实验三重组质粒转化大肠杆菌课件.ppt

关于实验三重组质粒关于实验三重组质粒转化大肠杆菌转化大肠杆菌现在学习的是第1页，共21页实实 验验 目目 的的 l 学习将重组质粒学习将重组质粒DNA导入大肠杆菌的方法导入大肠杆菌的方法l 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法l 为下一步重组体筛选做准备为下一步重组体筛选做准备现在学习的是第2页，共21页实实 验验 原原 理理 遗传学中转化的基本含义是使细胞获得一新的可遗传的表遗传学中转化的基本含义是使细胞获得一新的可遗传的表型性状。分子克隆中用人工的方法将重组质粒型性状。分子克隆中用人工的方法将重组质粒DNA导入大肠杆导入大肠杆菌细胞，使携带有重组质粒的大肠杆菌获得在抗生素平板上生菌细胞，使携带有重组质粒的大肠杆菌获得在抗生素平板上生长的能力，从而与不携带重组质粒的的细菌区分开来，这个过长的能力，从而与不携带重组质粒的的细菌区分开来，这个过程就是转化。程就是转化。将重组质粒转化进受体细菌时，需诱导受体细菌产生一种短暂将重组质粒转化进受体细菌时，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源的感受态以摄取外源DNA。大肠杆菌细胞经过一些特殊方法（电。大肠杆菌细胞经过一些特殊方法（电击法、击法、CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞即感受态细胞分子进入的细胞即感受态细胞(Competent cells)。现在学习的是第3页，共21页 转化转化(Transformation)是将外源是将外源DNA分子引入受体分子引入受体细细胞，使之胞，使之获获得新的得新的遗传遗传性状的一种手段，性状的一种手段，它是微生物它是微生物遗传遗传、分子、分子遗传遗传、基因工程等研究、基因工程等研究领领域的基本域的基本实验实验技技术术。0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液，在是一种低渗溶液，在0低温低温处处理大理大肠肠杆菌杆菌细细胞胞时时，细细胞膨胞膨胀胀成球形，成球形，DNA可吸附在其表面。在短可吸附在其表面。在短暂暂的的热热冲冲击击（如（如42 ）下，）下，细细胞可吸胞可吸收外源收外源DNA。为为了了鉴鉴定定这这些些转转化子，化子，须须利用利用质质粒粒编码编码的的筛选标记筛选标记，这这些些标记赋标记赋予予细细菌新菌新的表型，是成功的表型，是成功转转化的化的细细菌很容易被菌很容易被筛选筛选出来。出来。pET32a质质粒粒带带有氨有氨苄苄西林抗西林抗性基因（性基因（Ampr），其重），其重组组体体转转化的大化的大肠肠杆菌能杆菌能够够在含氨在含氨苄苄西林的培养西林的培养基上生基上生长长，而未，而未转转化的受体菌化的受体菌则则不能再不能再这这种培养基上生种培养基上生长长。现在学习的是第4页，共21页Ampr：氨苄西林抗性基因：氨苄西林抗性基因 内酰胺酶内酰胺酶多克隆位点（多克隆位点（MCS）：外源）：外源DNA片段的插入位点片段的插入位点Amps菌株菌株Ampr涂布于含涂布于含Amp的培养基上，可以生长。次日可见的培养基上，可以生长。次日可见白色菌落白色菌落-转化子。转化子。培养基上含有培养基上含有X-Gal和和IPTG时，可使用蓝白斑筛时，可使用蓝白斑筛选方法鉴别真正的重组的选方法鉴别真正的重组的转化子。转化子。pET32apET32a现在学习的是第5页，共21页结构的三大要素：结构的三大要素：l 多克隆位点l 选择标记（耐药性，LacZ）l 复制起始位点种类：种类：l 质粒l 噬菌体l 酵母人工染色体（YAC）l 反转录病毒载体l 表达载体等现在学习的是第6页，共21页现在学习的是第7页，共21页pET-32a VectorThe pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E.coli.