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His 蛋白纯化原理方法和问题分析 Revised by Liu Jing on January 12,2021 组氨酸(His)标签蛋白的纯化 His-Tag 融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱（IMAC）纯化。IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是 Porath et al.1975 年用固定 IDA 作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987 年 Smith et al.发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的 IDA-sephadex G-25 作用力更强，此前在 1986 年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25 亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年 1987 年 Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和 Ni2+-NTA 填料作用力更强于普通的肽，1988 年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合 IMAC 变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合 IMAC 纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。1986 年 Porath et al.还发现 Fe3+-IDA-sephadex G-25 可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现 Ga3+-IDA 也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时 IMAC 也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。Ni 柱中的氯化镍可以与有 HIs（组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合。步骤是：过柱子前可以选择 Ni 柱重生，也就是往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行了，然后平衡柱子，拿你自己的 buffer，给蛋白提供最适的环境，我一般平衡 4 个柱长，然后蛋白上样，你可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加个恒流泵，但是一定不能太快，太快挂柱效果差，当然你也可以选择循环挂柱，就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。挂完之后，按理想来讲，你的蛋白在 Ni 柱中与 Ni 就结合了，杂蛋白多数在烧杯里，留下来了，当然肯定有少量杂蛋白也挂上了，这时候你要，拿咪唑和你的 buffer 配，一般从 0 20mM 40mM。100mM这样洗脱（当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候）我指的是咪唑的终浓度。咪唑加入之后，会和蛋白争夺与 Ni 的结合位点，杂蛋白、你的目的蛋白，会在不同的浓度被洗脱下来，洗完之后，你可以用400mM 咪唑洗柱子，清理一切蛋白，然后平衡几次，是否选择重生你自己定咯然后放上 20%乙醇保存柱子就可以咯过的蛋白用不同的管子收下，然后 SDS-page 检测在哪个管子里。市面常见的商品化 IMAC 用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种：一、组氨酸(His)标签蛋白的纯化步骤：大肠杆菌的破碎方法：1）收集培养发酵液，4 度 7000-8000g 离心 10 分钟，收集沉淀的菌体(如果不是马上破碎可以放-70 度冷冻，但是最好能保存成小块或者薄片，这样好用。)2）取 1-2 克菌体加 10ml 破碎缓冲液（pH7.4 的 50mM 磷酸缓冲液含0.5M NaCl，0.5mg/ml 溶菌酶，1mM PMSF，1mM MgCl2，1.7units/ml Benzonase,其中的菌酶，1mM PMSF，1.7units/ml Benzonase 现加）在冰上混合 45 分钟，如果 pH 不在 7-8，需要用 0.5M NaOH 一边搅拌一边滴加.如果溶菌酶 10mg/ml 混合时间可以缩短到 10 分钟.3）把混合菌体在冰水中用超声探头破碎 20 秒种,总共四次,中间间隔要保持 2 分钟冷却破碎液,检测 pH,如果不在 7-8,还是用 0.5M NaOH 一边搅拌一边滴加去调.