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第二章基因操作的工具酶第1页，本讲稿共65页基因工程基因工程第一章第一章 导导 论论第二章第二章 基因操作的工具酶基因操作的工具酶第三章第三章 基因克隆的载体基因克隆的载体第四章第四章 基因克隆的策略基因克隆的策略第五章第五章 克隆基因的表达克隆基因的表达第六章第六章 基因工程的基本技术基因工程的基本技术第2页，本讲稿共65页第二章第二章 基因操作的工具酶基因操作的工具酶第一节第一节 限制性核酸内切酶及其应用限制性核酸内切酶及其应用第二节第二节 DNA连接酶及其应用连接酶及其应用第三节第三节 DNA聚合酶及其应用聚合酶及其应用第四节第四节 修饰性工具酶修饰性工具酶Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled enzymology.A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer.第3页，本讲稿共65页1、限制性核酸内切酶的发现、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类合命名、限制性核酸内切酶的分类合命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应、限制性核酸内切酶的消化反应第一节第一节 限制性核酸内切酶及其应用限制性核酸内切酶及其应用第4页，本讲稿共65页50年代初发现了由寄主控制的年代初发现了由寄主控制的限制和修饰现象限制和修饰现象(B)(K)大肠杆菌大肠杆菌B大肠杆菌大肠杆菌K11410 410 4E.O.P 成斑率成斑率efficiency of plating第5页，本讲稿共65页限制限制修饰的酶学假说修饰的酶学假说(B)(B)酶切位点酶切位点不被修饰不被修饰噬菌体噬菌体DNA被切割被切割酶切位点酶切位点被修饰被修饰Methylation基因组基因组DNA不被切割不被切割1968年，年，Meselson 和和Yuan从大肠杆菌从大肠杆菌K和和B中发现了中发现了I型限制性核酸内切酶；型限制性核酸内切酶；1970年，年，Smith和和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核型限制性核 酸内切酶酸内切酶Hind II，使得，使得DNA分子的体外精确切割成为可能。分子的体外精确切割成为可能。第6页，本讲稿共65页1、限制性核酸内切酶的发现、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类合命名、限制性核酸内切酶的分类合命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应、限制性核酸内切酶的消化反应第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第7页，本讲稿共65页限制性核酸内切酶的概念限制性核酸内切酶的概念 限制性核酸内切酶（限制性核酸内切酶（限制性核酸内切酶（限制性核酸内切酶（Restriction endonucleases Restriction endonucleases）：）：）：）：是一是一是一是一类能够识别双链类能够识别双链类能够识别双链类能够识别双链DNADNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精分子中某种特定的核苷酸序列，并能精分子中某种特定的核苷酸序列，并能精分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链确特异地切割双链确特异地切割双链确特异地切割双链DNADNA分子的核酸内切酶。分子的核酸内切酶。分子的核酸内切酶。分子的核酸内切酶。已经从近已经从近300中微中微生物中分离出了生物中分离出了500余种限制性核酸内切酶。余种限制性核酸内切酶。第8页，本讲稿共65页限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶的分类1.限制修饰活性限制修饰活性2.内切酶的蛋白内切酶的蛋白 质结构质结构3.限制辅助因子限制辅助因子4.切割位点切割位点5.特异性切割特异性切割6.基因克隆中基因克隆中 I 型型单一多功能的酶单一多功能的酶3种不同亚基种不同亚基ATP、Mg2+和和S-腺腺苷甲硫氨酸苷甲硫氨酸距特异性位点距特异性位点1000bp不是不是无用无用 II 型型限制酶和修饰酶分开限制酶和修饰酶分开单一成分单一成分Mg2+特异性位点及其附近特异性位点及其附近是是非常有用非常有用 III 型型双功能酶双功能酶2种亚基种亚基ATP、Mg2+和和S-腺腺苷甲硫氨酸苷甲硫氨酸特异性位点特异性位点3端端24-26bp处处是是有用有用第9页，本讲稿共65页限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体个斜体 字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli 表示为表示为Eco,流感嗜血菌流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为表示为 Hin；2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind；3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则 用罗马数字标出，比如用罗马数字标出，比如Eco R I、Hind III。