五芝液抗肿瘤作用的药理研究624.pdf

第 1 页 一、五芝液体内抗肿瘤作用与免疫调节作用 20 世纪 70 年代，日本学者最先发现灵芝提取物和灵芝多糖体内给药对动物移植性肿瘤有显著的抑制作用，并提出灵芝的抗肿瘤作用是“宿主中介性的”，可能是通过增强机体的免疫功能而实现的。经一系列研究证明：灵芝提取物及其所含多糖肽灌胃可抑制小鼠移植性肿瘤 S180、人肺癌（PG）、Lewis 肺癌的生长，但直接加到体外培养的 S180 或人白血病细胞的培养液中，对肿瘤细胞生长无抑制作用。提示灵芝制剂在体内抑制肿瘤生长的作用确实是“宿主中介性的”，增强机体的抗肿瘤免疫力可能是其中重要的一环。随后的研究证明，灵芝多糖肽可直接作用于单核巨噬细胞、树突状细胞和细胞毒 T-细胞，增强其功能。促进 TNF-mRNA 和 IFN-mRNA 表达，增加 TNF-和 IFN-生成，也促进 IL-1 和 IL-6等细胞因子生成，增强细胞因子的活性，从而抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，最终杀死肿瘤细胞。在小鼠骨髓来源的树突状细胞（DC）体外培养体系中，加入灵芝多糖 Gl-PS（0.8、3.2 或 12.8g/ml）可明显促进 DC 表面 DC11c第 2 页 及 I-A/I-E 分子的共表达、明显增加 IL-12 40 亚基 mRNA 和蛋白表达、促进 DC 诱导的混合淋巴反应（MLC），表明灵芝多糖能促进 DC 的成熟、分化和功能。在经 P815 肿瘤细胞裂解物冲击致敏小鼠骨髓来源的 DC 诱导产生的特异性细胞毒 T 淋巴细胞（CTL）模型，在冲击致敏阶段与不同浓度的灵芝多糖（Gl-PS）共培养，收集 CTL 及细胞培养上清液，以释放入 CTL 与 P815 肿瘤细胞共培养体系细胞培养上清液中的乳酸脱氢酶（LDH）活性代表 CTL的特异性杀伤活性；同时用 RT-PCR 法检测 CTL 中 IFN-及颗粒酶 B 的 mRNA 表达；用 ELISA 法检测细胞培养上清液中 IFN-蛋白含量；用 Western Blot 法检测 CTL 表达的颗粒酶 B 的蛋白含量。结果显示：当 DC 经 P815 肿瘤细胞冻融抗原冲击致敏后，其诱导产生的 CTL 对 P815 肿瘤细胞具有杀伤作用，灵芝多糖（Gl-PS）（0.8、3.2 或 12.8g/ml）可增强此作用，使释放入培养上清液中的 LDH 活性显著增强。进一步研究发现，同上浓度的灵芝多糖可明显增加 DC 诱导 CTL 的 IFN-蛋白含量增加。上述浓度的灵芝多糖还可明显增加 DC 诱导的 CTL 的颗粒酶 BmRNA 及蛋白表第 3 页 达。这些结果提示，灵芝多糖在 DC 成熟阶段，增强 DC 对肿瘤抗原的捕获、处理、递呈能力，增强DC 诱导的特异性 CTL 的细胞毒活性。而灵芝多糖促进活化 CTL 的 IFN-mRNA 转录及蛋白表达，使 IFN-生成增加，后者通过其直接和间接作用发挥抑瘤作用。颗粒酶参与促进 CTL 及 NK 细胞介导的细胞凋亡。颗粒酶家族中，以颗粒酶B功能最强。灵芝多糖促进CTL的颗粒酶B mRNA和蛋白质表达，与其增强 CTL 的细胞毒活性有关。二、五芝液中灵芝多糖增强细胞因子诱导的杀伤细胞活性 继应用淋巴因子活化的杀伤细胞（LAK 细胞）于肿瘤的过继免疫治疗之后，将人外周血淋巴细胞在体外与多种细胞因子共培养后，获得一群异质细胞即细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK），具有增值力强、杀瘤活性高、杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感等特点，且明显优于 LAK 细胞，比 LAK 细胞更适合于肿瘤的过继免疫治疗。是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。