基因工程工具酶 (2)课件.ppt

关于基因工程工具酶(2)现在学习的是第1页，共42页一、限制性内切酶（一）、限制修饰系统的种类（一）、限制修饰系统的种类（二）、限制性内切酶的定义、命名（二）、限制性内切酶的定义、命名（三）、限制酶的特点（三）、限制酶的特点（四）、异源同序酶（四）、异源同序酶（isoschizomer，同，同裂酶）裂酶）（五）、（五）、限制酶的用途限制酶的用途现在学习的是第2页，共42页（一）、限制修饰系统的种类（一）、限制修饰系统的种类1.I型型：由三个基因构成，由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色体上，三个基因构成一个复）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（腺苷甲硫腺苷甲硫氨酸），无特异切割位点。氨酸），无特异切割位点。2.II型型：限制与修饰基因产物独立起作用，在限制与修饰基因产物独立起作用，在.coli中中这两种基因位于质粒上。这两种基因位于质粒上。3.III型型：修饰酶与型酶相同，修饰酶与型酶相同，hsd与与hsd基因产基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。现在学习的是第3页，共42页（二）、限制性内切酶的定义、命名（二）、限制性内切酶的定义、命名1.定义定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义狭义指指II型限制酶。型限制酶。2.命名命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。编号、分离顺序。例如：例如：Hind前三个字母来自于菌种名称前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“”表示菌系为型血清型；表示菌系为型血清型；“”表示分离到的第三个限制酶。表示分离到的第三个限制酶。EcoRIEscherichia coliRIHindHaemophilusinfluensae dSacI(II)Streptomycesachromagenes I()现在学习的是第4页，共42页（三）、限制酶的特点（三）、限制酶的特点1.识别顺序和酶切位点识别顺序和酶切位点）识别）识别-8个相连的核苷酸个相连的核苷酸MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CC BamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPy NotIGCGGCCGC；SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGNNNNNCCGG FokI5-()9-33-()13-5外侧，产生外侧，产生-端突起端突起）富含）富含现在学习的是第5页，共42页）对称性）对称性双对称双对称EcoRI5-GAATTC-33-CTTAAG-5）切点大多数在识别顺序之内，也有例外）切点大多数在识别顺序之内，也有例外）限制酶切后产生两个末端，末端结构是）限制酶切后产生两个末端，末端结构是-和和-2.末端种类末端种类）-端突起端突起，个数为或个核苷酸，个数为或个核苷酸Pst I5-CTGCAG-35-CTGCAG-33-GACGTC-53-GACGTC-5）-端突起端突起，个数为或个核苷酸，个数为或个核苷酸EcoRI5-GAATTC-35-GOHPAATTC-33-CTTAAG-53-CTTAAPHOG-5粘性末端能与另一个相同的粘连末端相连接，任何两个具有相同识别位粘性末端能与另一个相同的粘连末端相连接，任何两个具有相同识别位点的点的DNA分子经限制酶切割后能够重新连接成新的重组分子经限制酶切割后能够重新连接成新的重组DNA分子。在分子。在进行进行DNA重组时，应用限制酶同时切割目的基因和载体重组时，应用限制酶同时切割目的基因和载体DNA，使之，使之产生相对的粘性末端，然后再将二者连接成重组产生相对的粘性末端，然后再将二者连接成重组DNA分子分子现在学习的是第6页，共42页）平齐末端平齐末端SmaI5-CCCGGG-35-CCCGGG-33-GGGCCC-53-GGGCCC-5）非互补的粘性末端）非互补的粘性末端）切点在识别顺序之外的，如：）切点在识别顺序之外的，如：FokI FokI5-GGATG()9-35-GGATG(N)93-CCTAC()13-53-CCTAC(N)13）能识别简并顺序的，如：）能识别简并顺序的，如：AvaIAvaI5-CPyCGPuG-3CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG现在学习的是第7页，共42页 5-GAATTC-33-CTTAAG-55-GTTAAC-33-CAATTG-5EcoR的识别序列的识别序列Hae的识别序列的识别序列现在学习的是第8页，共42页5NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN33NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN55NNNNNG3NNNNNCTTAApEcoR的识别序列和酶切切口（粘端）的识别序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3GNNNNNN5现在学习的是第9页，共42页5NNNNNNGTTAACNNNNN3 