食品中氨基酸和蛋白质的测定课件.ppt

食品中氨基酸和蛋白质的测定第1页，此课件共80页哦第十章第十章 食品中氨基酸和食品中氨基酸和蛋白质的测定蛋白质的测定一、氨基酸的测定一、氨基酸的测定二、蛋白质的测定二、蛋白质的测定第2页，此课件共80页哦 蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的最终产物为氨基酸。构成蛋白质的氨基酸最终产物为氨基酸。构成蛋白质的氨基酸2020种。种。其中必需氨基酸其中必需氨基酸8 8种种:亮氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。氨酸和缬氨酸。一、氨基酸的测定一、氨基酸的测定（一）概述（一）概述第3页，此课件共80页哦氨基酸态氨基酸态氮的测定氮的测定甲醛滴定法甲醛滴定法电位滴定法电位滴定法氨基酸总氨基酸总量的测定量的测定茚三酮比色法茚三酮比色法氨基酸类氨基酸类型和含量型和含量的测定的测定氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪第4页，此课件共80页哦（二）食品中氨基酸态氮的测定（二）食品中氨基酸态氮的测定 原理：原理：氨基酸为两性电解质，既含有酸性的羧氨基酸为两性电解质，既含有酸性的羧基，又含有碱性的氨基，在接近中性的水溶液基，又含有碱性的氨基，在接近中性的水溶液中，全部解离为双极离子形成内盐，当加入甲中，全部解离为双极离子形成内盐，当加入甲醛后，氨基与甲醛反应，从而使其碱性消失，醛后，氨基与甲醛反应，从而使其碱性消失，游离出酸性的羧基，这样就可以用标准碱溶液游离出酸性的羧基，这样就可以用标准碱溶液来滴定羧基，根据消耗的碱标准溶液的体积即来滴定羧基，根据消耗的碱标准溶液的体积即可计算出氨基酸态氮。可计算出氨基酸态氮。1.1.甲醛滴定法甲醛滴定法第5页，此课件共80页哦甲醛反应甲醛反应RCHNH3+COOHCHORCHNHCH2OHHCHORCHN(CH2OH)2羟甲基氨基酸羟甲基氨基酸二羟甲基氨基酸二羟甲基氨基酸COOCOOH+第6页，此课件共80页哦（1）40%中性甲醛中性甲醛（2）1%酚酞指示剂酚酞指示剂（3）0.1mol/L氢氧化钠标准溶液氢氧化钠标准溶液（4）活性碳）活性碳试剂试剂第7页，此课件共80页哦仪器仪器第8页，此课件共80页哦（1 1）样品处理：）样品处理：对于含水量少的固体样品粉碎过筛，混匀，称样对于含水量少的固体样品粉碎过筛，混匀，称样含含水水多多的的固固体体样样品品洗洗净净擦擦干干，去去皮皮、核核、柄柄，切切成成小小块块于于植植物物组组织织捣捣碎碎机机中中，加加等等量量的的水水，捣捣成成匀匀浆浆，称匀浆称匀浆液体样品：直接吸取液体样品：直接吸取将将样样品品置置于于小小烧烧杯杯中中，加加蒸蒸馏馏水水50mL，活活性性炭炭5g，加加热热煮煮沸沸5min，期期间间不不断断用用玻玻璃璃棒棒搅搅拌拌，过过滤滤，用用40mL热蒸馏水洗涤活性炭，收集滤液备用。热蒸馏水洗涤活性炭，收集滤液备用。测定步骤测定步骤第9页，此课件共80页哦（2）测定）测定在在 上上 述述 滤滤 液液 中中 加加 入入3-4滴滴 酚酚 酞酞 指指 示示 剂剂，用用0.1mol/L氢氢氧氧化化钠钠标标准准溶溶液液滴滴定定至至溶溶液液呈呈浅浅红红色色，而而后后加加入入中中性性甲甲醛醛20mL，摇摇匀匀，浅浅红红色色消消失失（为为什什么么？）。继继续续用用0.1mol/L氢氢氧氧化化钠钠标标准准溶溶液液滴滴定定至至溶溶液液呈呈浅浅红红色色，记记录录自自甲甲醛醛加加入入后后所所消消耗的耗的0.1mol/L氢氧化钠标准溶液的体积。氢氧化钠标准溶液的体积。（3）做空白实验）做空白实验第10页，此课件共80页哦式中：式中：C-氢氧化钠标准溶液的浓度（氢氧化钠标准溶液的浓度（mol/L）V-样品溶液消耗的氢氧化钠标准溶液体积（样品溶液消耗的氢氧化钠标准溶液体积（mL）V0-空白消耗氢氧化钠标准溶液体积（空白消耗氢氧化钠标准溶液体积（mL）m-样品的质量（样品的质量（g）0.014-氮的毫摩尔质量（氮的毫摩尔质量（g/mmol）结果计算结果计算第11页，此课件共80页哦1.1.该该方方法法简简便便、易易行行，适适用用于于测测定定食食品品中中的的游离氨基酸态氮。游离氨基酸态氮。2.2.若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。测定，或用电位滴定法进行测定。说明及注意事项说明及注意事项第12页，此课件共80页哦2.2.