第10页，本讲稿共65页1、限制性核酸内切酶的发现、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类合命名、限制性核酸内切酶的分类合命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应、限制性核酸内切酶的消化反应第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第11页，本讲稿共65页IIII型限制性核酸内切酶的型限制性核酸内切酶的3 3大特点大特点1、识别位点的特异性、识别位点的特异性 每种酶都有其特定的每种酶都有其特定的DNA识别识别 位点，通常是由位点，通常是由4、5、6或或7个核苷酸组成的特定序个核苷酸组成的特定序 列（靶序列）。列（靶序列）。2、识别序列的对称性、识别序列的对称性 靶序列通常具有双重旋转对称靶序列通常具有双重旋转对称 的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性、切割位点的规范性 双链双链DNA被酶切后，分布在两被酶切后，分布在两 条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平 末端的末端的DNA分子）。分子）。第12页，本讲稿共65页EcoR IEcoR I 5-G 5-GAATTCAATTC-3-3 3-3-CTTAACTTAAGG-5-5 Pst IPst I 5-CTGCA 5-CTGCAGG-3-3 3-G 3-GACGTCACGTC-5-5 产生粘性末端产生粘性末端产生粘性末端产生粘性末端EcoR VEcoR V 5-5-GATGATATCATC-3-3 3-3-CTACTATAGTAG-5-5 产生平齐末端产生平齐末端产生平齐末端产生平齐末端切割位点切割位点切割位点切割位点切开切开双链双链DNA。形成。形成粘性末端粘性末端（sticky end）或或平齐末端平齐末端（blunt end）。如：）。如：识别位点处。识别位点处。第13页，本讲稿共65页与与II型核酸内切酶有关的几个概念型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端粘性末端 cohesive ends 因酶切位点在两条因酶切位点在两条DNADNA单链上不同（对称）酶切后形单链上不同（对称）酶切后形 成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很 容易容易通过互补碱基的配对而重新通过互补碱基的配对而重新连接连接起来。起来。平平 末末 端端 Blunt end Blunt end 因酶切位点在两条因酶切位点在两条DNADNA单链上相同，酶切后形成的平齐单链上相同，酶切后形成的平齐 的末端结构，这种末端的末端结构，这种末端不易不易重新重新连接连接起来。起来。同裂酶同裂酶 isoschizomers isoschizomers 能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同内切酶。能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同内切酶。同尾酶同尾酶 isocaudamers isocaudamers 识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一 类限制性核酸内切酶。类限制性核酸内切酶。注注 意：意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶 消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的 任一种所识别。任一种所识别。第14页，本讲稿共65页粘性末端（粘性末端（sticky ends，cohensive ends）含有几个核苷酸含有几个核苷酸单链单链的末端。的末端。分两种类型：分两种类型：5端凸出（如端凸出（如EcoR I切点）切点）GAATTC CTTAA G G AATTC CTTAAG5-3 3-5 5-3 3-5 第15页，本讲稿共65页CTGCAG 3端凸出（如端凸出（如端凸出（如端凸出（如Pst IPst I切点）切点）GACGTC 5-3 3-5 5-3 3-5 CTGCA G G ACGTC 第16页，本讲稿共65页几种几种IIII型限制性核酸内切酶的酶切位点型限制性核酸内切酶的酶切位点Pst IProvindencia stuartii 164 CTGCAGGACGTCHaemophilus influenzae Rd 第17页，本讲稿共65页 经同尾酶消化的经同尾酶消化的DNADNA末端连接示意图末端连接示意图5 XXXXGGATCCXXXXXX 33 XXXXCCTAGGXXXXXX 5BamH I5 XXXXG GATCCXXXXXX 3 3 XXXXCCTAG GXXXXXX 55 XXXXAGATCTXXXXXX 33 XXXXTCTAGAXXXXXX 5Bgl II5 XXXXA GATCTXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG AXXXXXX 55 XXXXA GATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG GXXXXXX 55 XXXXAGATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAGGXXXXXX 5BamH IBgl II第18页，本讲稿共65页 推测酶切割位点出现的频率对于推断推测酶切割位点出现的频率对于推断DNA酶切片段大小很有用。