游离dna提取原理和方法.ppt

关于游离关于游离DNA提取原提取原理和方法理和方法现在学习的是第1页，共12页l游离游离DNADNA介绍介绍l提取提取原理原理l提取提取流程流程l各缓冲液介绍各缓冲液介绍现在学习的是第2页，共12页血中游离DNA简称循环核酸指循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA。游离DNA大部分都是双链DNA分子，血中游离DNA片段远小于基因组DNA，片段长度集中在0.1821kb之间。疾病的早期诊断，预后，检测。游离游离DNA介绍介绍现在学习的是第3页，共12页提取提取DNADNA总的原则总的原则:1 保证核酸一级结构的完整性；2 其他生物大分子的污染应降低到最低程度；3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。现在学习的是第4页，共12页l方法比较方法比较现在学习的是第5页，共12页现在学习的是第6页，共12页破坏红细胞破坏红细胞,通常利用红细胞与白细胞膜结构的差异通常利用红细胞与白细胞膜结构的差异,先使红细先使红细胞裂解胞裂解,经离心后收集白细胞经离心后收集白细胞白细胞裂使膜蛋白和核蛋白变性白细胞裂使膜蛋白和核蛋白变性,游离游离DNA,通常是采用离通常是采用离子型表面活性剂使蛋白质变性子型表面活性剂使蛋白质变性除去变性蛋白质：通常采用蛋白沉淀剂沉淀变性蛋白质除去变性蛋白质：通常采用蛋白沉淀剂沉淀变性蛋白质,使使DNA留在上清液中留在上清液中在高盐环境下使在高盐环境下使DNA从有机溶剂如无水乙醇中析出从有机溶剂如无水乙醇中析出l原理原理本试剂盒采用离心吸附柱和缓冲液系统。样品裂解后，DNA在高盐条件下与硅胶膜结合，在低盐，高PH值时从硅胶膜上洗脱下来。现在学习的是第7页，共12页外周血外周血细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液血清血清抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液l提取流程提取流程现在学习的是第8页，共12页l各缓冲液介绍各缓冲液介绍现在学习的是第9页，共12页2.SDS：十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠3.Tris-HCl和和NaCl：缓冲液缓冲液4.EDTA 作用：细胞裂解时作用：细胞裂解时,调节溶液的调节溶液的PH,维持一定的离子浓度维持一定的离子浓度作用：作用：a.溶解细胞膜、核膜上脂质成分溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.使蛋白质变性，与蛋白质结合成为复合物而沉淀下来使蛋白质变性，与蛋白质结合成为复合物而沉淀下来 作用：是二价金属螯合剂，使影响作用：是二价金属螯合剂，使影响DNA的的DNA酶中的钙离子和镁离子和酶中的钙离子和镁离子和EDTA结合结合,使酶失去活性使酶失去活性,有利于提取完整有利于提取完整DNA。1.Proteinase K:作用：能在作用：能在SDS和和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白的存在下保持很高的活性，降解蛋白质，将质，将DNA游离游离 l主要试剂介绍主要试剂介绍5.酒精酒精 作用：任意比和水相混溶，夺去作用：任意比和水相混溶，夺去DNA周围的水分子，使周围的水分子，使DNA失水而易于聚合失水而易于聚合现在学习的是第10页，共12页1.DNA 以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。不存在金属离子的干扰，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定 DNA的保存的保存 ：吸附柱吸附柱 ：结构：特殊硅基质吸附材料，特异性吸附DNA，而RNA与蛋白质穿过。特点：高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。现在学习的是第11页，共12页感谢大家观看现在学习的是第12页，共12页