有研究者按常规方法制备小鼠的 CIK 细胞小鼠脾细胞培养中加入 IFN-（1000kU/L）、抗 CD3 单抗（50mg/L）、IL-2（300Ku/L）和 IL-1(100Ku/L)，当培养中加入灵芝多糖（Gl-PS）（100 和第 4 页 400g/ml）后，可明显降低 CIK 细胞培养中的白介素-2（IL-2）和抗 CD3 单抗的用量（分别为未加灵芝多糖的对照组的75%和50%）。但与对照组相似，能诱导和大量扩增 CIK 细胞，且此 CIK细胞在体外杀伤 YAC-1 和 P815 肿瘤细胞的杀伤率亦与常规对照组无明显差异。同样将此 CIK 细胞静脉输注给荷 S180 或荷 H22肝肉瘤小鼠后，其体内抗肿瘤疗效与常规 CIK 细胞治疗组比较亦无差异。研究者还发现，灵芝多糖在降低抗 CD3 单抗和 IL-2 用量50%和75%的条件下，能促进CIK细胞颗粒酶B以及穿孔素mRNA和蛋白的表达。这表明灵芝多糖通过增加颗粒酶 B 和穿孔素的表达，从而增强 CIK 细胞杀伤肿瘤细胞的活性。研究者的试验还证明，淋巴细胞表面的补体 3 型（CR3）受体介导灵芝多糖对 CIK细胞的作用。关于免疫细胞上灵芝多糖作用的受体还有一些研究。Chen 等研究发现，灵芝多糖（F3）结合巨噬细胞膜上 TLR 受体后，通过蛋白酪氨酸激酶 PTK/PLCl/蛋白激酶 C（PKC）/丝裂原激活的蛋白激酶 1(MEK1)/胞外信号调节激酶(ERK)，第 5 页 PTK(Sac)/Racl/PAK/p38和 PIK/Racl/PAK/JNK 信号转导途径，诱导细胞因子 IL-1 产生。具有（1-6）-D-葡聚糖分支结构的灵芝多糖 PSG（10g/ml）能够促进人单核细胞来源的树突状细胞（DC）表达 CD80、CD86、CD83、CD40、CD54、人白细胞抗原（HLA）-DR,以及 IL-12、IL-10蛋白及其 mRNA，抑制 DC 的内吞活性；此外，经 PS-G 作用后的DC 细胞刺激 T 细胞的活性增强，促进 T 细胞分泌 IFN-、IL-10。抗 TLR4 抗体中和实验表明，抗 TLR4 抗体可抑制 PS-G 诱导的IL-12、IL-10 的分泌，提示 PS-G 作用于 DC 的信号通路中，TLR4发挥了关键作用。一项研究表明，荧光胺标记的黄芪多糖（fl-APS）以 TLR4 依赖方式结合人和小鼠的巨噬细胞，流式细胞仪检测显示分子量为5.849X105的灵芝多糖（Gl-PS）可竞争性地抑制 fl-APS 和小鼠腹腔巨噬细胞的结合，提示 Gl-PS 能够结合巨噬细胞膜表面的TLR4 受体。进一步研究证明，GL-PS 诱导 Bal b/c 小鼠腹腔巨噬细胞产生 IL-1，但不能刺激 C3H/HeJ 小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1，而 IFN-仍可刺激 IL-1的分泌；由于 C3H/HeJ 小鼠第 6 页 的TLR4基因有一个碱基突变导致TLR4受体胞浆区一个氨基酸由脯氨酸突变导致 TLR4 受体胞浆区一个氨基酸由脯氨酸突变成组氨酸，使 TLR4 丧失信号转导功能。因此提示 GL-PS 可能通过 TLR4激活巨噬细胞。另外，发现兔抗小鼠 Ig 抗体明显抑制 Gl-PS 诱导的小鼠脾细胞增殖（Gl-PS 可显著促进纯化的小鼠 B 细胞而非T 细胞增殖），而对照正常兔 IgG 则无此作用。抗小鼠 Ig 抗体浓度即使达到 30g/ml，对 ConA 诱导的脾细胞增殖没有显著影响，结果说明小鼠 B 细胞膜表面 Ig 分子参与 Gl-PS 对 B 细胞的活化过程，为 B 细胞表面 Gl-PS 受体分子之一。比较 Bal b/c 和C3H/HeJ 小鼠脾细胞对 Gl-PS 的反应性，发现与 LPS 类似，Gl-PS可明显刺激 Bal b/c 小鼠脾细胞增殖，但对 C3H/HeJ 小鼠脾细胞无刺激作用，表明 TLR4 参与 Gl-PS 对小鼠 B 细胞的活化过程，介导 Gl-PS 促进 B 细胞的增殖作用。