3NNNNNNCAATTGNNNNN55NNNNNGTTpAACNNNNN33NNNNNCAApTTGNNNNN5 Hae的识别序列和酶切切口（平端）的识别序列和酶切切口（平端）现在学习的是第10页，共42页酶切条件：酶切缓冲液低盐组：050mmol/L NaCl中盐组：50100mmol/L NaCl高盐组：100150mmol/L NaCl现在学习的是第11页，共42页（四）、异源同序酶（四）、异源同序酶（isoschizomer，同裂酶），同裂酶）1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制制酶酶2.特点：特点：1）识别相同顺序）识别相同顺序2）切割位点的异同）切割位点的异同 KpnIGGTACCAsp718GGTACC SstICCGCGGSacICCGCGG现在学习的是第12页，共42页（五）、（五）、限制酶的用途限制酶的用途1.DNA重组重组2.限制酶（物理）图谱绘制限制酶（物理）图谱绘制3.突变分析（突变分析（RFLP分析）分析）4.限制酶的部分酶切与完全酶切限制酶的部分酶切与完全酶切附：附：IIS型限制酶的特点型限制酶的特点1.具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构。称结构。2.酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，1-20nt。3.酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。4.产生粘性末端可以是产生粘性末端可以是1-5个核苷酸。个核苷酸。5.均为单体，分子量为均为单体，分子量为47108kD。现在学习的是第13页，共42页酶切图谱的构建（酶切图谱的构建（a a）请构建该环状DNA分子的酶切图谱现在学习的是第14页，共42页酶切图谱的构建（酶切图谱的构建（b b）现在学习的是第15页，共42页二、二、DNADNA甲基化甲基化酶酶（一）、一）、甲基化酶的种类与识别顺序甲基化酶的种类与识别顺序1.限制修饰系统限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶型中的甲基化酶三个系统中的甲基化酶可使细菌三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成发生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤。甲基腺嘌呤。在在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。同。如：如：M.EcoRIGAmATTCCEcoRIGAATTC不同不同MHpaICmCGGHpaICCGG相同相同现在学习的是第16页，共42页2.II型甲基化酶对限制酶活性的影响型甲基化酶对限制酶活性的影响）抑制同种限制酶的活性抑制同种限制酶的活性M.BamHIGGATmCCBamHI(G GATCC)M.EcoRIGAmATTCEcoRI(G AATTC)）抑制不同种限制酶的活性抑制不同种限制酶的活性a.顺序完全重叠顺序完全重叠如：如：M.ClaI（ATCGmAT）-TaqI（TCGmA）b.顺序边界重叠顺序边界重叠如：如：M.BamHI（GGATmCC）-MepI（mCCGG）抑制不同种限制酶的部分活性抑制不同种限制酶的部分活性MTaqI（TCGmA）-HindII（GTPyPuAC）：）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC3.甲基化酶的用途甲基化酶的用途）改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成）在建立基因文库时，可先使在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然后再分子部分甲基化，然后再用限制酶切用限制酶切现在学习的是第17页，共42页M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3与载体相连与载体相连甲基甲基化酶化酶人工人工接头接头RE用于基因组文库的建立用于基因组文库的建立用于用于cDNA的连接的连接RERERE现在学习的是第18页，共42页三、核酸酶（一）、外切酶一）、外切酶III（ExoIII）1.一般特点：一般特点：来自于来自于E.coli，分子量，分子量28,000kD2.催化反应类型催化反应类型1)外切酶活性：外切酶活性：35，产生，产生5-单磷酸核苷酸和具各种结构的单磷酸核苷酸和具各种结构的ds-DNA，pH7.6-8.52)核酸酶核酸酶H活性：除去活性：除去DNA-RNA杂交分子中的杂交分子中的RNA分子，分子，pH7.6-8.53)3-磷酸酶活性：除去磷酸酶活性：除去3-磷酸基后形成磷酸基后形成3-OH端，有利于端，有利于DNA聚合酶反应，聚合酶反应，pH6.8-7.44)内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，键切开，pH7.6-8.5现在学习的是第19页，共42页3.