如果菌体的为 50-500 克,可以高压破碎的方法,缓冲液同上,体积为 1 升,破碎三次,压力为 800 bar.4）破碎的液 4 度 12000g 离心 10 分钟，如果要让溶液更澄清，可以 4度 50000g 离心 30 分钟，这时候可以把上清和沉淀分别留样，跑电泳，如果只沉淀中有目标蛋白，那就用变性条件下去提取。1.大肠杆菌的破碎离心的上清加 2M 咪唑溶液 0.12ml 使终浓度为 20mM，样品的总体积为 10ml。2.过柱子的样品最好过 0.45m 的滤膜，避免堵柱。3.可溶性蛋白的纯化：1）平衡缓冲液：pH7.4 的 50mM 磷酸缓冲液含 0.5M NaCl，含 20mM 咪唑。2）洗脱缓冲液：pH7.4 的 50mM 磷酸缓冲液含 0.5M NaCl，含 500mM 咪唑。3）取 1ml 镍琼脂糖凝胶 FF 或镍 NTA 琼脂糖凝胶 FF 预装柱，用 10ml 平衡缓冲液平衡，然后取破碎上清 10ml 样品以 0.5ml/min 上样，然后 2ml/管分管收集。4）用 15ml 平衡缓冲液洗去未吸附的样品，流速 1-2ml/min，2ml/管收集。5）用 5 ml 洗脱缓冲液洗去未吸附的样品，流速 1-2ml/min，2ml/管收集。6）再用 5ml 平衡缓冲液平衡柱子，灌满 20%乙醇，封闭，以备下次使用。7）此方法是通用的方法，但是未必能得到适合自己蛋白的满意效果，所以优化的办法是洗脱可以用 50mM，100mM，300mM，500mM 分阶段洗脱，各洗脱 5 个柱体积，这样配合电泳检测，得到适合自己的蛋白的条件。8）收集的部分可以用紫外分光光度法、BCA 法或用考玛斯亮蓝法测定蛋白的浓度，再取有蛋白的部分电泳检测纯度。二、常见问题及解决方法 1.不溶解或沉淀在柱子上：要留意缓冲液体的 pH，此外在样品中添加一些表面活性剂甚至乙醇等有机溶剂可以增加疏水性蛋白的溶解度，对于带半胱氨酸多的蛋白很容易氧化聚集沉淀，所以需要加 2-5mM 巯基乙醇避免沉淀。2.白不吸附：这是最常见的，通常的原因有：1 是标签不暴露，被折叠在蛋白的结构内，可以在变性的条件下去纯化，如果用脲变性吸附不好，可以改用盐酸胍，个人经验是这样通常可以使吸附不上的蛋白得到改善，顺利纯化。2 可以选择作用力更强，配基密度更高的填料，通常镍琼脂糖凝胶作用力最强，如果蛋白分子量大可以选择手臂长的填料，如镍NTA 琼脂糖凝胶，填料的好坏可以看填料的颜色，颜色越深那配基密度越高，作用力也相应要强。3 样品的 pH 过低或者沉淀导致不能吸附，所以样品和缓冲液的 pH 要尽量一致，避免沉淀，通常再偏碱性条件下吸附更好。3.难洗脱：如果穿透中目标蛋白明显减少，而洗脱又没有，取点填料加电泳缓冲液煮后离心跑电泳还是有目标蛋白，可以用更强的洗脱条件如500mM 咪唑，如果还不能洗脱，可以直接用 500mM 咪唑加到 6M 盐酸胍去洗脱。4.电泳杂带多：因为这种亲和毕竟特异性要差点，原因在蛋白中带组氨酸，色氨酸，半胱氨酸等很常见，特别是蛋白折叠会导致几个这样的氨基酸残基临近，这样也会使它们和镍柱的作用力增加，因此可以用不同浓度的咪唑阶段洗脱，此外在咪唑洗脱前增加一步 0.5M pH5 的醋酸缓冲液洗脱，在平衡缓冲液中添加 0.5%吐温或 Triton 可以避免因为疏水相互作用导致非特异吸附，这样可以电泳的杂带明显减少，但是如果用这样的方法还是杂带多，那就地回头去看看破碎的条件是不是太剧烈或者温度控制不好导致蛋白短裂或者分解导致一些蛋白片段带标签，或者因为样品长时间保存导致水解等，总之纯化的好坏决定于每一个步骤，不仅仅是纯化的问题。还有一个不容忽略的问题是有时候因为蛋白相互作用或者因为形成聚合体导致杂带增加，而由于疏水相互作用或者因为离子作用可以通过添加表面活性剂或者增加离子强度得到改善，对于因为形成聚合体的可以在缓冲液和样品中加 1-2mM 巯基乙醇避免，如果这样的情况下最好是选择镍 NTA 琼脂糖凝胶，因为它在还原剂下更稳定。三、影响 IMAC 纯化结果的因素 1.填料的种类：不同填料厂家的填料有差别，所以使用过程最好能得到厂家的技术支持，因为不同的厂家填料不同，此外蛋白纯化个性很强，没有哪一个填料是能适合所有带六个组氨酸标签蛋白的纯化，载量高和特异性好本身就是矛盾。2.填料的配基种类、密度、金属离子种类 填料最简单的判断是螯合好同样的金属离子，哪家产品的颜色越深就意味着和蛋白的作用力越强，适用范围越广，载量也越高，纯化的好坏关键看纯化的条件，仅有填料的特异性是不够的，同样配基密度下 IDA 填料的亲和力要比 NTA 的强，所以 NTA 上不能吸附的样品可以选择 IDA 为配基的填料。3.螯合金属离子和蛋白作用强弱为铜和镍离子的强，而锌和钴离子的弱。因此如果一个蛋白作用力强，想得到好的特异性可以选择螯合钴离子，它还有一个优点是不怕还原剂，特别时候有高浓度的还原剂。相同金属离子，IDA 的强于 NTA。螯合金属离子的价位越低和蛋白的作用力越强。同时镍离子是最常用的，如果有条件可以换不同金属离子以得到更好的效果，因为不同的金属离子有不同的选择性。因此要希望填料应用范围广就选择镍琼脂糖凝胶，如果是希望特异性好而且稳定就选择镍 NTA琼脂糖凝胶.
