欢迎来到淘文阁 - 分享文档赚钱的网站! | 帮助中心 好文档才是您的得力助手!
淘文阁 - 分享文档赚钱的网站
全部分类
  • 研究报告>
  • 管理文献>
  • 标准材料>
  • 技术资料>
  • 教育专区>
  • 应用文书>
  • 生活休闲>
  • 考试试题>
  • pptx模板>
  • 工商注册>
  • 期刊短文>
  • 图片设计>
  • ImageVerifierCode 换一换

    胰蛋白酶活性测定788.pdf

    • 资源ID:84193209       资源大小:863.79KB        全文页数:7页
    • 资源格式: PDF        下载积分:5金币
    快捷下载 游客一键下载
    会员登录下载
    微信登录下载
    三方登录下载: 微信开放平台登录   QQ登录  
    二维码
    微信扫一扫登录
    下载资源需要5金币
    邮箱/手机:
    温馨提示:
    快捷下载时,用户名和密码都是您填写的邮箱或者手机号,方便查询和重复下载(系统自动生成)。
    如填写123,账号就是123,密码也是123。
    支付方式: 支付宝    微信支付   
    验证码:   换一换

     
    账号:
    密码:
    验证码:   换一换
      忘记密码?
        
    友情提示
    2、PDF文件下载后,可能会被浏览器默认打开,此种情况可以点击浏览器菜单,保存网页到桌面,就可以正常下载了。
    3、本站不支持迅雷下载,请使用电脑自带的IE浏览器,或者360浏览器、谷歌浏览器下载即可。
    4、本站资源下载后的文档和图纸-无水印,预览文档经过压缩,下载后原文更清晰。
    5、试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓。