现在学习的是第8页，共21页pET-32 cloning/expression region现在学习的是第9页，共21页Vector(pET-32a)Gene fragment(SmPR10)pET32a-SmPR10现在学习的是第10页，共21页材料、设备及试剂材料、设备及试剂 材料材料 E.coli DH5菌株菌株:R-、M-、Amp-(转化过程所用的受体细胞一般是限转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),它可以容忍外源它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。）分子进入体内并稳定地遗传给后代。）pET32a-SmPR10质粒质粒DNA（浓度：（浓度：2 ng/l):实验室自制实验室自制设备设备 恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；超净工作台；低温冰箱；恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；超净工作台；低温冰箱；恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪。恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪。现在学习的是第11页，共21页 试剂试剂 1、LB固体和液体培养基固体和液体培养基 LB培养基配方：（单位培养基配方：（单位g/L）胰蛋白胨胰蛋白胨 10 酵母提取物酵母提取物 5 NaCl 10 琼脂粉（琼脂粉（1.5%）15g （注：（注：LB液体培养基不加琼脂粉）液体培养基不加琼脂粉）按配方称量药品按配方称量药品,加入一定量的加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂，待琼脂完后置电炉上加热熔解琼脂，待琼脂完全熔解后加入全熔解后加入ddH2O定容至定容至1000ml,用用NaOH调节调节pH至至7.0。121湿热湿热高压灭菌高压灭菌20分钟，待冷却至分钟，待冷却至60左右左右,在超净工作台中加入一定量的在超净工作台中加入一定量的Amp储存液储存液,使终浓度为使终浓度为100g/ml,摇匀后用培养皿铺板。摇匀后用培养皿铺板。现在学习的是第12页，共21页2、Amp母液：母液：称取氨苄西林称取氨苄西林100mg溶于溶于1mlddH2O中，中，0.22m滤器滤器过滤除过滤除菌菌，用，用1.5ml离心管分装后储存于离心管分装后储存于-20冰箱冰箱.3、0.1mol/L CaCl2 溶液溶液:称称0.56gCaCl2(无水分析纯无水分析纯),溶于溶于50ml重蒸水中重蒸水中,定容至定容至100ml,用用0.22m滤器过滤除菌或高压灭菌。滤器过滤除菌或高压灭菌。EP管分装于管分装于4冰箱储存冰箱储存.4、pET32a-SmPR10质粒：实验室自制质粒：实验室自制现在学习的是第13页，共21页操操 作作 步步 骤骤（一）（一）受体菌的培养受体菌的培养 1、取、取-70或或-20贮存的大肠杆菌贮存的大肠杆菌DH5菌种，菌种，在在LB培养液中培养过夜，进行培养液中培养过夜，进行活化活化;2、取几微升活化后的菌液（取量视菌的密度而定）在、取几微升活化后的菌液（取量视菌的密度而定）在LB平板上涂布平板上涂布,于于37培养箱培养箱中培养中培养24h；从；从LB平板上挑取单菌落平板上挑取单菌落,接种于接种于3-5ml LB液体培养基中液体培养基中,37下振荡下振荡培养培养12小时左右小时左右,直至对数生长后期。直至对数生长后期。3、将该菌悬液以、将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于的比例接种于LB液体培养基中液体培养基中,37振荡培养振荡培养2-3小时至小时至OD600 0.5左右左右(生长对数期）。生长对数期）。（注：这一步非常关键。培养过度的菌液含有较（注：这一步非常关键。培养过度的菌液含有较多的多的“老老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援细胞，制备成感受态细胞后其接受外援DNA能力较低，从而导致转能力较低，从而导致转化率降低。）化率降低。）现在学习的是第14页，共21页（二）、（二）、感受态细胞的制备感受态细胞的制备 (CaCl2 法法)1、将菌液、将菌液转转入入1.5ml离心管中离心管中,冰上冰上放置放置10分分钟钟,然后于然后于4、4000rpm离心离心10分分钟钟。