电位滴定法电位滴定法 原原理理：氨氨基基酸酸为为两两性性电电解解质质，既既含含有有羧羧基基又又含含有有氨氨基基，加加入入甲甲醛醛后后，甲甲醛醛与与氨氨基基酸酸的的氨氨基基作作用用，使使羧羧基基显显示示出出酸酸性性，用用氢氢氧氧化化钠钠标标准准溶溶液液进进行行滴滴定定，以以酸酸度度计测定终点计测定终点pH=9.2 。第13页，此课件共80页哦酸度计酸度计酸度计酸度计磁力搅拌器磁力搅拌器仪器仪器第14页，此课件共80页哦（1）40中性甲醛溶液中性甲醛溶液（2）0.05mol/LNaOH标准溶液标准溶液试剂试剂第15页，此课件共80页哦吸吸取取含含氨氨基基酸酸的的样样品品溶溶液液5-10mL于于100mL容容量量瓶瓶中中，加加水水至至刻刻度度，混混匀匀后后吸吸取取20mL置置于于200mL烧烧杯杯中中，加加水水60mL，插插入入酸酸度度计计的的指指示示电电极极和和参参比比电电极极，开开动动磁磁力力搅搅拌拌器器，用用0.05mol/LNaOH标标准准溶溶液液滴滴定定至至酸酸度度计计指指示示pH8.2，记记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数，供计算总酸含量。录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数，供计算总酸含量。向向上上述述溶溶液液中中加加入入10mL40%中中性性甲甲醛醛溶溶液液，混混匀匀。再再用用氢氢氧氧化化钠钠标标准准溶溶液液继继续续滴滴定定至至pH9.2，记记录录自自加加入入甲甲醛醛后后消消耗耗氢氢氧化钠标准溶液毫升数。氧化钠标准溶液毫升数。测定步骤测定步骤（1 1）样品处理）样品处理同甲醛滴定法同甲醛滴定法（2 2）样液测定）样液测定（3）做空白实验）做空白实验第16页，此课件共80页哦式中：式中：C-氢氧化钠标准溶液的浓度（氢氧化钠标准溶液的浓度（mol/L）V-样品溶液消耗的氢氧化钠标准溶液体积（样品溶液消耗的氢氧化钠标准溶液体积（mL）V0-空白消耗氢氧化钠标准溶液体积（空白消耗氢氧化钠标准溶液体积（mL）m-样品的质量（样品的质量（g）0.014-氮的毫摩尔质量（氮的毫摩尔质量（g/mmol）结果计算结果计算第17页，此课件共80页哦1.1.此法适用于测定各类食品中的游离氨基酸。此法适用于测定各类食品中的游离氨基酸。2.2.操作简便，结果准确性高。操作简便，结果准确性高。说明及注意事项说明及注意事项第18页，此课件共80页哦（二）（二）氨基酸总量的测定氨基酸总量的测定 -茚三酮比色法茚三酮比色法 l氨基酸在碱性溶液中与水合茚三酮作用，生氨基酸在碱性溶液中与水合茚三酮作用，生成蓝紫色化合物，其颜色深浅在一定范围内成蓝紫色化合物，其颜色深浅在一定范围内与氨基酸含量成正比，在波长与氨基酸含量成正比，在波长570nm下比色，下比色，测定吸光度。测定吸光度。l脯氨酸与水合茚三酮作用生成黄色化合物，脯氨酸与水合茚三酮作用生成黄色化合物，需在波长需在波长440nm下比色。下比色。原理原理第19页，此课件共80页哦还原茚还原茚三酮三酮水合茚三酮水合茚三酮蓝紫色物质蓝紫色物质第20页，此课件共80页哦（1）2%茚三酮溶液茚三酮溶液:茚三酮茚三酮+SnCl2试剂试剂（2）pH8.04磷酸缓冲液磷酸缓冲液（3）氨基酸标准溶液）氨基酸标准溶液:亮氨酸亮氨酸第21页，此课件共80页哦1.1.制作甘露糖标准曲线：制作甘露糖标准曲线：（1 1）绘制标准曲线）绘制标准曲线测定步骤测定步骤试管管号试管管号0123456氨基酸标准液氨基酸标准液（200g/mL）0123456氨基酸含量氨基酸含量（g）020040060080010001200加蒸馏水加蒸馏水（mL）8765432pH8.04磷酸缓磷酸缓冲液（冲液（mL）22222222%茚三酮溶液茚三酮溶液（mL）2222222第22页，此课件共80页哦混匀，置于沸水浴中加热混匀，置于沸水浴中加热15min，冷却后，冷却后，用水定容至用水定容至50mL，静置，静置15min后，在波后，在波长长570nm下比色，测定吸光度。以氨基下比色，测定吸光度。以氨基酸含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，酸含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。绘制标准曲线。第23页，此课件共80页哦l含水少的固体样品粉碎过筛，混匀，称取含水少的固体样品粉碎过筛，混匀，称取l含水多的固体样品洗净擦干，去皮、核、柄，切含水多的固体样品洗净擦干，去皮、核、柄，切成小块于植物组织捣碎机中，加等量的水，捣成成小块于植物组织捣碎机中，加等量的水，捣成匀浆，称匀浆匀浆，称匀浆l液体样品直接吸取液体样品直接吸取置于小烧杯中，加蒸馏水置于小烧杯中，加蒸馏水50mL，活性炭，活性炭5g，加热煮，加热煮沸沸5min，期间不断用玻璃棒搅拌，过滤，用，期间不断用玻璃棒搅拌，过滤，用3040mL热蒸馏水洗涤活性炭，收集滤液于热蒸馏水洗涤活性炭，收集滤液于100mL容量瓶中，定容，备用。