酶切片段大小很有用。假定假定4种核苷种核苷酸在酸在DNA分子上出现的频率相同，那么靶序列为分子上出现的频率相同，那么靶序列为6个核苷酸的内切酶在每个核苷酸的内切酶在每46（=4096）个核苷酸个核苷酸中酶切位点就有一次出现机会。据此推算，一条中酶切位点就有一次出现机会。据此推算，一条4900bp长的长的DNA中有中有12个个6核苷酸识别序核苷酸识别序列的酶切位点（列的酶切位点（49000/4096）。但事实上并非真正如此，因为）。但事实上并非真正如此，因为DNA分子中分子中4种碱基的出现频种碱基的出现频率并不均等。率并不均等。识别位点在识别位点在DNA分子上出现的频率分子上出现的频率第19页，本讲稿共65页1、限制性核酸内切酶的发现、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类合命名、限制性核酸内切酶的分类合命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应、限制性核酸内切酶的消化反应第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第20页，本讲稿共65页 一个酶单位一个酶单位（U）指：指：在理想的反应条件（适宜的缓冲在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为液和反应温度，通常为37）下，）下，50 L反应体系中完全反应体系中完全降解降解1 g DNA所需要的酶量。所需要的酶量。影响酶活性的因素很多，最重要的有：影响酶活性的因素很多，最重要的有：A。DNA的纯度和甲基化程度的纯度和甲基化程度B。甘油的含量（不超过甘油的含量（不超过5%）C。反应体系中的离子强度反应体系中的离子强度D。反应体系的反应体系的pH值值F。反应的温度条件反应的温度条件 （通常为（通常为37）酶单位的定义和影响酶活性的因素酶单位的定义和影响酶活性的因素Buffer(10X)2.0 LWater 16.5 LDNA 1.0 LEnzyme 0.5 LVolume 20.0 L 第21页，本讲稿共65页酶酶 切切 反反 应应 的的 基基 本本 步步 骤骤电泳紫外分析37 1h加反应液CKMBuffer(10X)2.0 LWater 16.5 LDNA 1.0 LEnzyme 0.5 LVolume 20.0 L 1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT第22页，本讲稿共65页第二章第二章 基因操作的工具酶基因操作的工具酶第一节第一节 限制性核酸内切酶及其应用限制性核酸内切酶及其应用第二节第二节 DNA连接酶及其应用连接酶及其应用第三节第三节 DNA聚合酶及其应用聚合酶及其应用第四节第四节 修饰性工具酶修饰性工具酶Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled enzymology.A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer.第23页，本讲稿共65页1、DNA连接酶作用的特点连接酶作用的特点2、DNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件3、DNA连接的策略连接的策略第二节第二节 DNA连接酶及其应用连接酶及其应用第24页，本讲稿共65页DNA连接酶的发现连接酶的发现 环形环形DNADNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种NickNick的酶存在。的酶存在。1967 1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化在年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2 2条条 DNA DNA链之间形成链之间形成磷酸二酯键磷酸二酯键的酶的酶DNADNA连接酶（连接酶（ligaseligase）。DNA连接酶连接酶 由大肠杆菌基因组由大肠杆菌基因组DNA编码，以编码，以NAD+作为能源辅助因子作为能源辅助因子；T4DNA连接酶连接酶 由大肠杆菌由大肠杆菌T4噬菌体噬菌体DNA编码，以编码，以ATP作为能源辅助因子。作为能源辅助因子。（1970年）年）容易制备，而且可以连接完全配对的平末端容易制备，而且可以连接完全配对的平末端DNA分子，所分子，所 以在基因克隆中应用广泛。以在基因克隆中应用广泛。NickNick第25页，本讲稿共65页DNA连接酶作用的特点连接酶作用的特点A.A.连接的两条链必须分别具有连接的两条链必须分别具有 3 3端自由羟基（端自由羟基（-OH-OH）和和5 5 端磷酸基团（端磷酸基团（-P-P），而且只有这两个基团彼），而且只有这两个基团彼 此相邻时才能进行连接反应；此相邻时才能进行连接反应；B.B.