这些结果说明 TLR4 是 B 细胞和巨噬细胞表面重要的 Gl-PS 受体分子。三、五芝液中灵芝成分抑制体外培养的肿瘤细胞增殖及其机制 近十余年发现灵芝及其有效成分对体外培养的肿瘤细胞具有抑制作用。如发现灵芝（赤芝、紫芝、松杉灵芝）子实体提取物抑第 7 页 制体外培养的人乳腺癌细胞 MCF-7、MDA-MB-231 增殖；灵芝提取物 GLE-1（主要含多糖）和 GLE-2（主要含三萜类）抑制人结肠癌细胞 SW480 增殖，且后者的作用强于前者。从灵芝子实体中提取的三种羊毛甾烷型三萜 lucialdehydeA-C，其中 lucialdehydeB 和 C 对 Lewis 肺肉瘤（LLC）、T47D、S180和 Meth-A 肿瘤细胞株具有细胞毒作用。lucialdehydeC 对试验细胞株的细胞毒性最强，对 LLC、T47D、S180 和 Meth-A 这 4 种肿瘤细胞的 ED50为 10.7、4.7、7.1 和 3.8g/ml。一项研究是观察富含三萜组分的灵芝提取物对 26 种人癌细胞株的抗增殖活性，结果发现 6 种造血细胞株最敏感，其 ED50（g/ml）分别为：HL-60（26）、U937（63）、K562（50）、Blin-1（38）、Nalm-6（30）和 RPMI8226（40）。细胞周期分析显示肿瘤细胞生长停止在 G2期或 M 期，以 HL-60 细胞最为明显。其中 4 种造血细胞株（HL-60、Blin-1、U937 和 RPMI8226）可见 21%-92%的细胞凋亡。在灵芝提取物作用下，HL-60 细胞变成多核细胞，且其DNA 含量增加。结果指出，富含三萜组分的灵芝提取物对白血病、淋巴癌、多发性骨髓瘤有明显抑制作用。第 8 页 灵芝孢子粉的乙醇提取物和显著抑制Hela 细胞生长。提取物能阻断细胞周期从 G1期 S 期的转变，并使细胞内钙水平显著降低。提示提取物可能通过影响细胞周期和细胞内钙信号转导而抑制肿瘤细胞生长。从灵芝菌丝中制备的富含三萜组分 WEES-G6 在体外可抑制人肉瘤 Huh-7 细胞生长。用 WEES-G6 处理细胞可是细胞生长调节蛋白PKC 的活性降低，并抑制 p38MAP 激酶的活化，并因此延长细胞周期的 G2期，抑制肝肉瘤细胞生长。灵芝乙醇提取物可剂量和时间依赖性地抑制 MCF-7 肿瘤细胞增殖，这可能与其上调 p21/Waf1 和下调 cyclin D1有关。此外，它还可通过上调前凋亡蛋白 Bax 诱导 MCF-7 细胞凋亡。从鹿角灵芝提取的一种四环三萜Ganoderiol F（GolF）可诱导高度增殖的肿瘤细胞株老化，使 HepG2、Huh7 和 K562 肿瘤细胞生长停止，但对肝肉瘤 Hep3B 和正常成纤维细胞 MRC5 仅具非常弱的作用，而对末梢血单核细胞无作用。除Hep3B 外，用 GolF处理体外培养的癌细胞，导致 DNA 合成迅速抑制，细胞周期停止进行，然而，在与药物作用 24 小时后，洗去培养液中的药物，第 9 页 HepG2 细胞生长仍可恢复。用 30mol/L GolF 连续处理 HepG2细胞 18 天之后，可见超过 50%的细胞变大、变平，老化细胞呈现-半乳糖苷酶阳性。GolF 在体外可抑制拓扑异构酶，这可能与其抑制细胞 DNA 合成有关。在 GolF 处理的早期，可见丝裂原活化的蛋白激酶 EKR 活化以及上调周期素（cyclin）依赖的蛋白激酶抑制因子 p16，推测这与引起细胞周期停滞以及触发HepG2细胞早老有关。GolF 引起肿瘤细胞生长停滞和老化提示它有潜在的抗肿瘤作用。鹿角灵芝的甲醇提取物抑制人肝肉瘤 HuH-7 细胞、结肠肉瘤HCT-116 细胞、Burkitts 淋巴瘤 Raji 细胞和人急性白血病细胞（HL-60）的生长，半数抑制浓度（IC50）为 82.2-135.3g/ml。