外切酶活性特点外切酶活性特点1)反应底物：互补反应底物：互补ds-DNA2)碱基释放速度：碱基释放速度：CA-TG3)反应产物：反应产物：5-单磷酸核苷和具缺口或单磷酸核苷和具缺口或5-端突起的端突起的ds-DNA，过度反应将导致，过度反应将导致DNA降解降解4.用途用途1)核酸（核酸（DNA）标记）标记2)基因突变基因突变-缺失缺失3)DNA序列测定时作顺序缺失序列测定时作顺序缺失5.使用注意事项使用注意事项1)正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度2)在一定条件下，在一定条件下，ExoIII不能作用不能作用GC富集区富集区(来自于来自于cDNA加尾加尾)现在学习的是第20页，共42页ds-DNA结构结构:切口切口,缺口缺口,断口断口缺口缺口(gap)切口切口(nick)断口断口(cut)3HOP53HOP5现在学习的是第21页，共42页5P5P5P5P5P3HO3HO3HO3HO3HO3HO3HO3HOOH3OH3OH3OH3P5P5P5P5P5P5P53HOP5OH3P5RNaseHExoIII的外切酶和的外切酶和RNaseH的作用的作用现在学习的是第22页，共42页1234abc1234abc1234abc1234abc1234abc234abc34abc4abcabcExoIII用于顺序缺失用于顺序缺失ExoIII ExoIII-32P-32P dCTP dCTP 5PP55PP53HOOH33HOOH3ExoIII用于用于DNA标记标记现在学习的是第23页，共42页（二）、（二）、RNase（三）、（三）、RNaseH（二）、（二）、RNase大部分用于大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去的核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋样品或蛋白质合成系统中的白质合成系统中的RNA分子。分子。1.RNaseA分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100加热加热15min仍具活性）仍具活性）,用于除去用于除去DNA样品中的样品中的RNA分子分子2.核酸酶核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去蛋白敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源质合成系统中的内源mRNA（三）、（三）、RNaseH作用于作用于DNA-RNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链，用于链，用于cDNA文库建立文库建立时除去时除去R RNA链以便第二条链链以便第二条链cDNA链的合成。链的合成。现在学习的是第24页，共42页（四）、（四）、DNaseI1.特点：特点：具内切酶活性，作用于具内切酶活性，作用于ds-DNA，但无核苷酸序列特异，但无核苷酸序列特异型，产生型，产生5-P低聚核苷酸低聚核苷酸;Ca2+,Mg2+或或Ca2+,Mn2+可使酶活达最可使酶活达最大值大值当酶浓度很低时，当酶浓度很低时，ds-DNA分子上将形成切口，不同类型二价阳分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：离子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg2+存在时，两条链上存在时，两条链上的切口独立无关，的切口独立无关，Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置存在时，两条链上的切口几乎在同一位置2.用途用途1)切口移位，制备切口移位，制备DNA探针探针2)制备制备RNA样品时除去样品时除去DNA分子分子3)基因突变时产生切口基因突变时产生切口 现在学习的是第25页，共42页Mn+存在时存在时Mg+存在时存在时 DNaseI作用特点作用特点DNaseIHOP535353DNaseI与与PolI的的切口移位切口移位PolI现在学习的是第26页，共42页四、聚合酶四、聚合酶包括包括DNA聚合酶和聚合酶和RNA聚合酶聚合酶（一）、（一）、E.coli DNA聚合酶聚合酶I（polI）1.E.coli的的DNA聚合酶系统聚合酶系统PolI参与参与DNA修复修复,具具35和和53外切酶活性外切酶活性polII同上同上具具35外切酶活性外切酶活性polIII参与参与DNA复制复制,具具35和和53外切酶活性外切酶活性2.E.colipolI的特点的特点 1）具两种外切酶活性和）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具外切酶活性，大片段具35外切酶活性外切酶活性(大片段大片段亦称为亦称为Klenow片段片段,polIK)2）聚合酶活性，聚合酶活性，53,要求要求3-OH引物和模板引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影，其延续性受反应条件的影响响3）外切酶活性外切酶活性现在学习的是第27页，共42页3.