在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过 程，因此连接反应必须有能量分子的参与，通常有程，因此连接反应必须有能量分子的参与，通常有 两种能量分子，即两种能量分子，即ATPATP和和NAD+NAD+。OKNO第26页，本讲稿共65页载体去磷防止自连的应用示例载体去磷防止自连的应用示例POHPOHOHOHOHOHPOHPOHOHOHOHOH连接酶连接酶连接酶连接酶连接酶连接酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶2Pi寄主修复缺口寄主修复缺口载体自连或产载体自连或产生二具体等生二具体等第27页，本讲稿共65页1、DNA连接酶作用的机理连接酶作用的机理2、DNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件3、DNA连接的策略连接的策略第二节第二节 DNA连接酶及其应用连接酶及其应用第28页，本讲稿共65页DNA连接反应的条件连接反应的条件 连接反应最佳温度为连接反应最佳温度为3737，但是此时粘性末端间氢键结合不，但是此时粘性末端间氢键结合不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，EcoRI EcoRI 粘性末端连接粘性末端连接部位只有部位只有4 4个碱基对，很容易断开。所以个碱基对，很容易断开。所以通常在通常在4-154-15连接。连接。影响连接效率的因素有：影响连接效率的因素有：A.A.温度（最主要的因素）温度（最主要的因素）B.ATPB.ATP的浓度的浓度(10 M-1 M)C.C.连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）D.D.反应时间（通常连接过夜）反应时间（通常连接过夜）E.E.插入片段和载体片段插入片段和载体片段 的摩尔比的摩尔比转化4 过夜加反应液CK-重组菌落重组菌落CK+第29页，本讲稿共65页1、DNA连接酶作用的机理连接酶作用的机理2、DNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件3、DNA连接的策略连接的策略第二节第二节 DNA连接酶及其应用连接酶及其应用第30页，本讲稿共65页粘性末端粘性末端DNA片段的连接片段的连接NickNick第31页，本讲稿共65页平末端平末端DNA片段的末端加尾连接法片段的末端加尾连接法33553355末端核苷酸转移酶末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP33553355AAAAATTTTDNADNA聚合酶聚合酶和和T4DNAT4DNA连接酶连接酶第32页，本讲稿共65页平末端平末端DNA片段加接头连接法片段加接头连接法 衔接物衔接物(linker)(linker)，也叫接头，也叫接头，是有人工化学合成的一段是有人工化学合成的一段10-10-1212个核苷酸的个核苷酸的DNADNA双链，其中包含有双链，其中包含有1 1个或几个限制性酶切位点。个或几个限制性酶切位点。使用时只须将衔接物和目的片段的使用时只须将衔接物和目的片段的55端用多核苷酸激酶处理使端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后用之磷酸化，然后用T4DNAT4DNA连接酶进行连接，就可获得能产生粘性连接酶进行连接，就可获得能产生粘性末端的末端的DNADNA片段。片段。CCGAATTCGGGGCTTAAGCC磷酸化磷酸化CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHOHPPPOHOHT4连接酶连接酶CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHPOHEcoR ICCGAATTCGGGGCTTAAGCCAATTCGGGCCCCGGGCTTAA第33页，本讲稿共65页第二章第二章 基因操作的工具酶基因操作的工具酶第一节第一节 限制性核酸内切酶及其应用限制性核酸内切酶及其应用第二节第二节 DNA连接酶及其应用连接酶及其应用第三节第三节 DNA聚合酶及其应用聚合酶及其应用第四节第四节 修饰性工具酶修饰性工具酶Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled enzymology.A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer.第34页，本讲稿共65页1、大肠杆菌、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I2、Klenow片段片段3、T4 DNA聚合酶聚合酶4、逆转录酶（反转录酶）、逆转录酶（反转录酶）第三节第三节 DNA聚合酶及其应用聚合酶及其应用第35页，本讲稿共65页 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I（E。Coli DNA pol I）是）是Kornberg A.1956年首先从大肠杆菌年首先从大肠杆菌E。Coli 细胞中分离出来的。