一些成分在体外还能抑制拓扑异构酶和的活性。其中最强的是羊毛甾烷三萜类的灵芝酸 X（GAX；3-hydroxy-15-acetoxy-lanosta-7，9（11），24-trien-26-oic acid），GAX对 HuH-7、HCT-116、Raji、HL-60 细胞的 IC50分别为 20.3g/ml、38.3g/ml、39.2g/ml 和 26.5g/ml。用 GAX 处理人肝肉瘤HuH-7 细胞立即引起 DNA 合成抑制，也抑制 ERK 和 JNK 丝裂原-第 10 页 活化蛋白激酶的活化，并诱导细胞凋亡。初步实验结果提示，GAX诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制与其促使染色体DNA 断裂、降低Bcl-xL 水平、使线粒体膜破裂、促使细胞质中细胞色素 C 释放和 caspase-3 活化有关。该作者认为，GAX 抑制拓扑异构酶及使敏感细胞凋亡与其抗肿瘤作用有关。最近发现，灵芝三萜提取物（GLT）抑制体外培养的人结肠癌细胞 HT-29 增殖，并抑制裸鼠移植性结肠肿瘤的生长。GLT 的这些作用与细胞周期的 G0/G1期相阻滞及诱导结肠癌细胞型自吞噬（autophagy）程序死亡有关。研究者发现，GLT 诱导结肠癌细胞中出现自吞噬空泡，并上调 Beclin-1 表达（增加 1.3 倍）以及 LC-3 蛋白表达（增加 7.3 倍），移植性结肠肿瘤模型裸鼠Beclin-1 增加 3.9 倍，LC-3 增加 1.9 倍。自吞噬是由 p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）被抑制而产生，p38MAPK 抑制剂SB202190 可引起癌细胞自吞噬，并使 Beclin-1 和 LC-3 表达分别增加 1.2 倍和 7.4 倍。GLT 抑制结肠癌细胞 P38MAPK 磷酸化可达 60%。第 11 页 通过用流式细胞仪测量细胞活力、细胞周期。用 DNA 断裂定量检测细胞凋亡，用 Western-blot 法检测细胞内凋亡蛋白和激酶的变化，研究灵芝子实体提取物和甲醇提取物经柱层析半纯化的组分诱导 NB4 人白血病细胞的毒性及凋亡作用。结果可见，灵芝子实体提取物稍微降低 NB4 细胞活力的诱导 NB4 细胞的 DNA 断裂。甲醇提取物半纯化组分在稀释到 15%或 40%浓度时，显著降低 NB4白血病细胞的活力并伴随诱导 DNA 断裂和细胞凋亡。其 E3 组分稀释到 15%的初始浓度引起与 Bcl-2/Bax 相关的 p53 基因水平降低，以及非磷酸化和磷酸化 Akt（蛋白激酶 Akt，蛋白激酶 B）与 ERK(ERK1、2)两者水平降低。表明灵芝的活性组分可引起人白血病细胞凋亡并使信号转导激酶（Akt 和 ERK）变化。灵芝乙醇提取物（EGL）处理可剂量依赖性地引起人胃癌细胞 AGS的活率显著降低，在细胞活率降低的同时，可见 AGS 细胞中染色质凝聚以及凋亡碎片聚集，即 EGL 引起 AGS 细胞凋亡。EGL 处理可引起死亡受体相关蛋白，如死亡受体 5 以及 TNF 相关凋亡诱导配体的表达，它们再进一步激活 caspase-8 活化和 Bid 分裂。此外，EGL 处理细胞中，EGL 诱导的调往增加与激活 caspase-9 和第 12 页 caspase-3，下调 IAP 家族蛋白如 XIAP 和存活素以及相伴的多ADP 核糖聚合酶降解有关。而且，EGL 处理细胞中 Akt 活性也下调，磷脂酰肌醇-3 激酶/Akt 抑制剂 LY294002 增加 AGS 细胞对EGL 诱导的凋亡的敏感性。结果指出，EGL 诱导的 AGS 细胞凋亡是通过死亡受体介导的外在信号级联放大以及线粒体介导的内在级联放大途径而实现的，也与 Akt 信号通路失活有关。