2、弃去上清、弃去上清,用用预预冷冷的的0.1mol/L的的CaCl2 溶液溶液1ml轻轻悬轻轻悬浮浮细细胞胞,冰上放置冰上放置10分分钟钟后后,4、4000rpm离心离心10分分钟钟。3、弃去上清、弃去上清,加入加入0.1ml预预冷冷的的0.1mol/L的的CaCl2 溶液溶液,轻轻轻悬轻悬浮浮细细胞。每份胞。每份100l（注意（注意悬悬液密度要均匀）液密度要均匀）,冰冰上放置上放置备备用。用。4、暂时暂时不用的感受不用的感受态细态细胞可置于胞可置于-80保存。保存。注：注：CaCl2处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作！处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作！现在学习的是第15页，共21页（三）（三）重组质粒重组质粒DNADNA的转化的转化 1.质质粒和感受粒和感受态细态细胞混和：在胞混和：在100l感受感受态细态细胞胞悬悬液中加液中加入入5l重重组质组质粒粒DNA（pET32a-SmPR10），），轻轻轻轻混匀混匀后冰上放置后冰上放置30分分钟钟。2.热击热击：42水浴中水浴中热击热击60秒（秒（注：精确注：精确计计算算时间时间，热热击过长击过长将将对细对细胞造成胞造成伤伤害害）,热击热击后后马马上置于冰上冷上置于冰上冷2-5分分钟钟。3.复复苏苏：向每管中加入：向每管中加入800l LB液体培养基液体培养基(注：不含注：不含Amp),混匀后在混匀后在37150rpm轻摇轻摇培养培养1小小时时，使，使细细菌恢菌恢复正常生复正常生长长状状态态，并表达，并表达质质粒粒编码编码的抗生素抗性基因的抗生素抗性基因(Ampr)。思考：思考：热击后的细胞已吸入外源质粒，如本实验中的热击后的细胞已吸入外源质粒，如本实验中的pET32a，该质粒可赋予宿主氨苄青霉素抗性。但是为什么复苏，该质粒可赋予宿主氨苄青霉素抗性。但是为什么复苏时用的时用的LB培养液不加培养液不加Amp？现在学习的是第16页，共21页（四）涂布平板筛选转化质粒（四）涂布平板筛选转化质粒 1.将管中培养液摇匀后取将管中培养液摇匀后取100l 均匀涂布于含均匀涂布于含Amp的筛选平板上。的筛选平板上。（注：将培养液摇匀后涂布。）（注：将培养液摇匀后涂布。）2.正面向上放置半小时正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后待菌液完全被培养基吸收后倒置倒置培养皿培养皿，37温箱中培养过夜温箱中培养过夜，次日观察实验结果，次日观察实验结果。现在学习的是第17页，共21页预期实验结果预期实验结果感受态细胞感受态细胞+重组质粒重组质粒0.1MCaCl2+重组质粒重组质粒感受态细胞感受态细胞+无菌水无菌水现在学习的是第18页，共21页实验报告 思考题思考题(1).根据本实验你认为影响转化率的因素有哪些？根据本实验你认为影响转化率的因素有哪些？(2).如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？将如何解释这种现象？现在学习的是第19页，共21页实验中要考虑的重要因素实验中要考虑的重要因素 为了提高转化效率为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：实验中要考虑以下几个重要因素：1.细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度:不要用经过多次继代或储于不要用经过多次继代或储于的培养菌，的培养菌，最好从最好从-70或或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的培养液的OD600 来控制。来控制。DH5菌株的菌株的OD600 为为0.5时时,细胞密度在细胞密度在5107 个个/ml左右左右(不同的菌株情况有所不同不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。化效率。现在学习的是第20页，共21页感谢大家观看现在学习的是第21页，共21页