容量瓶中，定容，备用。（2 2）样品处理）样品处理 （3 3）测定）测定 吸取样液吸取样液14mL于刻度试管中，按照标准于刻度试管中，按照标准曲线测定曲线测定第24页，此课件共80页哦结果计算结果计算式中：式中：C-待测溶液的氨基酸含量（待测溶液的氨基酸含量（g）m-样品的质量（样品的质量（g）v1-样品溶液总体积（样品溶液总体积（mL）v2-测定用样品溶液的体积（测定用样品溶液的体积（mL）第25页，此课件共80页哦1.茚三酮受光、空气、温度、湿度等影响而被氧化成淡茚三酮受光、空气、温度、湿度等影响而被氧化成淡红色或深红色，使用前必须纯化。红色或深红色，使用前必须纯化。2.茚三酮与氨基酸反应所产生的颜色在茚三酮与氨基酸反应所产生的颜色在1h保持稳定，保持稳定，故应抓紧时间比色。故应抓紧时间比色。3.该显色反应十分灵敏，故需用无氨蒸馏水该显色反应十分灵敏，故需用无氨蒸馏水。说明与注意事项说明与注意事项方法：方法：普通蒸馏水中加硫酸调至普通蒸馏水中加硫酸调至pH2pH2，使水中各种形态的，使水中各种形态的氨或胺最终都变成不挥发的盐类，用附有缓冲球的蒸馏器氨或胺最终都变成不挥发的盐类，用附有缓冲球的蒸馏器进行蒸馏，收集馏出液即可。进行蒸馏，收集馏出液即可。无氨蒸馏水制备无氨蒸馏水制备第26页，此课件共80页哦利利用用各各种种氨氨基基酸酸的的不不同同性性质质，使使用用阳阳离离子子交交换换树树脂脂在在色色谱谱柱柱上上进进行行分分离离。洗洗脱脱下下来来的的氨氨基基酸酸和和茚茚三三酮酮反反应应生生成成蓝蓝紫紫色色化化合合物物的的颜颜色色深深浅浅与氨基酸的含量成正比。与氨基酸的含量成正比。（三）氨基酸自动分析仪法（三）氨基酸自动分析仪法原理原理第27页，此课件共80页哦第28页，此课件共80页哦l水解：水解：准确称取固体样品准确称取固体样品50200mg，小心加，小心加入水解管中，加入入水解管中，加入6mol/LHCl10mL,酒精喷灯酒精喷灯封管后，置烘箱中于封管后，置烘箱中于110水解水解22-24小时。小时。（1 1）样品处理）样品处理操作步骤操作步骤第29页，此课件共80页哦封管的三种方式封管的三种方式：l液态氮冷冻后封管（注意：冷冻时不能将水解液态氮冷冻后封管（注意：冷冻时不能将水解管直接置液氮中，否则容易冻裂）管直接置液氮中，否则容易冻裂）l真空泵抽真空后封管（注意：如果真空泵抽力真空泵抽真空后封管（注意：如果真空泵抽力太大，则容易在封管过程中将软化的玻璃抽碎）太大，则容易在封管过程中将软化的玻璃抽碎）l氮吹仪吹氮气氮吹仪吹氮气15分钟后封管分钟后封管。第30页，此课件共80页哦l样品过滤和定容样品过滤和定容：水解后的样品取出冷却至室温，开水解后的样品取出冷却至室温，开管后过滤到管后过滤到25mL容量瓶中，水解管用去离子水洗涤容量瓶中，水解管用去离子水洗涤3次，次，洗涤液过滤到容量瓶中，用去离子水洗涤滤纸，洗涤洗涤液过滤到容量瓶中，用去离子水洗涤滤纸，洗涤液也收集到容量瓶中。定容。液也收集到容量瓶中。定容。l脱酸：脱酸：吸取样液吸取样液1-2mL，置真空脱酸仪上脱酸。温度，置真空脱酸仪上脱酸。温度60，脱至干燥，底部留有少许固体或痕渍为止。，脱至干燥，底部留有少许固体或痕渍为止。第31页，此课件共80页哦脱酸后的样品，加入脱酸后的样品，加入1-2mL蒸馏水溶解，蒸馏水溶解，置振荡混合器上混合均匀，针管吸取少置振荡混合器上混合均匀，针管吸取少量，通过量，通过0.45或或0.22m过滤器过滤后，上过滤器过滤后，上机分析。机分析。第32页，此课件共80页哦自动分析仪氨基酸分离图谱自动分析仪氨基酸分离图谱 （2 2）样品分析）样品分析第33页，此课件共80页哦测测量量峰峰高高或或用用峰峰高高乘乘以以半半峰峰宽宽确确定定峰峰面面积积计计算算出出氨氨基基酸酸的的精精确确含含量量。根根据据峰峰出出现现的时间可以确定氨基酸的种类。的时间可以确定氨基酸的种类。第34页，此课件共80页哦（一）概述（一）概述二、蛋白质的测定二、蛋白质的测定（1 1）蛋蛋白白质质是是生生命命的的物物质质基基础础，是是构构成成生生物物体体细细胞胞组组织织的的重重要要成成分分，是是生生物物体体发发育育及及修修补补组组织织的的原原料料，一一切切有有生生命命的的活活体体都都含有不同类型的蛋白质。含有不同类型的蛋白质。（2 2）人体的酸碱平衡、水平衡的维持；）人体的酸碱平衡、水平衡的维持；（3 3）遗传信息的传递；）遗传信息的传递；（4 4）物质的代谢及运转都与蛋白质有关。）