它是一种细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括多功能性的酶，包括 3 3种不同的酶活力：种不同的酶活力：5-3聚合酶活性聚合酶活性 以双链以双链DNA为模板，催化单核苷酸结合到引为模板，催化单核苷酸结合到引物的物的3末端，并不断延伸。末端，并不断延伸。5-3外切酶活性外切酶活性 将双链将双链DNA中游离的中游离的5末端逐个切去。末端逐个切去。3-5外切酶活性外切酶活性 将游离的双链或单链将游离的双链或单链DNA的的3端降解。不过端降解。不过对于双链的降解可被对于双链的降解可被5-3的多聚活性所抑制。的多聚活性所抑制。CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPol I+Mg2+AT AGCCTCCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTATCGGAPol I+Mg2+CCGATAGCCTGGCTAPol I+Mg2+T第36页，本讲稿共65页 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I 的三种用途的三种用途A.制备高比活度的制备高比活度的DNA探针探针 利用其利用其5-3的外切酶活性及其聚合酶活性。的外切酶活性及其聚合酶活性。B.用于用于DNA连接后的大缺口填充连接后的大缺口填充 利用利用5-3的聚合酶活性。的聚合酶活性。C.用于用于DNA的序列分析的序列分析 利用利用5-3的聚合酶活性。的聚合酶活性。第37页，本讲稿共65页 大肠杆菌聚合酶大肠杆菌聚合酶I的应用示例的应用示例CCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTATCGGAPol I+Mg2+缺口转移(Nick translation)CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPol I+Mg2+ATAGCCT第38页，本讲稿共65页缺口转移缺口转移(Nick translation)第39页，本讲稿共65页1、大肠杆菌、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I2、Klenow片段片段3、T4 DNA聚合酶聚合酶4、逆转录酶（反转录酶）、逆转录酶（反转录酶）第三节第三节 DNA聚合酶及其应用聚合酶及其应用第40页，本讲稿共65页 Klenow片段的主要用途片段的主要用途KlenowKlenow片段片段大肠杆菌聚合酶大肠杆菌聚合酶 I I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，它仍然有的大片段酶分子，它仍然有5353的聚合酶活性和的聚合酶活性和3 3 5 5 的的核酸外切酶活性，但失去了核酸外切酶活性，但失去了5353的外切酶活性。的外切酶活性。KlenowKlenow片段的主要用途片段的主要用途A.A.修补限制性酶消化修补限制性酶消化DNADNA形成的形成的33隐蔽末端隐蔽末端B.B.标记标记DNADNA片段的末端片段的末端C.C.cDNAcDNA克隆中第二链克隆中第二链cDNAcDNA的合成的合成D.D.DNADNA序列的测定序列的测定GAACTTAA第41页，本讲稿共65页1、大肠杆菌、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I2、Klenow片段片段3、T4 DNA聚合酶聚合酶4、逆转录酶（反转录酶）、逆转录酶（反转录酶）第三节第三节 DNA聚合酶及其应用聚合酶及其应用第42页，本讲稿共65页 T4DNA聚合酶的特点聚合酶的特点T T4 4DNADNA聚合酶是聚合酶是 从从T4T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，它和它和KlenowKlenow片段一样具有片段一样具有5353的聚合酶活性和的聚合酶活性和3 5 3 5 的核酸外切酶活性。的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I I 的活的活性高性高200200倍。倍。特别是，特别是，T4DNAT4DNA聚合酶还有第三种活力聚合酶还有第三种活力取代反应：取代反应：如果反应体系中仅存在一种如果反应体系中仅存在一种dNTPdNTP，这时，这时T4DNAT4DNA聚合酶就会表现出聚合酶就会表现出3 3 5 5 外切酶活力，从双链外切酶活力，从双链DNADNA的的33开始降解，直到露出和开始降解，直到露出和缺乏的那中缺乏的那中dNTPdNTP互补的碱基，然后就在此位置发生合成和取代反互补的碱基，然后就在此位置发生合成和取代反应。应。CGTCGCGCAGCGCGTGCAGCGdTTPMg+CGGCAGCGdTTPMg+第43页，本讲稿共65页 T4DNA聚合酶的用途聚合酶的用途1 1、以填充反应标记有、以填充反应标记有55端延伸的双链端延伸的双链 DNA DNA片段片段2 2、以取代反应标记延伸末端或平头末端、以取代反应标记延伸末端或平头末端 的双链的双链DNADNA片段片段3 3、用于、用于DNADNA序列分析序列分析第44页，本讲稿共65页1、大肠杆菌、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I2、Klenow片段片段3、T4 DNA聚合酶聚合酶4、逆转录酶（反转录酶）、逆转录酶（反转录酶）第三节第三节 DNA聚合酶及其应用聚合酶及其应用第45页，本讲稿共65页 逆转录酶逆转录酶Reverse transcriptase逆转录酶是逆转录酶是 一种可以有效地将一种可以有效地将mRNAmRNA转录成为转录成为DNADNA的酶，其产物称的酶，其产物称为为cDNA(complementary DNA).cDNA(complementary DNA).