    胰蛋白酶活性测定788.pdf

    1 胰蛋白酶,pH 8.0 BAEE on6 t H I H 3 N)Nfc)i-ro k H=H H H=HSA N-owo-000 B/I+C2HQH 乙醇 实验一 胰蛋白酶活性测定 实验目的:掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。实验原理:胰蛋白酶相对分子量 23.7 KD,主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的 肽键,此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键,如把人工合成的 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(N-benzuyl-L-argine ethyl ester,BAEE)水解为 H-苯甲酰-L-精氨酸(BA)。胰蛋白酶所催化的上述反应中,产物BA对253 nm的光吸收远大于 BAEE,因此可以在实验起 始点把253 nm的消光值调为零,然后记录反应体系对 253 nm的消光值的增量,并把这个增量 作为测定胰蛋白酶的活性指标。酶活单位定义:在底物BAEE浓度1m mol/L,光程1 cm,波长253nm,温度25 C,测量体积 3mL,.条件下吸光值每分钟递增 0.001 C A/min=0.001)为1个BAEE酶活单位。胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义:胰蛋白酶含量一般 E1%表达。这个值的含义是:浓度为1%酶蛋白,在1cm光径下,对紫外280nm 的消光值。不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。E1%值越高,表明酶制剂中酶蛋白含量越 高。由于酶制剂中蛋白质含量各不相同,所以用酶制剂配制 E1%的蛋白质溶液时,按照厂家对产品 的E1%的测定值配制溶液。在本实验中,胰蛋白酶酶蛋白样品采用 SIGMA公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对 280nm紫外吸收值15.3,配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。器材以试剂:器材,电子天平,紫外分光光度计,微量加样器。试剂:标准胰蛋白酶,N-苯甲 酰-L-精氨酸乙酯,HCI,Tris。1.胰蛋白酶活性测定:1)配制E1%的胰蛋白酶溶液 每组取E1%=15.3的 胰蛋白酶样品10mg放到1ml去离子水中,充分溶解后,放入冰中保存。2 騰蛍白酶活力虽位(BAEE曲)031酶液加入体积(加1)稀释倍數 弋稀釋倍数 2)按照表1的要求配制试验体系所需其它各种溶液 3)按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。表1胰蛋白酶活性测定加样顺序 剂 步骤1:空白调零 步骤2:样品测定 0.1 mol/L Tris-HCI 缓冲液,pH 8.0,1.5 mL 1.5 mL 2.0 m mol/L BAEE 1.5 mL 1.5 mL 25C 预热 5min 25C 预热 5min 胰蛋白酶:10mg/mL 010 蒸馏水 10也 0 充分摇匀 充分摇匀 步骤 1:A253 nm/min 调 0 -步骤 2:=A253-nm/min -记录 在步骤2样品测定中,加入酶液后立即盖上盖迅速混匀计时,每半分钟读数一次,共读34min。测得的结果要使 A253nm/min控制在0.050.100之间为宜,若偏离此范围则要适当增减酶量(5 L-20之间,空白试验相应增减等体积水)后重新测定,一直到 AA253nm/min值落在0.05 0.100之间为止。3分别求算:1)标准胰蛋白酶溶液(浓度 10mg/mL)的酶活和比活:计算方法:i)胰蛋白酶活性单位数计算:ii)胰蛋白酶比活计算:(用BAEE单位数/mg胰蛋白酶表示比活)_ 酶液活力酣EE单位 泌)酶液蛋白含量吨 加:以酶液加入体积(沁)廡蛋白離出活力(2 单位 3 4-M(p-Nitroaniline,4-NA)呈黄色,实验二胰蛋白酶动力学测定 实验目的:初步掌握以下几个酶动力学参数测定与求算方法:米氏常数Km,最大反应速度 Vmax,转换数cat,特异性常数cat,/Km。实验原理:已知胰蛋白酶遵守米氏方程,可以通过测定底物浓度与反应速度间的关系测定与求 算这个酶的诸动力学参数。胰蛋白酶可以水解碱性氨基酸的羧基所生成的肽键、酰胺建和酯键。在本实验中,利用胰蛋白酶水解酰胺键活性的性质,以苯甲酰-L-精氨酰-对硝基苯胺(BAPA)作底物测定这个酶的动力学参数,反应式如下:反应最适pH8.1,最适温度25 C。反应产物之一:对硝基苯胺 对405nm波长光的摩尔吸光系数为 9870,但底物BAPA和另一个产物 BA对405nm波长的光 基本不吸收,因此本实验测定光波的波长设在 405nm 上,把起始反应的吸光值调为 0,记录消 光值的变化。L-BAPA最大浓度低于5 104mol/L时这个酶促反应符合米氏方程,可用Hanes作图法求动力学参 数。Hanes作图法是单倒数作图法,把米氏方程变形为:xS ax 在实验中设定一系列底物浓度 Si,测定每一个底物浓度条件下的反应速度 vi,然后用Si/仍 对 Si作图,可以得到一条线段,线段在 y轴的截距是 Km/Vmax,线段的延长线在 x轴的截距是-Km,据此可以得到 Km和 Vmax值;cat=Vmax/Et。Et是酶的初始浓度,已在实验设定 为已知,因此cat可以得出;特异性常数 Km/-cat可根据上述已知数计算出来。器材与试剂:4 器材:756紫外-可见分光光度计,恒温水浴锅,分析天平,秒表,容量瓶,移液器。