物质的代谢及运转都与蛋白质有关。（5 5）人人及及动动物物需需要要从从食食品品得得到到蛋蛋白白质质及及其其分分解解产产物物，来来构构成成自身的蛋白质，是人体重要的营养物质；自身的蛋白质，是人体重要的营养物质；（6 6）衡量食品的重要营养指标。）衡量食品的重要营养指标。1.1.蛋白质的生理功用及在食品中的作用蛋白质的生理功用及在食品中的作用第35页，此课件共80页哦2.2.食品中的蛋白质含量食品中的蛋白质含量l动动物物性性食食品品：如如牛牛肉肉中中蛋蛋白白质质含含量量为为20.0%，猪猪肉肉中中为为9.5%，兔兔肉肉为为21%，鸡鸡肉肉为为20%，牛乳为牛乳为3.5%，黄鱼为黄鱼为17.0%，带鱼为，带鱼为18.0%l植植物物性性食食品品：大大豆豆为为40%，稻稻米米为为8.5%，面面粉粉为为9.9%，菠菠菜菜为为2.4%，黄黄瓜瓜为为1.0%，桃桃为为0.8%，柑柑橘橘为为0.9%，苹苹果果为为0.4%和和油油菜菜为为1.5%左右左右第36页，此课件共80页哦不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同。一般蛋白质一般蛋白质平均平均含氮量为含氮量为16%，即一，即一份氮素相当份氮素相当于于6.25份蛋白质，此数值（份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数）称为蛋白质系数。不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为，花生为5.46，大米，大米为为5.95，大豆及其制品为，大豆及其制品为5.71，小麦粉为，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为牛乳及其制品为6.38。第37页，此课件共80页哦3.3.蛋白质测定方法蛋白质测定方法 测定蛋白质的方法可分为两大类：测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量一类是利用蛋白质的共性，即含氮量 、肽、肽键和折射率测定蛋白质含量键和折射率测定蛋白质含量 ；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。量。第38页，此课件共80页哦具体测定方法具体测定方法凯氏定氮法：凯氏定氮法：最常用的，国内外应用普遍。最常用的，国内外应用普遍。快快速速测测定定法法：双双缩缩脲脲反反应应、Folin-酚酚法法、考考马马斯斯亮亮蓝蓝G250法法、紫外吸收法、紫外吸收法第39页，此课件共80页哦考考马马斯斯亮亮蓝蓝在在游游离离状状态态下下呈呈红红色色，当当其其与与蛋蛋白白质质结结 合合 后后 变变 为为 青青 色色，在在 一一 定定 范范 围围 内内（0-1000g/mL），颜颜色色的的深深浅浅与与蛋蛋白白质质含含量量成成正正比比，在波长在波长595nm下比色，测定吸光度。下比色，测定吸光度。此反应十分迅速，在此反应十分迅速，在1h内保持稳定，反应非常内保持稳定，反应非常灵敏。灵敏。原理原理（一）考马斯亮蓝法（一）考马斯亮蓝法 第40页，此课件共80页哦电子天平电子天平紫外紫外-可见分可见分光光度计光光度计仪器仪器第41页，此课件共80页哦试剂（1 1）牛血清白蛋白标准溶液）牛血清白蛋白标准溶液 （2 2）考马斯亮蓝考马斯亮蓝G G250250溶液：溶液：考马斯亮蓝考马斯亮蓝G G250250+乙醇乙醇+磷酸磷酸第42页，此课件共80页哦（1 1）标准曲线的绘制）标准曲线的绘制管号管号123456100g/mL牛血清牛血清白蛋白标准溶液的白蛋白标准溶液的量（量（mL）00.20.40.60.81蒸馏水的量（蒸馏水的量（mL）10.80.60.40.20.0蛋白质浓度蛋白质浓度（g/mL）020406080100测定步骤测定步骤 分别向各试管中，加入分别向各试管中，加入5mL考马斯亮蓝，盖塞，充分考马斯亮蓝，盖塞，充分混合，放置混合，放置2min，于，于595nm下比色，测定吸光度，以下比色，测定吸光度，以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线线。第43页，此课件共80页哦（2 2）样品处理）样品处理含水量少的固体样品粉碎，称取含水量少的固体样品粉碎，称取0.1000-0.2000g于离心管中，加蒸馏水于离心管中，加蒸馏水10mL；含水量多的固体样品加等量的水捣成匀浆，含水量多的固体样品加等量的水捣成匀浆，称取匀浆称取匀浆2-5g于离心管中，加蒸馏水于离心管中，加蒸馏水6mL；放置放置0.5-1h，以充分提取，而后离心，以充分提取，而后离心20min，上清液转入上清液转入10mL容量瓶中，定容。