实际上，它也是一种实际上，它也是一种RNARNA依赖的依赖的DNADNA聚合酶。聚合酶。逆转录酶首先是逆转录酶首先是19701970年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。这两个课题组的论文都发在了同一期的这两个课题组的论文都发在了同一期的NatureNature杂志上。杂志上。主要用途是主要用途是 将将mRNAmRNA转录成转录成cDNAcDNA以制备基因片段。以制备基因片段。3 AAAAAAAA AAAAAAAA5 TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5 TTTTTTTTT3 AAAAAAAA 第46页，本讲稿共65页第二章第二章 基因操作的工具酶基因操作的工具酶第一节第一节 限制性核酸内切酶及其应用限制性核酸内切酶及其应用第二节第二节 DNA连接酶及其应用连接酶及其应用第三节第三节 DNA聚合酶及其应用聚合酶及其应用第四节第四节 修饰性工具酶修饰性工具酶Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled enzymology.A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer.第47页，本讲稿共65页1、末端转移酶（、末端转移酶（terminal transferase）2、核酸酶、核酸酶SI（SI nuclease）4、碱性磷酸化酶、碱性磷酸化酶第四节第四节 修饰性工具酶修饰性工具酶第48页，本讲稿共65页末端转移酶的特性末端转移酶的特性l末端转移酶是一类不依赖于末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的模板的DNA聚合酶。聚合酶。l该该类类酶酶可可以以在在没没有有模模板板链链存存在在的的情情况况下下，将将核核苷苷酸酸连连接接到到DNA的的在在3 羟羟基基，特特别别是是对对于于平平末末端端的的双双链链DNA末端加尾十分有效。末端加尾十分有效。l最最常常见见的的用用途途是是在在酶酶切切产产生生的的平平末末端端加加尾尾以以便便于于创创造粘性的互补末端。造粘性的互补末端。第49页，本讲稿共65页 Characters of the polymerase Terminal transferase is the common name of template-independant DNA polymerase.This enzyme is isolated from calf thymus and can add nucleotides to 3 hydroxyl groups of DNA without the need for a template.The best primer is double stranded DNA(dsDNA)with blunt ends.Purine bases require magnesium ions and pyrimidine bases require cobalt ions.The enzyme builds up homopolymer chains if supplied with appropriate dNTPs.The most common use for this enzyme is the generation of complementary tails on DNA fragments and vectors cut with restriction enzymes which generate blunt ends.第50页，本讲稿共65页平末端平末端DNA片段的末端加尾连接法片段的末端加尾连接法33553355末端核苷酸转移酶末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP33553355AAAAATTTTDNADNA聚合酶和聚合酶和T4DNAT4DNA连接酶连接酶第51页，本讲稿共65页1、末端转移酶（、末端转移酶（terminal transferase）2、核酸酶、核酸酶SI（SI nuclease）3、碱性磷酸化酶（、碱性磷酸化酶（Alkaline phosphatase）第四节第四节 修饰性工具酶修饰性工具酶第52页，本讲稿共65页 核酸酶核酸酶SI的特性的特性 这是一种从米曲霉（这是一种从米曲霉（Aspergillus oryzaeAspergillus oryzae）中分离）中分离的可以降解单链的可以降解单链DNADNA或或RNARNA的外切酶的外切酶。其主要用途有：其主要用途有：A、在、在cDNA合成过程中，切开合成过程中，切开cDNA的发夹末端；的发夹末端；B、载体构建过程中，切去、载体构建过程中，切去DNA片段的单链尾巴，片段的单链尾巴，形成平末端结构。形成平末端结构。