用途用途 1）除去除去3-端突起的单链端突起的单链DNA（在无（在无dNTP时）时）2）补齐补齐5-突起端突起端3）合成第二条合成第二条cDNA4）切口移位制备探针切口移位制备探针其中用途其中用途2)和和3)常用大片段常用大片段现在学习的是第28页，共42页（二）、（二）、T4DNA聚合酶聚合酶1.特点：特点：53聚合酶活性，聚合酶活性，1500nt/min,为为polI的两倍的两倍35外切酶活性，可作用于外切酶活性，可作用于ss-DNA和和dsDNA,其切除速度分别其切除速度分别为为40和和4000nt/min,缺少缺少5到到3的外切核酸酶活性的外切核酸酶活性.2.用途：用途：制备高比活性探针制备高比活性探针(1010cpm/gDNA);DNA末端修饰末端修饰-缺失缺失外切酶活性外切酶活性聚合酶活性聚合酶活性无无dNTPdNTP现在学习的是第29页，共42页(三)T7 噬菌体DNA聚合酶具3到5端外切核酸酶活性和持续合成能力较低的DNA聚合酶活性.应用:1)合成DNA能力很强,可用于延伸很长的模板.2)可用于定点诱变中互补链的合成.3)3末端的标记4)将双链DNA的黏性末端转变为平端.现在学习的是第30页，共42页（四）、（四）、TaqDNA聚合酶聚合酶1.特点：特点：分离自水生栖热菌，分子量为分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度，最适反应温度75，对对95高温具良好稳定性，该酶不存在高温具良好稳定性，该酶不存在35外切外切酶活性酶活性2.用途：用途：主要用于主要用于DNA的体外扩增，经的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应次循环后才进入酶的反应稳定期，一个稳定期，一个DNA分子因而可被扩增分子因而可被扩增4106倍。倍。DNA扩增技术又称为扩增技术又称为聚合酶链式反应聚合酶链式反应，它包括以下三个，它包括以下三个步骤：步骤：DNA模板变性模板变性(95)与与DNA引物退火引物退火(45)引物延引物延伸伸(75)现在学习的是第31页，共42页TaqPol和和PCR 53变性变性 3553引物引物35复性复性535335引物引物3553延伸延伸533535 现在学习的是第32页，共42页(五)不倚赖于模板的DNA聚合酶末端转移酶特点:催化dNTP到DNA的3羟基端,不需要模板,但需要2价阳离子.应用:1)克隆DNA片段.同聚物加尾.2)用32P标记DNA的3末端.3)在DNA的3末端掺入非放射性的标签.4)合成多脱氧核苷酸同聚体.现在学习的是第33页，共42页(六)倚赖RNA的DNA聚合酶反转录酶合成cDNA克隆补平和标记5端突出的DNA片段的3末端.代替Klenow酶现在学习的是第34页，共42页(七)倚赖DNA的RNA聚合酶噬菌体的RNA聚合酶:SP6,T7和T3应用:产生均匀标记的高比活性单链RNA探针(原位杂交)现在学习的是第35页，共42页(八)不倚赖DNA的RNA聚合酶poly(A)聚合酶应用:用32P标记RNA的3端 加尾(poly(A)现在学习的是第36页，共42页五、连接酶（一）、（一）、T4DNA连接酶连接酶1.特点：特点：只连接只连接ds-DNA分子，要求分子，要求3-羟基和羟基和5-磷酸基磷酸基2.用途：用途：1)相同或相容粘性末端的连接相同或相容粘性末端的连接2)平整末端的相连平整末端的相连DNA平端来源：限制酶作用结果平端来源：限制酶作用结果;限制酶与其它酶共同限制酶与其它酶共同作用结果作用结果。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多需的酶量也多现在学习的是第37页，共42页5-AAGCTT-35-AOHPAGCTT-3PAGCTTAOH3-TTCGAA-53-TTCGAPHOA-5HOATTCGAP 退火退火5-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-33-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5或或 5-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-33-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5T4DNA连接酶连接酶5-AAGCTTAAGCTT-33-TTCGAATTCGAA-5或或 5-AAGCTTAAGCTT-33-TTCGAATTCGAA-5T4DNA连接酶的连接反应连接酶的连接反应(两种插入方向两种插入方向)+现在学习的是第38页，共42页(二)大肠杆菌DNA 连接酶修复双链DNA中的单链切口并催化互补黏性末端的连接,但不能连接平末端现在学习的是第39页，共42页(三)RNA连接酶T4 噬菌体RNA连接酶在ATP存在的情况下,催化单链DNA或RNA的5端磷酸与单链DNA或RNA的3端羟基共价连接.现在学习的是第40页，共42页六 其他酶类碱性磷酸酶:5端去磷酸化激酶:5端磷酸化现在学习的是第41页，共42页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第42页，共42页