容量瓶中，定容。第44页，此课件共80页哦（3 3）测定）测定吸吸取取提提取取液液0.1mL，分分别别放放入入10mL具具塞塞试试管管中中，加加蒸蒸馏馏水水0.9mL，加加入入5mL考考马马斯斯亮亮蓝蓝，盖盖塞塞，充充分分混混合合，放放置置2min，于于595nm下下比比色色，测测定定吸吸光光度度，根根据据吸吸光光度度从从标标准准曲曲线线上上查查得得待待测测液中蛋白质含量。液中蛋白质含量。（4 4）做空白实验）做空白实验第45页，此课件共80页哦结果计算结果计算式中：式中：C-待测溶液的氨基酸含量（待测溶液的氨基酸含量（g）m-样品的质量（样品的质量（g）v1-样品溶液总体积（样品溶液总体积（mL）v2-测定用样品溶液的体积（测定用样品溶液的体积（mL）第46页，此课件共80页哦说明说明该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，测定蛋白质浓度范围为灵敏，测定蛋白质浓度范围为01000g/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。第47页，此课件共80页哦灵灵敏敏度度较较低低，但但操操作作简简单单快快速速，故故在在生生物物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法；化学领域中测定蛋白质含量时常用此法；本本法法亦亦适适用用于于豆豆类类、油油料料、谷谷类类等等作作物物种种子及肉类等样品测定。子及肉类等样品测定。方法特点及应用范围方法特点及应用范围（二）双缩脲法（二）双缩脲法 第48页，此课件共80页哦在碱性溶液中双缩脲在碱性溶液中双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)能与能与Cu2+生成紫红色的络合物，这一反应称生成紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应，蛋白质分子中的肽键也能与为双缩脲反应，蛋白质分子中的肽键也能与Cu2+发生双缩脲反应，溶液紫红色的深浅与发生双缩脲反应，溶液紫红色的深浅与蛋白质含量在一定范围（蛋白质含量在一定范围（110mg）内）内成正成正比，可用分光光度计在波长比，可用分光光度计在波长540nm来测其吸来测其吸光度，确定含量。光度，确定含量。原理原理第49页，此课件共80页哦2H2NCNH2H2NCNCNH2NH31320COOHO尿素尿素双缩脲双缩脲双缩脲双缩脲CuSO4+NaOH紫红色物质紫红色物质第50页，此课件共80页哦电子天平电子天平紫外紫外-可见分可见分光光度计光光度计仪器仪器第51页，此课件共80页哦 （1 1）双缩脲试剂）双缩脲试剂 :硫酸铜硫酸铜+酒石酸钾钠酒石酸钾钠+NaOH试剂试剂（2 2）0.05mol/L的的NaOH溶液溶液（3）5mg/mL标准酪蛋白溶液标准酪蛋白溶液第52页，此课件共80页哦（1 1）标准曲线的绘制）标准曲线的绘制 试剂试剂管号管号123456标准酪蛋白溶液标准酪蛋白溶液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（蒸馏水（mL）1.00.80.60.40.20双缩脲试剂（双缩脲试剂（mL）444444蛋白质含量（蛋白质含量（mg）01.02.03.04.05.0测定步骤测定步骤 振振荡荡15min，室室 温温 静静 置置30min，于于 波波 长长540nm下下比比色色，以以蛋蛋白白质质含含量量(mg)为为横横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。第53页，此课件共80页哦称称取取烘烘干干磨磨碎碎样样品品约约0.2000g，放放入入干干燥燥的的三三角角瓶瓶中中。然然后后加加入入5mL0.05mol/L的的NaOH溶溶液液湿湿润润，之之后后再再加加入入20mL的的双双缩缩脲脲试试剂剂，振振荡荡15min，室温静置反应，室温静置反应30min，过滤。，过滤。（2 2）样品处理）样品处理取滤液在取滤液在540nm波长下比色，在标准曲线上查波长下比色，在标准曲线上查出相应的蛋白质含量出相应的蛋白质含量(mg)。（3 3）样液测定）样液测定第54页，此课件共80页哦结果计算结果计算式中式中：C-从标准曲线上查出得相应的蛋白质含量从标准曲线上查出得相应的蛋白质含量(mg)m-样品的质量（样品的质量（g）第55页，此课件共80页哦1.1.