第53页，本讲稿共65页3 AAAAAAAA AAAAAAAA5 TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5 TTTTTTTTT3 AAAAAAAA 发夹结构的切除发夹结构的切除TTAAAATT单链尾巴的切除单链尾巴的切除第54页，本讲稿共65页1、末端转移酶（、末端转移酶（terminal transferase）2、核酸酶、核酸酶SI（SI nuclease）3、碱性磷酸化酶、碱性磷酸化酶第四节第四节 修饰性工具酶修饰性工具酶第55页，本讲稿共65页 碱性磷酸化酶的特性碱性磷酸化酶的特性 从细菌中分离的碱性磷酸化酶简称从细菌中分离的碱性磷酸化酶简称BAPBAP（Bacterial Bacterial Alkaline PhosphataseAlkaline Phosphatase），从小牛肠中分离的简称），从小牛肠中分离的简称CAPCAP（Calf Alkaline PhosphataseCalf Alkaline Phosphatase）.其主要功能是将其主要功能是将DNADNA或或RNA5RNA5端的磷酸切除。端的磷酸切除。其主要用途有：其主要用途有：A、在用、在用P标记标记DNA 5端之前，去除端之前，去除5端的磷；端的磷；B、在、在DNA重组技术中，去除重组技术中，去除DNA片段的片段的5磷酸，防磷酸，防 止载体的自身环化。止载体的自身环化。第56页，本讲稿共65页载体去磷防止自连的应用示例载体去磷防止自连的应用示例POHPOHOHOHOHOHPOHPOHOHOHOHOH连接酶连接酶连接酶连接酶连接酶连接酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶2Pi寄主修复缺口寄主修复缺口载体自连或产生载体自连或产生二具体等二具体等第57页，本讲稿共65页小小 结结第一章第一章 导导 论论第二章第二章 基因操作的工具酶基因操作的工具酶第三章第三章 基因克隆的载体基因克隆的载体第四章第四章 基因克隆的策略基因克隆的策略第五章第五章 克隆基因的表达克隆基因的表达第六章第六章 基因工程的基本技术基因工程的基本技术第58页，本讲稿共65页第二章第二章 基因操作的工具酶基因操作的工具酶第一节第一节 限制性核酸内切酶及其应用限制性核酸内切酶及其应用第二节第二节 DNA连接酶及其应用连接酶及其应用第三节第三节 DNA聚合酶及其应用聚合酶及其应用第四节第四节 修饰性工具酶修饰性工具酶第59页，本讲稿共65页1、限制性核酸内切酶的发现、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类合命名、限制性核酸内切酶的分类合命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应、限制性核酸内切酶的消化反应第一节第一节 限制性核酸内切酶及其应用限制性核酸内切酶及其应用第60页，本讲稿共65页1、DNA连接酶作用的机理连接酶作用的机理2、DNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件3、DNA连接的策略连接的策略第二节第二节 DNA连接酶及其应用连接酶及其应用第61页，本讲稿共65页1、大肠杆菌、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I2、Klenow片段片段3、T4 DNA聚合酶聚合酶4、逆转录酶（反转录酶）、逆转录酶（反转录酶）第三节第三节 DNA聚合酶及其应用聚合酶及其应用第62页，本讲稿共65页1、末端转移酶（、末端转移酶（terminal transferase）2、核酸酶、核酸酶SI（SI nuclease）4、碱性磷酸化酶（、碱性磷酸化酶（Alkaline phosphatase）第四节第四节 修饰性工具酶修饰性工具酶第63页，本讲稿共65页基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤基因分基因分离酶切离酶切载体酶切载体酶切基因和载体连基因和载体连接接导入细菌导入细菌重组质粒繁殖重组质粒繁殖重组克隆的选择重组克隆的选择序列分析和基因序列分析和基因表达等研究表达等研究导入导入植物植物细胞细胞第64页，本讲稿共65页思考题1.什么是限制性核酸内切酶，它们是怎样命名的？什么是限制性核酸内切酶，它们是怎样命名的？2.II型限制性核酸内切酶的基本特性有哪些？型限制性核酸内切酶的基本特性有哪些？3.什么是粘性末端、平末端、同尾酶和同裂酶？什么是粘性末端、平末端、同尾酶和同裂酶？4.酶的单位是怎样定义的，影响酶活性的因素有哪些？酶的单位是怎样定义的，影响酶活性的因素有哪些？5.DNA连接酶的作用特点有哪些，了解这些特点有何使用连接酶的作用特点有哪些，了解这些特点有何使用价值？价值？6.大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I 有哪些不同的酶活力特性，各有何有哪些不同的酶活力特性，各有何利用价值。利用价值。7.Klenow片段和大肠杆菌片段和大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I有何异同？有何异同？8.为什么说逆转录酶（为什么说逆转录酶（Reverse transcriptase）是一种特殊的）是一种特殊的DNA聚合酶，其主要用途是什么？聚合酶，其主要用途是什么？9.举例说明在基因工程中修饰性工具酶具有重要的用途。举例说明在基因工程中修饰性工具酶具有重要的用途。10.为什么说基因工程实际上是精细的酶学操作工程？为什么说基因工程实际上是精细的酶学操作工程？第65页，本讲稿共65页