于星期日2525 2 2、定位克隆、定位克隆(positional cloning)(positional cloning)是先进行基因定位作图是先进行基因定位作图,然后找到来自该然后找到来自该定位区的基因并进行克隆定位区的基因并进行克隆,在此之后才能明确在此之后才能明确该基因的功能该基因的功能.功能克隆和定位克隆的比较功能克隆和定位克隆的比较:在传统的功能克隆中在传统的功能克隆中,基因功能的研究先于基因功能的研究先于基因鉴定基因鉴定.在定位克隆中在定位克隆中,基因定位在先基因定位在先,最后最后再鉴定基因再鉴定基因.基因已鉴定后基因已鉴定后,可以进行基因功能可以进行基因功能的选择性研究的选择性研究.第25页，讲稿共34张，创作于星期日2626第26页，讲稿共34张，创作于星期日2727 定位克隆鉴定的第一批基因利用了定位克隆鉴定的第一批基因利用了特定基因座的染色体畸变，特定基因座的染色体畸变，DuchenneDuchenne肌营养不良肌营养不良(DMD)(DMD)基因的克隆是一个重基因的克隆是一个重要的例子。要的例子。第27页，讲稿共34张，创作于星期日2828假肥大型肌营养不良症假肥大型肌营养不良症(DMD/BMD)(DMD/BMD)l l 由于抗肌萎缩蛋白由于抗肌萎缩蛋白(dystrophin)(dystrophin)遗传性缺陷遗传性缺陷所致的进行性肌萎缩的致死性神经肌肉性遗传所致的进行性肌萎缩的致死性神经肌肉性遗传病病,发病率为发病率为1/35001/3500，XRXR遗传遗传。l l 主要症状主要症状:通常通常3-53-5岁发病岁发病,开始走路不稳开始走路不稳,鸭型步态鸭型步态,上楼梯困难上楼梯困难,Gower,Gower征阳性征阳性.进行性肌进行性肌萎缩伴有腓肠肌假性肥大萎缩伴有腓肠肌假性肥大,10,10多岁下肢瘫多岁下肢瘫,一般一般在在2020多岁之前死于心衰或呼吸衰竭多岁之前死于心衰或呼吸衰竭.第28页，讲稿共34张，创作于星期日2929DMDDMD基因克隆的方法基因克隆的方法l l 研究者们通过对几个女性患者的细胞遗传研究者们通过对几个女性患者的细胞遗传学研究发现每个病例受累的常染色体不同但学研究发现每个病例受累的常染色体不同但在在X X染色体上的断裂点总是染色体上的断裂点总是p21p21。l l 同时一个无任何遗传缺陷家族史的男孩被发现同时一个无任何遗传缺陷家族史的男孩被发现患有患有DMDDMD等等4 4种种X X连锁隐性遗传病，在这个独一无连锁隐性遗传病，在这个独一无二个体的引发下，经过仔细的遗传学研究，最二个体的引发下，经过仔细的遗传学研究，最终发现了终发现了Xp21.1Xp21.1的微小缺失。的微小缺失。第29页，讲稿共34张，创作于星期日3030DMDDMD女性患者的核型女性患者的核型第30页，讲稿共34张，创作于星期日3131X X X X染色体与常染色体易位时染色体与常染色体易位时染色体与常染色体易位时染色体与常染色体易位时X X X X染色体失活的结果染色体失活的结果染色体失活的结果染色体失活的结果第31页，讲稿共34张，创作于星期日3232l l两个研究小组分别采用两种不同的方法克两个研究小组分别采用两种不同的方法克隆了隆了DMDDMD基因：基因：一组是通过一组是通过X X常染色体易位，克隆了该基因的常染色体易位，克隆了该基因的一部分。一部分。另一研究组使用有另一研究组使用有Xp21.1Xp21.1微小缺失的男孩的微小缺失的男孩的DNADNA，利用消减技术，获得了在正常，利用消减技术，获得了在正常X X染色体染色体存在而在这个男孩存在而在这个男孩DNADNA中缺乏的中缺乏的DNADNA克隆片段。克隆片段。第32页，讲稿共34张，创作于星期日3333一名患有一名患有DMDDMD等等4 4种种X X连锁隐性遗传病的男孩存在连锁隐性遗传病的男孩存在Xp21.2Xp21.2的微小臂内缺失的微小臂内缺失第33页，讲稿共34张，创作于星期日感谢大家观看第34页，讲稿共34张，创作于星期日