三角瓶一定要干燥，勿使样品粘在瓶壁上。三角瓶一定要干燥，勿使样品粘在瓶壁上。2.2.所用酪蛋白需经凯氏定氮法确定蛋白质的含量。所用酪蛋白需经凯氏定氮法确定蛋白质的含量。3.3.此法简单、快速、有较好的精确度，分析对象较此法简单、快速、有较好的精确度，分析对象较广泛，但此法准确度稍低，有色物质、还原糖、淀广泛，但此法准确度稍低，有色物质、还原糖、淀粉、脂类等对本法测定谷物样品蛋白质含量干扰较粉、脂类等对本法测定谷物样品蛋白质含量干扰较大。大。说明与注意事项说明与注意事项第56页，此课件共80页哦l凯凯氏氏定定氮氮法法是是测测定定总总有有机机氮氮量量较较为为准准确确的的方方法法之之一一，故故国国内内外外应应用用较较为为普普遍遍，是是一一经经典典分析分析方法，至今仍方法，至今仍被作为标准检验方法。被作为标准检验方法。（三）（三）凯氏定氮法凯氏定氮法l食品中的含氮化合物大多以蛋白质为主体，所以食品中的含氮化合物大多以蛋白质为主体，所以检验食品中蛋白质时，往往测定总氮量，然后乘检验食品中蛋白质时，往往测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，即可得到蛋白质含量。凯氏以蛋白质换算系数，即可得到蛋白质含量。凯氏定氮法可用于所有动物性、植物性食品的蛋白质定氮法可用于所有动物性、植物性食品的蛋白质含量测定。含量测定。第57页，此课件共80页哦因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故通常将测定结果称为粗蛋白质含量。故通常将测定结果称为粗蛋白质含量。为什么凯氏定氮法测得的蛋白质含量为什么凯氏定氮法测得的蛋白质含量为粗蛋白含量？为粗蛋白含量？第58页，此课件共80页哦1.1.常量凯氏定氮法常量凯氏定氮法将将样样品品与与浓浓硫硫酸酸和和催催化化剂剂一一同同加加热热消消化化，使使蛋蛋白白质质分分解解，其其中中碳碳和和氢氢被被氧氧化化为为二二氧氧化化碳碳和和水水逸逸出出，而而样样品品中中的的有有机机氮氮转转化化为为氨氨，并并与与硫硫酸酸结结合合成成硫硫酸铵，此过程称为消化。酸铵，此过程称为消化。加加碱碱将将消消化化液液碱碱化化，使使氨氨游游离离出出来来，再再通通过过水水蒸蒸气气蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收形成硼酸铵。蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收形成硼酸铵。再再以以标标准准盐盐酸酸或或硫硫酸酸溶溶液液滴滴定定，根根据据标标准准酸酸消消耗量可计算出蛋白质的含量。耗量可计算出蛋白质的含量。原理原理第59页，此课件共80页哦 样品消化样品消化2NH2(CH)2COOH13H2SO4(NH4)2SO46CO212SO216H2O第60页，此课件共80页哦l浓硫酸具有脱水性，浓硫酸具有脱水性，有机物脱水后被炭化为有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮碳、氢、氮l浓硫酸又具有氧化性浓硫酸又具有氧化性，将有机物炭化后的碳氧，将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫2H2SO4C2SO22H2OCO2二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中性溶液中。HH2 2SO42NH33 (NH(NH4)2 2SO4第61页，此课件共80页哦 硫硫酸酸铜铜：起起催催化化剂剂的的作作用用。还还有有氧氧化化汞汞、汞汞、硒硒粉粉等等，但但考考虑虑到到效效果果、价价格格及及环环境境污污染染等等多多种种因素，应用最广泛的是硫酸铜。因素，应用最广泛的是硫酸铜。硫酸钾：硫酸钾：目的是为了提高溶液的沸点，加快有目的是为了提高溶液的沸点，加快有机物的分解机物的分解（纯硫酸沸点（纯硫酸沸点 340340，加入硫酸钾之，加入硫酸钾之后可以提高至后可以提高至400400以上。）以上。）。也可以加入硫也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。硫酸钾。