试剂:1.O.1mol/L pH8.1 的 Tris-HCI 缓冲液(含 0.4%CaCI 2):取 0.2mol/L Tris(Mr=121.14)100mL 与0.2mol/L HCI 52.4mL 混匀,加入 0.8gCaCb,蒸馏水定容到 200mL(pH值需用计pH校正)。2.1mmoI/L DL-BAPA(Mr=434.9)水溶液:称取 43.49mg BAPA,蒸馏水溶解并加热到 80 C 以上,完全溶解后置冰水中冷却,定容到 100mL。这个浓度为1mmol/L的DL-BAPA溶液命名 为第六组母液,按照逐步稀释原则配制下列溶液浓度系列:0.8m mol/L(第五组母液,25mL);0.6m mol/L(25mL,第四组母液);0.4m mol/L(25mL,第三组母液);0.2 m mol/L(10 mL,第二组母液);0.1 m mol/L(10mL,第一组母液)。3.60%(V/V)乙酸溶液 4.胰蛋白酶溶液,该酶的比活 1.0 104 BAEE单位/mg蛋白 实验步骤:1.计算胰蛋白酶加样体积:在本实验中加入胰蛋白酶的量是 60乜,实验1已经测到胰蛋白酶的 比活和浓度(Mg/ML),根据这些值计算加入体系的酶液体积的 4L数。2.实验溶液系统:本实验有 6组实验组成。实验顺序按照表 2的加样程序执行。表2.测定Km和Vmax值加样表 组 BAPA 母液浓度(m mol/L)加入BAPA(mL)母液 加入 Tris-HCI(mL)加入 胰蛋白酶(丄)加入 60%乙酸(mL)反应体系底物 BAPA浓度(m mol/L)V A405 1.0.1 样品1,2.0 1.5 n 0.4 S10.05 对照1,2.0 1.6 0 0.4 2 0.2 样品2,2.0 1.5 n 0.4 S20.1 对照2,2.0 1.6 0 0.4 3 0.4 样品3,2.0 1.5 n 0.4 S3 0.2 对照3,2.0 1.6 0 0.4 4 0.6 样品4,2.0 1.5 n 0.4 S40.3 对照4,2.0 1.6 0 0.4 5 0.8 样品5,2.0 1.5 n 0.4 S50.4 对照5,2.0 1.6 0 0.4 5 6 1.0 样品6,2.0 1.5 n 0.4 S60.5 对照6,2.0 1.6 0 0.4 25 C保温5 min后,摇匀,秒表计时,准确反应 2min后加入0.4mL 60%的乙酸溶液,摇匀终 止反应。反应溶液总量应达到 4mL,不足部分可加蒸馏水补足。对照试管不加入胰蛋白酶,只加 入0.4mL 60%的乙酸溶液。最后分别记录样品和对照的 A405值,每组种两者的差值 厶A405代入6 v(mmol*L-S1)=A4O5“E 9870 x10 2 下式即可得到对应于Si的j 表2列出的是6个实验,鉴于目前实验室尚没有 12个枪头的加样,所以每一个实验都可独立进 行。需要特别注意:1)比活大于1.0 104 BAEE u/mg protein的胰蛋白酶制剂,纯度范围是 90%-100%,般可达 到95%-97%。在计算动力学参数时,如无特殊精确要求,可按照胰蛋白酶 100%的近似值计算。在本试验中,可根据浓度胰蛋白酶浓度 10mg/ml,纯度100%,每个试管要求加入质量数 60g,计算出每个试管加入的胰蛋白酶溶液微升数。2)在进行动力学参数计算时,要进行胰蛋白酶质量-摩尔数转换,如无特殊要求,也可以把胰 蛋白酶纯度近似为 100%.3)如果有求精确,但产品说明没有给出胰蛋白酶在固形物中的百分含量,就需配制一定浓度的 固形物溶液,首先测定蛋白质浓度,通过求算蛋白质总量,得到蛋白质在酶制剂中的重量比。然后通过双向电泳,图像扫描,把扫描结果输入计算软件,按照软件步骤,求算胰蛋白酶在全 部蛋白样品中的百分比。把实验设定的每一个Si和测定到的对应的 Vi换算成Si/Vi后,填入表3,作图求Km Vmax 表3.Hanes作图的数据 Si/v:Si/、.i S2/.2 S3/.3 S4/.4 S5/.5 S6/.6 Si:Si S2 S3 S4 S5 S6 用S/-.对S作图可得到一条线段,线段与轴的截距是 Km/Vmax,线段延长线与x轴的截距是 根据方程-Km,7 23,7 可以得到Km,Vmax 根据cat=Vmax/Et,求算cat 和 Km/-cat 注意:上式的酶浓度单位是 mol/L,已知酶浓度是10mg/ml,需要根据胰蛋白酶相对分子量 KD,纯度100%进行换算。实验完成后报告胰蛋白酶的动力参数:Km,Vmax,-cat,Km/cat

    注意事项

    本文(胰蛋白酶活性测定788.pdf)为本站会员(深夜****等你...)主动上传,淘文阁 - 分享文档赚钱的网站仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容本身不做任何修改或编辑。 若此文所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知淘文阁 - 分享文档赚钱的网站(点击联系客服),我们立即给予删除!

    温馨提示:如果因为网速或其他原因下载失败请重新下载,重复下载不扣分。




    关于淘文阁 - 版权申诉 - 用户使用规则 - 积分规则 - 联系我们

    本站为文档C TO C交易模式,本站只提供存储空间、用户上传的文档直接被用户下载,本站只是中间服务平台,本站所有文档下载所得的收益归上传人(含作者)所有。本站仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容本身不做任何修改或编辑。若文档所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知淘文阁网,我们立即给予删除!客服QQ:136780468 微信:18945177775 电话:18904686070

    工信部备案号:黑ICP备15003705号 © 2020-2023 www.taowenge.com 淘文阁 

    收起
    展开