在消化时常加入硫酸钾、硫酸铜等催化剂在消化时常加入硫酸钾、硫酸铜等催化剂第62页，此课件共80页哦蒸馏蒸馏2NaOH(NH4)2SO42NH3Na2SO42H2O 吸收与滴定吸收与滴定 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3第63页，此课件共80页哦适用范围适用范围此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定仪器仪器500mL凯氏烧瓶凯氏烧瓶；定氮蒸馏装置定氮蒸馏装置第64页，此课件共80页哦第65页，此课件共80页哦（1 1）浓硫酸浓硫酸（2 2）硫酸铜）硫酸铜（3 3）硫酸钾）硫酸钾 试剂试剂（4 4）40%氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液 （5 5）4%硼酸吸收液硼酸吸收液（6 6）0.1mol/LHCl标准溶液标准溶液（7 7）甲基红和溴甲酚氯混合指示剂）甲基红和溴甲酚氯混合指示剂1份份0.2%的的甲甲基基红红乙乙醇醇溶溶液液和和5份份0.2%溴溴甲甲酚酚氯氯乙乙醇醇溶溶液液混合。混合。第66页，此课件共80页哦称称 取取 固固 体体 样样 品品 0.20002.0000g（液液 体体 样样 品品1020mL，半半固固体体样样品品25g），小小心心放放于于500mL凯凯氏氏烧烧瓶瓶中中，加加入入研研细细的的硫硫酸酸铜铜0.5g，硫硫酸酸钾钾10g，浓浓硫硫酸酸20mL，轻轻轻轻摇摇匀匀，在在凯凯氏氏瓶瓶口口盖盖一一小小漏漏斗斗，斜斜放放于于电电炉炉上上小小火火加加热热(在在通通风风橱橱内内加加热热消消化化),待待内内容容物物全全部部炭炭化化，泡泡沫沫停停止止产产生生后后，加加大大火火力力，保保持持瓶瓶内内液液体体微微沸沸，至至液液体体变变为为透透明明的的蓝蓝绿绿色色后后，再再继继续续加加热热微微沸沸30min，冷冷却却。加加入入200mL蒸蒸馏馏水水，加加入入玻玻璃璃珠数粒。珠数粒。测定步骤测定步骤（1 1）样品消化）样品消化第67页，此课件共80页哦 将凯氏烧瓶连接好，塞紧瓶口，冷凝管下端将凯氏烧瓶连接好，塞紧瓶口，冷凝管下端插入接收瓶液面以下，接收瓶内预先装有插入接收瓶液面以下，接收瓶内预先装有50mL4%硼酸溶液和硼酸溶液和23滴混合指示剂，放松滴混合指示剂，放松夹子，通过漏斗加入夹子，通过漏斗加入7080mL40%氢氧化钠氢氧化钠溶液并摇动凯氏烧瓶，瓶内溶液变为溶液并摇动凯氏烧瓶，瓶内溶液变为深蓝色，深蓝色，或产生黑色沉淀或产生黑色沉淀，再从漏斗加入，再从漏斗加入100mL蒸馏蒸馏水，夹紧夹子，加热蒸馏，至氨全部蒸出水，夹紧夹子，加热蒸馏，至氨全部蒸出（馏出液约为（馏出液约为250mL），将冷凝管下端提离），将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸馏液面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸馏1min，用表面皿接几滴溜出液，用表面皿接几滴溜出液，用奈氏试剂检查，用奈氏试剂检查，如无红棕色物质生成，表示蒸馏完毕。如无红棕色物质生成，表示蒸馏完毕。（2 2）蒸馏、吸收）蒸馏、吸收第68页，此课件共80页哦将将上上述述吸吸收收液液用用0.1mol/LHCl标标准准溶溶液液滴滴定定，至至溶溶液液由由蓝蓝绿绿色色变变为为紫紫红红色色即即为为滴滴定定终终点点，记记录录消消耗耗HCl标准溶液的体积。标准溶液的体积。（3 3）滴定）滴定（4 4）做空白实验）做空白实验第69页，此课件共80页哦式中式中:c盐酸标准液的浓度盐酸标准液的浓度(mol/L)V0空白滴定消耗标准液量空白滴定消耗标准液量(mL)V1试剂滴定消耗标准液量试剂滴定消耗标准液量(mL)m样品质量样品质量(g)0.014氮的毫摩尔质量氮的毫摩尔质量(g/mmol)6.25蛋白质蛋白质换算换算系数。系数。结果计算结果计算第70页，此课件共80页哦1.1.所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。2.2.消消化化时时不不要要用用强强火火，注注意意不不断断转转动动凯凯氏氏烧烧瓶瓶，以以便便利利用用冷冷凝凝酸酸液液将将附附在在瓶瓶壁壁上上的的固固体体残残渣渣洗洗下下并促进其消化完全。并促进其消化完全。3.3.样样品品中中若若含含脂脂肪肪或或糖糖较较多多时时，消消化化过过程程中中易易产产生生大大量量泡泡沫沫，为为防防止止泡泡沫沫溢溢出出瓶瓶外外，在在开开始始消消化化时时应应用用小小火火加加热热，并并不不断断摇摇动动；或或者者加加入入少少量量辛辛醇醇或或液液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。说明及注意事项说明及注意事项第71页，此课件共80页哦4.4.当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入冷却，加入30过氧化氢过氧化氢23mL后再继续加热消后再继续加热消化。化。5 5.若若取取样样量量较较大大，如如干干试试样样超超过过5g，可可按按每每克克试试样样5mL的比例增加硫酸用量。的比例增加硫酸用量。6.6.一一般般消消化化至至呈呈透透明明后后，继继续续消消化化30min即即可可，但但对对于于含含有有特特别别难难以以氨氨化化的的氮氮化化合合物物的的样样品品，如如含含赖赖氨氨酸酸、组组氨氨酸酸、色色氨氨酸酸、酪酪氨氨酸酸或或脯脯氨氨酸酸等等时时，需需适适当当延延长长消消化化时时间间。有有机机物物如如分分解解完完全全，消消化化液液呈呈蓝蓝色色或或浅浅绿绿色色，但但含含铁铁量量多多时时，呈较深绿色。呈较深绿色。第72页，此课件共80页哦7.7.蒸馏装置不能漏气。蒸馏装置不能漏气。8.8.蒸蒸馏馏前前若若加加碱碱量量不不足足，消消化化液液呈呈蓝蓝色色不不生生成成氢氢氧氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。9.9.硼硼酸酸吸吸收收液液的的温温度度不不应应超超过过40，否否则则对对氨氨的的吸收作用减弱而造成损失。吸收作用减弱而造成损失。10.10.蒸蒸馏馏完完毕毕后后，应应先先将将冷冷凝凝管管下下端端提提高高液液面面清清洗洗管管口口，再再蒸蒸溜溜lmin后后关关掉掉热热源源，否否则则可可能能造造成成吸吸收液倒吸现象。收液倒吸现象。第73页，此课件共80页哦2.2.微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法 凯氏烧瓶凯氏烧瓶(100ml)(100ml)微量凯氏定氮装置微量凯氏定氮装置原理原理:同常量定氮法同常量定氮法仪器仪器第74页，此课件共80页哦（1）0.01mol/L盐酸标准溶液盐酸标准溶液（2）2%硼酸吸收液硼酸吸收液其他试剂同常量凯氏定氮法其他试剂同常量凯氏定氮法 试剂试剂第75页，此课件共80页哦（1 1）样品消化）样品消化测定步骤测定步骤称称取取固固体体样样品品0.20000.5000g（液液体体样样品品1020mL，半半固固体体样样品品25g），小小心心放放于于100mL凯凯氏氏烧烧瓶瓶中中，加加入入研研细细的的硫硫酸酸铜铜0.3g，硫硫酸酸钾钾0.9g，浓浓硫硫酸酸15mL，轻轻轻轻摇摇匀匀，在在凯凯氏氏瓶瓶口口盖盖一一小小漏漏斗斗，斜斜放放于于电电炉炉上上小小火火加加热热，待待内内容容物物全全部部炭炭化化，泡泡沫沫停停止止产产生生后后，加加大大火火力力，保保持持瓶瓶内内液液体体微微沸沸，至至液液体体变变为为透透明明的的蓝蓝绿绿色色后后，再再继继续续加加热热微微沸沸30min，冷冷却却，完完全全转转入入100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。第76页，此课件共80页哦清清洗洗仪仪器器：在在水水蒸蒸汽汽发发生生器器中中加加约约2/3体体积积的的蒸蒸馏馏水水，加加甲甲基基橙橙指指示示剂剂数数滴滴及及硫硫酸酸数数毫毫升升，以以保保持持水水呈呈酸酸性性，加加数数粒粒玻玻璃璃珠珠，安安装装好好微微量量定定氮氮装装置置，打打开开漏漏斗斗下下夹夹子子，加加热热至至水水沸沸腾腾，使使蒸蒸汽汽通通入入仪仪器器的的每每个个部部分分，达达到到清清洗洗的的目目的的，在在冷冷凝凝管管下下端端放放置置一一三三角角瓶瓶接接冷冷凝凝水水，然然后后，夹夹紧紧漏漏斗斗下下的的夹夹子子，再再冲冲洗洗5min，冲冲洗洗完完毕毕，夹夹紧紧蒸蒸汽汽发发生生器器和和收收集集器器间间的的连连接接橡橡皮皮管管，蒸蒸馏馏瓶瓶中中的的废废液液由由于于减减压压倒倒吸吸到到收收集集器器中中，打打开开收收集集器器下下端端的的活活塞塞排排除除废废液，如此清洗液，如此清洗23次。次。（2 2）蒸馏、吸收）蒸馏、吸收第77页，此课件共80页哦蒸馏、吸收：蒸馏、吸收：取消化稀释液取消化稀释液10mL10mL由进样漏斗由进样漏斗进入反应室，以少量水冲洗进样漏斗，并进入反应室，以少量水冲洗进样漏斗，并流入反应室。再从进样口加入流入反应室。再从进样口加入l0mL 40%l0mL 40%氢氢氧化钠溶液使呈强碱性，用少量蒸馏水洗氧化钠溶液使呈强碱性，用少量蒸馏水洗进样漏斗数次，夹好漏斗夹，进行水蒸汽进样漏斗数次，夹好漏斗夹，进行水蒸汽蒸馏。冷凝管下端预先插入盛有蒸馏。冷凝管下端预先插入盛有20mL 2%20mL 2%硼硼酸吸收液和酸吸收液和2323滴混合指示剂的液面下。滴混合指示剂的液面下。蒸馏至吸收液中由紫红色变为蓝绿色时，继蒸馏至吸收液中由紫红色变为蓝绿色时，继续蒸馏续蒸馏10min10min后，将冷凝管下端提离液面再后，将冷凝管下端提离液面再蒸馏蒸馏lminlmin，用蒸馏水冲洗冷凝管下端后停，